人原发性肝癌中多种基因CpG岛甲基化研究进展

1概述在表观遗传学(epigenesis※)这个发展非常快的领域,DNA甲基化,组蛋白去乙酰化和RNA介导是基因沉默(silencing)的三大主要原因。在人类基因组DNA中,约3%～4%的胞嘧啶碱基以5甲基胞嘧啶形式存在,结果导致在人类正常组织细胞DNA中,5甲基胞嘧啶占所有核甘酸碱基的0.75%～1%。大约70%～80%的5甲基胞嘧啶存在于CpG序列中,CpG二核甘酸集中的区域称之为CpG岛,这部分通常是未甲基化,这些CpG岛跨过许多基因的5’末端———包括启动子,未翻译区和第一外显子。现在知道的哺乳类基因组中至少一半基因的启动子区存在CpG岛,其甲基化只发生在…     

人肠癌RKO细胞周期依赖性激抑制因子基因启动子区甲基化状态的研究

目的 探讨人结肠癌RKO细胞周期依赖性激酶抑制因子(CKIs)家族启动子区CpG岛甲基化状态及其甲基化可逆性特征.方法 应用特异性DNA甲基转移酶(DNMTs)抑制剂5-Aza-2]-deoxycytidine(5-Aza-CdR)处理肠癌细胞,甲基特异性聚合酶链反应(Methylation-Specific PCR,MSP)、T-A克隆及DNA测序法分析RKO细胞CKIs家族抑癌基因p15ink4b、p16ink4a/CDKN2、p21/cip、p27/kip启动子CpG岛甲基化状态.结果 未经5-Aza-CdR作用的肠癌RKO细胞,其p15ink4b、p16ink4a/CDKN2基因组DNA胞嘧啶(C)保持不变,这提示在其单链DNA中胞嘧啶呈甲基化状态;而经5-Aza-CdR作用的肠癌RKO细胞,其p15ink4b、p16ink4a/CDKN2、p21/cip和p27/kip基因组DNA胞嘧啶均已变为胸腺嘧啶,表明在DNA单链中胞嘧啶已呈去甲基化状态.结论 肠癌RKO细胞周期INK4家族(p15ink4b和p16ink4a/CDKN2)基因的启动子区处于异常的高甲基化状态,而KIP/CIP家族(p21/cip和p27/kip)基因未处于高甲基化状态;5-Aza-CdR能较好地逆转肿瘤细胞INK4家族基因DNA高甲基化状态.     

先天性小耳畸形全基因组甲基化谱的研究

目的 筛查先天性小耳畸形患者整个基因组存在甲基化水平异常的CpG岛和CpG位点及其相关差异基因,进而探讨基因甲基化水平的异常与先天性小耳畸形发病之间的关系.方法 收集2009年7月至2010年12月先天性小耳畸形患者术中废弃的残耳软骨组织为研究对象共50例(实验组),非耳畸形(耳外伤)患者的正常耳软骨组织34例作为对照.应用Nimblegen CpG启动子芯片,对实验组3例及对照组3例样本的基因组DNA进行全基因组28 226个CpG岛扫描,筛选存在CpG岛甲基化水平差异的基因;应用SpectroCHIP芯片对实验组47例,对照组31例的差异基因的CpG岛进行各个CpG位点的检测,筛选出存在甲基化水平差异的CpG位点.结果 实验组与对照组在全基因组范围内存在36个具有甲基化水平差异的CpG岛,其中有29个与已命名的29个基因相关.经t检验分析,在COL18A1、MYH14、RBMY1A1、ZIC3这4个差异基因的6个CpG位点,2组甲基化水平差异具有统计学意义(P＜0.05),实验组和对照组甲基化水平分别为:COL18A1_2_CpG_17 0.978 3±0.023 5、0.952 6±0.058 9;MYH14_CpG_17 0.960 0±0.041 4、0.928 4±0.0655;RBMY1A1_1_CpG_3.4 0.996 6±0.005 5、0.991 4±0.006 9;RBMY1A1_1_CpG_13 0.964 8±0.011 8、0.975 7±0.012 7;ZIC3_3_CpG_15 0.086 7±0.021 2、0.054 3±0.039 9; ZIC3_2_CpG_270.377 5±0.181 6、0.472 3±0.043 9.结论 初步建立了先天性小耳畸形甲基化谱,COL18A1、MYH14、RBMY1A1、ZIC3基因甲基化水平差异可能与小耳畸形的发病相关.     

肝细胞癌抑癌基因和癌基因甲基化水平的检测及意义

目的:探讨DNA甲基化异常在肝癌发展中的作用.方法:应用甲基敏感的限制性内切酶及Southern杂交技术对18例肝细胞癌抑癌基因Rb、17p13.3位点基因CpG岛和癌基因c-myc3′端散在CpG的甲基化状态进行了检测.结果:1例肝透明细胞癌和41.7%(5/12)肝细胞癌分别存在Rb基因和17p13.3位点基因CpG岛的高甲基化;而c-myc基因3′端散在形式的CpG岛的甲基在61%的肝癌发生不同程度的丢失,这种高和低甲基化状态可同时存在于同一病例.甲基化异常可发生在早期肝癌并随肿瘤进展而加重.结论:本实验结果表明:肝细胞癌存在严重的DNA甲基化紊乱,可能是抑癌基因失活和癌基因激活的重要因素.     

RASSF1A基因在肝癌中表达失活的研究

最新研究进展揭示，抑癌基因功能的抑制或失活，除了与基因片段的丢失，DNA序列的错位、缺失、重组、变换、点突变等机制相关外，还与DNA序列中CpG岛（CpG island）中胞嘧啶（C）碱基环上发生的甲基化（^mCpG）有极其重要的相关性。RASSF1A基因（RAS association domain family 1 Agene）这一由Dammann等发现并命名的基因，在原发性肝癌中的表达情况则未有报道。     

人精子DNA从头甲基化转移酶及甲基CpG结合蛋白的mRNA表达分析

目的 通过体外分离成熟的精子,利用实时荧光定量PCR(qRealTime-PCR)检测其是否表达DNA从头甲基化转移酶(DNMT1/3a/3b)及甲基CpG结合蛋白(MeCP2),为精子中甲基化表观修饰研究提供依据.方法 体外采集健康男性志愿者的精液标本,利用精子上游收集法获得具有活性的成熟精子.通过SYBR Green/PI双染色法,利用流式细胞术(FCM)检测精子样本的质膜完好性及其活性.抽提精子的总RNA,逆转录PCR获得cDNA,利用qRealTime-PCR鉴定精子甲基化转移酶及甲基CpG结合蛋白的mRNA表达情况.结果 SYBR Green/PI双染色和流式细胞仪检测发现,利用上游收集法可以收集SYBR Green /PI-的精子占总精子数的(94.513±1.120)%,表明该方法可以收集到质膜完好且活性强的精子.qRealTime-PCR结果显示,此样本精子中DNA从头甲基化转移酶的表达比较明显,而甲基CpG结合蛋白的表达量相当低.其中DNMT1的mRNA表达量较高(0.272±0.045,P＜0.05),DNMT3a和DNMT3b的表达水平比较弱[(4.930±0.01)E-006,(6.500±1.7)E-005,P＜0.05],而MeCP2几乎不表达[(2.12±0.91)E-006,p＜0.05].结论 利用qRealTime-PCR可以比较快速方便的检测出此次精子样本中DNA从头甲基化转移酶和甲基CpG结合蛋白的mRNA表达水平.     

结直肠癌DNA甲基化研究的现状

DNA胞嘧啶甲基化的改变包括基因组DNA低甲基化和基因启动子区域CpG岛过甲基化。我们曾经对肿瘤DNA甲基化作过较详细的综述[1] 。结直肠癌的DNA甲基化研究较深入 ,进展较快。现对近年来结直肠癌DNA甲基化的一些研究现状作一简介。1.结直肠癌基因组DNA低甲基化 :有研究表明 ,与正常结肠黏膜相比 ,结直肠癌基因组DNA低甲基化[2 ] 。低甲基化可引起癌基因如c myc活化 ,也可导致核型不稳定 ,参与肿瘤的发生。结肠息肉和侵袭性结肠癌的低甲基化程度无明显差别 ,似乎表明肿瘤低甲基化并未参与肿瘤的进展[3 ] 。但另一方面 ,在小鼠肠肿瘤…     

dsRNA介导的PTEN基因表达上调及其与启动子区甲基化的关系

目的 观察以启动子区非CpG岛序列为靶点的dsRNA促进PTEN基因的表达,并探讨RNAa现象对PTEN基因启动子区DNA甲基化的影响.方法 将与PTEN基因启动子区非CpG岛DNA序列互补的双链RNA分子(dsPTEN) 转染入A549和H292肺癌细胞中,采用real-time聚合酶链反应(PCR)检测PTEN的表达,筛选能够促进PTEN基因表达的有效dsRNA序列.通过甲基化特异性PCR(MSP)产物测序,检测dsRNA转染前后启动子区甲基化程度的变化.结果 经多条dsRNA分别转染肺癌细胞,证实针对PTEN基因-57到-38的序列(dsPTEN2-2)转染H292肺癌细胞后出现PTEN基因表达的明显上调,上调最高达5.1倍(与对照dsRNA比较,P<0.05),证实了RNAa现象的存在;使用5-Aza处理后的A549和H292细胞与空白组比较CpG点甲基化明显减少(5±3比10±4、6±3比9±3,P均<0.05),而转染PTEN2-2 dsRNA后的两个细胞株CpG点甲基化情况与未转染组比较无明显变化(9±2比10±4、9±3比9±3,P均>0.05).结论 dsRNA可以促进PTEN基因表达的上调,RNAa现象并不改变PTEN基因启动子区甲基化程度.

Abstract：

Objective To evaluate the phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten (PTEN) gene activation induced by double-standed RNA (dsRNA) in lung cancer cell line and its correlation with CpG island methylation in the promoter region. Methods Specific dsRNA complementary to the non-CpG island sequence in the promoter of PTEN gene was designed and transfected into H292 and A549 cell lines, and the expression of PTEN mRNA was determined by real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR). The methylation status of the CpG island in the promoter region was tested by DNA sequencing on the bisulfate modified DNA. Results By testing several dsRNA sequences targeting promoter region of PTEN, a dsRNA named PTEN2-2 (target on -57 to -38 of the PTEN) was identified, which could upregulate the PTEN expression by 5.1 times at most (P<0.05, controlled with the dsControl). Epigenetic analysis of PTEN promoter region confirmed DNA hypermethylation. PTEN2-2 dsRNA transfection turned on the expression of PTEN without affecting the methylation status of promoter DNA (9±2 vs 10±4, 9±3 vs 9±3, both P>0.05), as the DNA methyltransferase inhibitor did (5±3 vs 10±4, 6±3 vs 9±3, both P<0.05). Conclusion The expression of PTEN mRNA could be enhanced by inducing the dsRNA into the cells, but no evidence was found that dsRNA could affect the methylation status of the CpG island in the promoter region of this gene.     

肝癌患者E-cadherin基因启动子区CpG岛甲基化状态的研究

目的探讨抑癌基因E-cadherin基因启动子区CpG岛甲基化与人原发性肝癌(简称肝癌)发生、发展的关系,及其在肝癌早期诊断中的意义。方法用巢式甲基化特异性PCR对34例肝癌患者的癌组织、距离癌灶边缘>3 cm的远癌组织及10例未发生肝癌的肝硬变患者的肝硬变组织中E-cadherin基因启动子区CpG岛的甲基化状态进行检测。结果 E-cadherin基因启动子区CpG岛甲基化阳性率,在34例肝癌组织中为61.76%(21/34),明显高于远癌组织中的29.41%(10/34),P<0.05;在10例无肝癌的肝硬变组织中为50.00%(5/10),与肝癌组织和远癌组织比较差异均无统计学意义(P>0.05);在4例正常肝组织中均为甲基化阴性。联合检测癌组织E-cadherin基因CpG岛甲基化与血清甲胎蛋白两种分子标志物,肝癌的检出率可达82.35%。结论抑癌基因E-cadherin启动子区CpG岛甲基化可能在肝癌的发生、发展中起到重要作用,并且可能是早期事件,其在肝癌的临床诊断及治疗中的意义值得进一步深入研究。     

DNA甲基转移酶1、3b基因在肾癌的表达

肾细胞癌是我国泌尿系统常见的肿瘤之一.肿瘤的发生与抑癌基因的失活有关,研究发现,抑癌基因甲基化是其失活的重要机制之一.甲基化并不使基因序列发生改变,而是使抑癌基因转录失活,表达受抑制,导致肿瘤形成.DNA甲基化是由DNA甲基转移酶(Dnmt)催化,将胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶[1].人类Dnmt在CpG岛甲基化过程中至少有Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b参与[2,3].Dnmt1和Dnmt3b是DNA甲基化的关键酶,其表达直接影响着DNA甲基化状态[4].本研究采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Dnmt1、Dnmt3b mRNA在肾细胞癌组织及正常肾组织中的表达,并探讨其表达的临床意义.     

DNA甲基化修饰与肾脏疾病

表观遗传学(epigenetics)是研究不涉及DNA序列改变的基因表达和调控的可遗传修饰,即探索从基因演绎为表型的过程和机制的一门新兴学科.DNA的甲基化是调节基因表达的一种表观遗传方式[1].DNA甲基化因其与人类发育和肿瘤的密切关系,已经成为表观遗传学的重要研究内容.所谓DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMT)作用下,将s-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine,SAM)的甲基基团共价结合到CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位上的过程.     

肝细胞癌的CpG岛甲基化表型研究进展

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一.目前,已在人类多种恶性肿瘤中发现了以多个基因同时甲基化为特征的CpG岛甲基化表型(CpG island methylator phenotype,CIMP)的存在.CIMP对肝癌的发生、发展、转移、复发等过程具有重要作用.检测肝癌相关基因的甲基化状态可以为肝癌的早期诊断、肝癌分型,预测肝癌复发、转移和预后判断提供非常有价值的信息.     

外周血Runx3基因CpG岛甲基化在结肠癌病情及预后评估中的价值

目的:研究外周血Runx3基因CpG岛甲基化在结肠癌病情及预后评估中的价值。方法:选择结肠癌患者(观察组)和正常人(对照组)为研究对象,检测两组外周血Runx3基因CpG岛甲基化,分析结肠癌患者不同临床病理因素外周血Runx3基因CpG岛甲基化的差异,比较外周血Runx3基因CpG岛甲基化与未甲基化患者5年生存率及总生存时间的差异。结果:观察组外周血Runx3基因CpG岛甲基化率显著高于对照组(P<0.05)。观察组结肠癌低/中分化、肿瘤最大径≥6 cm、有淋巴结转移、有远处转移、Ⅲ/Ⅳ期和非根治性手术患者Runx3基因CpG岛甲基化率显著高于高分化、肿瘤最大径<6 cm、无淋巴结转移、无远处转移、Ⅰ/Ⅱ期和根治性手术患者(P<0.05)。观察组结肠癌患者Runx3基因CpG岛甲基化患者3年生存率及总生存时间均显著低于未甲基化患者(P<0.05)。结论:结肠癌患者外周血Runx3基因CpG岛处于高甲基化状态,在结肠癌病情及预后评估中具有重要价值。     

抑癌基因异常甲基化与肿瘤发病的关系

抑癌基因失活存在于多种肿瘤中，5′CpG岛高甲基化导致抑癌蛋白表达的减少与肿瘤发者率密切相关。本文总结了抑癌基因5′CpG岛高甲基化的形成机制、在人类肿瘤中的发生率及相应的治疗对策。     

凋亡蛋白酶活化因子-1基因甲基化在骨肉瘤细胞株中的作用

目的 检测骨肉瘤细胞株中凋亡蛋白酶活化因子(APAF)-1基因启动子区域甲基化状态及该基因mRNA表达,观察APAF-1基因对骨肉瘤形成的影响.方法 以骨肉瘤细胞株MG63和Hs888T为研究对象,提取DNA,经重亚硫酸钠处理后,采用限制性酶切图谱分析(COBRA)检测APAF-1基因CpG岛的甲基化情况,使用不同浓度(0、1×10~(-7)、3×10~(-7)mol/L)的DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理骨肉瘤细胞株4、10、20d,采用实时定量聚合酶链反应(QT-PCR)检测Apaf-1 mRNA表达水平的变化.结果 在Hs888T细胞株中APAF-1基因存在CpG岛甲基化并且随着5-Aza-CdR浓度的增加Apaf-1 mRNA表达水平也在增加.3×10~(-7)mol/L的5-Aza-CdR处理Hs888T细胞株20 d与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 Hs888T细胞株中APAF-1基因异常表达与APAF-1基因启动子区域CpG岛甲基化有关,提示APAF-1基因甲基化可能参与某些骨肉瘤的发生.     

乳腺癌WWOX基因表达缺陷的意义及其与CpG岛甲基化的关系

目的 研究WWOX蛋白在乳腺癌组织和细胞系中的表达变化,分析其与WWOX基因启动子和第一外显子CpG岛甲基化的关系.方法 应用免疫组织化学染色检测乳腺癌组织和细胞系中WWOX蛋白表达,采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)分析乳腺癌组织和细胞系中WWOX基因CpG岛甲基化状况.结果 32.2%的乳腺癌组织和5.4%正常乳腺组织中WWOX蛋白表达缺失,差异有统计学意义(P＜0.01).乳腺癌组织WWOX表达异常与绝经后状态(P＜0.01)关系密切.Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者中WWOX蛋白表达缺失的比例分别为23.1%、28.6%和46.2%.55%的乳腺癌组织WWOX启动子CpG岛甲基化扩增,45%的乳腺癌组织WWOX第一外显子CpG岛甲基化扩增,癌旁组织中未出现CpG岛甲基化扩增.MDA-MB-231细胞WWOX基因CpG岛完全甲基化,而MCF-7细胞无甲基化产物扩增.结论 乳腺癌中广泛存在着WWOX基因CpG岛甲基化,是WWOX表达缺陷的重要机制,并且可能通过性激素受体信号途径在乳腺癌的发生、发展中发挥作用.     

肝癌细胞NFAT2基因启动子区甲基化与其mRNA表达的关系

目的:探讨肝癌细胞中NFAT2基因启动子CpG岛甲基化状态及与其mRNA表达的关系。方法:用重硫酸盐测序法检测肝癌组织与癌旁组织及不同肝细胞系与正常肝细胞中NFAT2启动子甲基化状态,用qRT-PCR检测肝癌组织与癌旁组织NFAT2 mRNA表达,并分析肝癌组织NFAT2启动子甲基化与mRNA水平的相关性。结果:肝癌组织中NFAT2基因CpG岛甲基化率明显高于癌旁组织(33.0%vs.21.6%,P=0.003);人肝癌细胞系HuH7、HepG2、Hep3B中NFAT2基因CpG岛甲基化率分别为34.8%、40.4%、37.0%,均明显高于人正常肝细胞系L02中NFAT2基因CpG岛甲基化率(16.2%)(均P0.05)。肝癌组织NFAT2 mRNA相对表达量明显低于与癌旁组织(0.000 602 4 vs.0.001 469,P0.05),肝癌组织中NFAT2 mRNA水平与其启动子甲基化程度呈明显负相关(r=-0.661,P=0.027)。结论:肝癌细胞中NFAT2基因表达下调可能与其启动子区CpG岛高甲基化状态有关     

肿瘤表观遗传研究的现状与展望

表观遗传是指在不改变DNA碱基序列的情况下DNA碱基及DNA所缠绕的组蛋白的共价修饰在细胞分裂过程中的可遗传性。20多年前人们发现在肿瘤细胞及组织中存在异常的DNA甲基化并由此引起很多抑瘤基因的失活，DNA甲基化被认为是一种很有希望的瘤标和治疗肿瘤的切入点。近十年来，大量的文献报道了几乎所有肿瘤中存在这样的甲基化异常及其所关联的抑瘤基因失活。     

DNA甲基化与前列腺癌

DNA甲基化是恶性肿瘤普遍存在的分子生物学改变，与肿瘤的发生和发展密切相关。前列腺癌中存在多种基因的甲基化，涉及到DNA损伤修复、激素应答、肿瘤细胞入侵／转移、细胞周期调控等通路。前列腺癌前病变如前列腺上皮内瘤也存在DNA甲基化，但程度相对较低。DNA甲基化的研究为前列腺癌的早期诊断、预后评估及激素非依赖性前列腺癌的治疗提供了新的途径。     

DNA甲基转移酶的作用及甲基化在肿瘤发生中的作用

表遗传学(epigenetics)调节与肿瘤相关基因的转录调控密切相关.DNA甲基化就是基因表遗传学调节的重要机制之一.DNA异常甲基化与肿瘤的发生和演进关系密切,而DNA甲基化是由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)催化发生并维持的.因此,深入研究DNA甲基转移酶的作用对认识异常甲基化的发生以及异常甲基化在肿瘤的发生和演变中的作用有着重要意义.