重组多价人精子表位肽的原核表达及其条件优化

目的构建重组多价人精子表位肽原核表达质粒,优化其在大肠杆菌中的表达条件。方法用化学合成法合成多价人精子表位肽基因。该基因经PCR扩增,BamHI和XhoI双酶切后,克隆至GST融合表达载体PGEX-4T-1获得重组质粒。将该重组质粒转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统,观察在摇瓶发酵条件下改变培养基组成、诱导温度、诱导时机、诱导剂浓度和诱导时间等条件对GST-多价人精子表位肽融合蛋白表达量的影响。结果构建了重组多价人精子表位肽原核表达载体。在摇瓶实验中,优化的表达条件为:TB培养基,诱导温度37℃,在菌体对数生长的中后期进行诱导,IPTG诱导终浓度0.05 mmol/L,诱导时间5 h。优化后GST-多价人精子表位肽融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的30.2%,且主要以可溶形式表达。结论成功构建重组多价人精子表位肽原核表达质粒,重组表达载体在E.coli BL21(DE3)内主要表达可溶形式的GST-多价人精子表位肽融合蛋白,在优化条件下可获得较高的表达量。     

蛋白磷酸酶LY1基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的构建蛋白磷酸酶LY1基因的原核表达载体,并在E.coliBL21（DE3）中表达。方法PCR扩增LY1的CDs基因片段,并将其克隆入原核表达载体pET28a（＋）中构建重组质粒pET28a（＋）-LY1。经限制性内切酶Nhe I、XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。SDS-PAGE、Western blot方法检测重组蛋白的表达。结果获得全长为1179bp的LY1基因片段,以构建的重组质粒pET28a（＋）-LY1转化E.coliBL21（DE3）后,经IPTG诱导,表达出分子量约为42kD的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coliBL21（DE3）的胞质中。Western blot方法检测出LY1融合蛋白的表达。结论成功构建了原核表达载体pET28a（＋）-LY1,并表达出重组LY1蛋白,为进一步单克隆抗体的制备和生物信号转导的相关研究奠定了实验基础。     

结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP-10的原核表达

目的 构建结核分枝杆菌(MTB)早期分泌蛋白CFP-10原核表达载体并进行诱导表达.方法 通过PCR技术从结核分枝杆菌H37 Rv基因组中扩增出lhp基因片段,目的基因片段克隆至表达载体pET-32a(+),构建pET-32a-CFP-10重组表达质粒,将其转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达.结果 成功地构建原核表达载体pET-32a-CFP-10,以重组体转化E.coli BL21(DE3),成功进行诱导表达.结论 成功构建CFP10的原核表达质粒,高效表达目的蛋白CFP-10,为进一步研究其免疫学功能奠定了基础.     

MAGE-A4重组蛋白的原核表达与纯化

目的 构建MAGE-A4的原核表达质粒并表达纯化相应蛋白,为恶性肿瘤的早期诊断和基因治疗疫苗的研制奠定基础.方法 根据目的基因序列合成目的基因并与原核表达载体连接,以构建原核表达质粒pET30a(+)/MAGE-A4,将酶切鉴定及测序正确的重组质粒转入E.coli BL21,经IPTG诱导表达并行可溶性分析,Western Blot鉴定重组蛋白特异性后,通过亲和层析法纯化重组蛋白.结果 成功构建pET30a (+)/MAGE-A4原核表达质粒,诱导表达得到重组蛋白MAGE-A4,主要以可溶性形式表达,纯化后获得纯度较高的蛋白.结论 成功构建pET30a(+)/MAGE-A4原核表达质粒并表达纯化出具有生物学活性的重组蛋白MAGE-A4.     

A型流感病毒NP基因的克隆表达与鉴定

目的 构建人A型流感病毒NP基因原核重组表达载体并在E.coli BL21(DE3)中表达.方法 从流感患者咽分泌物中提取总RNA,设计特异性引物,经RT-PCR得到NP基因开放阅读框cDNA后定向克隆到原核表达载体pET28b(+),构建含目的 基因的pET28b(+)-NP重组质粒,经酶切、PCR和测序正确后转化E.coli BL21(DE3),0.1mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 ①成功构建了pET28b(+)-NP重组质粒;②在E.coli BL21(DE3)中表达了一分子量约55 kDa的融合蛋白,经Western blot鉴定正确.结论 重组质粒pET 28b(+)-NP构建成功并在E.coli BL21(DE3)中高效表达了人A型流感病毒NP蛋白,为后续该蛋白的功能研究奠定了基础.     

结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶-GST融合蛋白表达载体构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建结核分枝杆菌pncA基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应技术扩增目的基因片段;通过pGEX4T-1构建表达载体pGEX4T-pncA,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌DH10b,再经IPTG诱导表达谷胱甘肽S转移酶(GST)-吡嗪酰胺酶融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白。结果扩增出了结核分枝杆菌pncA基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX4T-pncA,转化大肠杆菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物。结论构建了质粒载体,并诱导表达了GST-吡嗪酰胺酶融合蛋白,为进一步研究吡嗪酰胺耐药性奠定了基础。     

B组轮状病毒WH-2株vp7基因的原核表达与抗体的制备

目的：在大肠杆菌中表达人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白并制备其兔抗血清。方法：根据B组轮状病毒（GBRV）WH-2株vp7基因的全序列设计引物,用PCR的方法扩增得到vp7基因的编码区。将其克隆到原核GST融合表达载体pGEX-KG内,转化大肠杆菌E.coliDH5α,IPTG诱导表达人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白,经SDS-PAGE分离纯化表达的蛋白免疫新西兰兔,制备人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白抗血清。结果：经鉴定确认,vp7基因以正确的方式插入到载体中,此重组表达载体经IPTG诱导后,可表达相对分子量为53.4 kDa的GST-VP7融合蛋白。制备的抗血清经同样诱导表达的表达载体pGEX-KG表达产物吸收后1：500倍稀释后用Western Blot分析,与53.4 kDa的GST-VP7融合蛋白获得特异性显色信号。结论：人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白成功在大肠杆菌中GST融合表达,所表达的蛋白和制备的抗体不但为研究结构与功能提供了物质基础,也为GBRV所引起的疾病预防、诊断和治疗等流行病学研究和临床诊断奠定了基础,具有重要实际应用价值。     

人ZP3融合蛋白的原核表达

目的:在原核中表达人卵透明带蛋白3(zone pelluc ida,ZP3)。方法:将人ZP3基因的核心片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后,用重组质粒转化大肠杆菌BL21,并经丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-ZP3融合蛋白。结果:重组菌株明显诱导表达出预期分子质量为63 000 D的融合蛋白。结论:成功地构建GST-ZP3融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中表达GST-ZP3融合蛋白,为进一步开展免疫避孕与生殖免疫的研究奠定基础。     

人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及原核表达

目的 构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因的重组质粒，进行原核表达。方法 以Hela细胞的总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段，构建含有目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆，经异丙基-B-D半乳糖苷酶(IPTG)诱导重组质粒菌表达sTNFR1，以淀粉树脂亲和层析法纯化重组蛋白，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对重组蛋白进行分析。结果经核苷酸序列测序和sDS—PAGE法鉴定，成功构建了人sTNFR1重组质粒基因工程菌，并表达和纯化了sTNFR-MBP融合蛋白。结论成功地构建了人sTNFR1重组质粒克隆，表达并纯化了sTNFR1-MBP融合蛋白。     

刚地弓形虫活化蛋白激酶C受体1基因的克隆和原核表达及纯化和抗原性分析

目的 克隆刚地弓形虫活化蛋白激酶C受体1(TgRACK1)基因,原核表达、纯化TgRACK1,并分析其抗原性.方法 制备弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgRACK1基因全长编码序列(GenBank登录号:AY547291)的开放阅读框设计引物并进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增,扩增产物经双酶切后连接入pGEX-6p-1载体,重组质粒转化大肠埃希菌DH5α,阳性菌落经菌液PCR、双酶切及DNA测序进行鉴定.将重组质粒pGEX-6p-1-TgRACK1转化至大肠埃希菌BL21(DE3)并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物;分别以抗GST标签抗体和兔抗弓形虫血清为一抗,免疫印迹(Western blotting)分析鉴定重组蛋白及其抗原性.重组融合蛋白经GST琼脂糖凝胶亲和纯化,纯化蛋白经SDS-PAGE分离,考马斯亮蓝染色结合凝胶成像系统分析其纯度.结果 RT-PCR扩增产物约为970 bp,重组质粒pGEX-6p-1-TgRACK1构建成功.经IPTG诱导获得相对分子质量约63 kDa的可溶性重组蛋白.诱导表达的蛋白质为带GST标签的重组融合蛋白,且能被兔抗弓形虫血清识别.亲和纯化后获得纯度大于95％的重组TgRACK1蛋白质.结论 克隆得到弓形虫活化蛋白激酶C受体1基因,原核表达并纯化出该基因编码的蛋白质,且该重组蛋白具有抗原性.     

人细胞间黏附分子1cDNA的克隆及表达载体的构建

目的 构建人细胞间黏附分子-1真核表达重组体pcDNA3．1hisB-ICAM-1。方法 设计、合成ICAM-1基因序列特异性引物，从肝癌组织中提取总RNA，以此为模板经RT-CR扩增人ICAM-1的cDNA片段；然后将其克隆到pGEM-T Easy Vector，构建中介重组体(pGEM-ICAM-1)，再克隆，构建真核表达重组体pcDNA3．1HisB-ICAM-1，经菌落PCR和限制性酶切有目的片段出现，进行DNA序列分析。结果 RT-PER扩增得到人成熟ICAM-1的cDNA片段大小为1622bp，中介重组体(pGEM-ICAM-1)，酶切后与真核表达载体连接，根据酶切鉴定和DNA序列分析得到真核表达重组体pcDNA3.1HisB-ICAM-1；结论：成功构建了真核表达重组体pcDNA3．1HisB-ICAM-1。     

寨卡病毒非结构蛋白1的真核表达纯化和免疫反应性鉴定

目的 在HEK293F细胞中表达寨卡病毒(Zika Virus,ZKV)的非结构蛋白1(Nonstructural Protein 1,NS1),并分离纯化得到重组ZKNS1以及验证其免疫反应性。方法 根据GenBank中的ZKNS1序列合成基因,在基因上下游分别引入信号肽和组氨酸标签,通过NotI和XbaI双酶切将基因克隆至pcDNA31(+)载体;将重组载体转染HEK293F细胞,重组蛋白用镍亲和柱层析纯化;免疫印迹法(Western blot)鉴定重组ZKNS1与寨卡病毒阳性人血清的免疫反应性。结果 成功构建了ZKNS1的真核表达载体pcDNA31(+)-ZKNS1;在HEK293F细胞中重组ZKNS1以分泌形式表达于细胞培养上清中,经纯化后获得了纯度较高的分子量约为46kDa的重组蛋白;Western blot结果显示重组ZKNS1与寨卡病毒阳性人血清能发生特异性结合。结论 成功构建ZKNS1的真核表达载体,获得了免疫反应性较高的纯化的重组ZKNS1,为进一步建立ELISA检测方法及制备单克隆抗体奠定了基础。     

单纯疱疹病毒1型糖蛋白G表达载体的构建及鉴定

[目的]构建gG-1强抗原决定簇集中区对应基因的重组原核表达载体,并对其进行鉴定。[方法]利用DNAstar软件分析gG-1强抗原决定簇的集中区,PCR扩增相应基因片段,将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-4T-1/gG-1,并对其进行双酶切和DNA测序鉴定。[结果]成功构建了pGEX-4T-1/gG-1重组原核表达载体,且目的基因片段与GenBank中已公布序列一致性较高,阅读框架正确。[结论]pGEX-4T-1/gG-1重组原核表达载体的成功构建,为研制HSV-1型特异性基因工程诊断试剂奠定了基础。     

pEGFP-C3/Tsarg1融合蛋白在GC-1 spg细胞中的表达与定位

目的构建pEGFP-C3/Tsarg1真核表达载体并在GC-1spg细胞中表达,为研究Tsarg1在生精过程中的机制提供实验基础。方法应用RT-PCR从大鼠睾丸中扩增Tsarg1的开放阅读框(ORF),并将PCR产物插入到T载体中测序验证。随后,将Tsarg1cDNA片段亚克隆入载体pEGFP-C3,筛选阳性克隆,构建pEGFP-C3/Tsarg1真核表达载体。脂质体介导重组体pEGFP-C3/Tsarg1转染GC-1spg细胞,荧光显微镜观察融合蛋白在细胞内的表达与定位。结果成功构建了pEGFP-C3/Tsarg1真核表达质粒,EGFP-Tsarg1融合蛋白能够在GC-1spg细胞中表达,Tsarg1蛋白定位于细胞胞浆。结论 pEGFP-C3/Tsarg1真核表达载体的成功构建及带GFP标签的Tsarg1融合蛋白在GC-1spg细胞中的成功表达为进一步研究Tsarg1的生物学功能奠定了基础。     

Development of oral CTL vaccine using a CTP-integrated Sabin 1 poliovirus-based vector system

We developed a CTL vaccine vector by modification of the RPS-Vax system, a mucosal vaccine vector derived from a poliovirus Sabin 1 strain, and generated an oral CTL vaccine against HIV-1. A DNA fragment encoding a cytoplasmic transduction peptide (CTP) was integrated into the RPS-Vax system to generate RPS-CTP, a CTL vaccine vector. An HIV-1 p24 cDNA fragment was introduced into the RPS-CTP vector system and a recombinant poliovirus (rec-PV) named vRPS-CTP/p24 was produced. vRPS-CTP/p24 was genetically stable and efficiently induced Th1 immunity and p24-specific CTLs in immunized poliovirus receptor-transgenic (PVR-Tg) mice. In challenge experiments, PVR-Tg mice that were pre-immunized orally with vRPS-CTP/p24 were resistant to challenge with a lethal dose of p24-expressing recombinant vaccinia virus (rMVA-p24). These results suggested that the RPS-CTP vector system had potential for developing oral CTL vaccines against infectious diseases.     

表达人JNK基因重组腺病毒的构建和鉴定

目的 制备表达人c-jun氨基末端激酶(JNK)复制缺陷型重组腺病毒.方法 将重组穿梭载体pAdTrack-CMV-WT-JNK线性化后,与pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5138,进行同源重组得到重组腺病毒载体.将重组腺病毒载体转染入包装细胞HEK293内制备复制缺陷型重组腺病毒,并经PCR及DNA测序鉴定.结果 JNK重组腺病毒载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,5 d后可以观察到绿色荧光蛋白(GFP)明显表达,搜集的病毒经过PCR扩增得到特定JNK基因片段并测序鉴定.动物实验证实构建的Ad-WT-JNK能有效在肝组织表达.结论 该研究成功构建了JNK重组腺病毒载体及相应重组腺病毒颗粒,为进一步研究JNK的作用及应用JNK进行相关疾病的基因治疗奠定了基础.     

人α-防御素-1基因与J链基因的融合及其表达载体的构建

目的本研究旨在将α-防御素-1(HNP-1)基因与J链基因进行融合使其成为融合基因J-HNP-1。方法从pCH-J质粒中扩增出J链;从pBabeNeo-HNP-1质粒中扩增出HNP-1;然后以它们的自身产物为模板,进行重组PCR,获取J-HNP-1 DNA片段,并插入编码双重报告基因Myc和6个多聚组氨酸(His)的哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-HisC中,构建出C端带Myc和6×His的rpcDNA3.1(-)/Myc-HisC/J-HNP-1。结果经过重组得到的融合基因J-HNP-1的目的片段为786 bp,与预测相符。结论杀菌分子J-HNP-1的重组和哺乳动物细胞表达载体的构建,为进一步进行抗菌肽的研究及制备奠定了基础。     

人畸胎瘤衍化生长因子原核表达载体的构建及表达

目的:构建人畸胎瘤衍化生长因子(teratocarcinoma-derived growth factor-1,TDGF-1)原核表达载体,进一步探讨其生物学作用及机制。方法:从人肝癌细胞系HepG2中提取总RNA,利用TDGF-1特异性引物通过RT-PCR方法扩增TDGF-1 cDNA,克隆入pHB载体中,构建重组载体pHB-TDGF-1。将重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,并通过SDS-PAGE及免疫印迹法对表达产物进行鉴定。结果:酶切及测序结果显示,重组质粒构建成功;SDS-PAGE及免疫印迹结果显示,所构建的重组载体可在大肠杆菌中高效表达TDGF-1。结论:该研究成功构建了人TDGF-1原核表达载体,并能够在大肠杆菌中有效表达TDGF-1,为进一步研究TDGF-1的生物学功能及其机制奠定了基础。     

H5N1禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因在杆状病毒中的共表达

目的构建共表达H5N1禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白的杆状病毒表达系统。方法利用PCR方法分别扩增A/Hubei/1/2010(H5N1)病毒的HA和NA基因,克隆至经改造带有对虾白斑综合病毒(WSSV)早期启动子iel的mpFastBac Dual载体,构建mpFast Bac-HA-NA表达质粒,转化DH10Bac感受态细胞,用获得的Bacmid-HA-NA穿梭质粒转染sf9细胞,获得重组杆状病毒Bac-HA-NA;提取重组杆状病毒Bac-HA-NA的DNA并使用PCR方法检测;利用Western blot检测HA和NA表达,并分别检测重组杆状病毒Bac-HA-NA红细胞凝集能力和神经氨酸酶活性。结果经PCR鉴定,构建的质粒Bacmid-HA-NA正确;Western blot检测表明Bacmid-HANA能在sf9细胞中有效表达HA和NA蛋白,生物活性检测表明Bac-HA-NA能引起红细胞凝集并具有神经氨酸酶活性。结论获得了能同时表达禽流感病毒HA和NA的重组杆状病毒Bac-HA-NA,为进一步研究流感疫苗奠定了基础。