重组人sCR1多克隆抗体制备及纯化鉴定

目的制备原核表达人sCR1多克隆抗体并对其进行鉴定。方法提取人总RNA进行RT-PCR扩增合成cDNA,以cDNA为模板,构建重组表达质粒pET28a-sCR1。在大肠杆菌中表达人sCR1融合蛋白作为免疫原制备兔多抗。采用ELISA法检测抗体效价,免疫亲和层析法纯化后,进行SDS-PAGE鉴定分析。结果sCR1表达融合蛋白免疫家兔制备的兔抗人sCR1多克隆抗体,可特异地识别人sCR1融合蛋白。结论纯化复性后的sCR1融合蛋白作为抗原免疫家兔,有较好的抗原性和免疫原性,成功地制备出兔抗人sCR1多克隆抗体,并有较高的效价及特异性。为进一步大量表达纯化及临床免疫学检测方法的键立奠定了基础。     

抗α1-抗胰蛋白酶多克隆抗体的制备、纯化和鉴定

目的 用α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT)免疫家兔以产生多克隆抗体,并对产生的抗体进行有效地纯化和效价鉴定,建立抗α1-AT多克隆抗体的生产工艺.方法 按照常规方法免疫健康家兔进行抗α1-AT多克隆抗体的制备,用ELISA检测血清抗体效价.处死抗血清效价合格的家兔,取血、离心,获取抗血清.联合应用辛酸-硫酸铵沉淀法和A蛋白亲和层析法对抗血清进行纯化,纯化的多克隆抗体经15%十二烷基硫酸钠.聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯度后,用ELISA测定效价.结果 ELISA检测表明,家兔产生的抗α1-AT多克隆抗体效价大于105.联合应用辛酸-硫酸铵沉淀法和A蛋白亲和层析法进行纯化获得了纯度高、活性好的抗α1-ATT多克隆抗体.结论 成功建立了抗α1-AT多克隆抗体的生产和纯化工艺.     

心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)原核表达、纯化及多克隆抗体制备研究

目的构建H-FABP高效原核表达载体,并实现H-FABP的高效原核表达、纯化及多克隆抗体的制备。方法通过RT-PCR扩增人H-FABP的基因序列,将目的基因克隆入质粒pET28a构建原核表达重组质粒pET28a-H-FABP。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导H-FABP的表达,采用Q Sepharose F.F.阴离子层析柱等方法建立H-FABP的纯化工艺。用免疫胶体金法和Western blot鉴定纯化后重组蛋白免疫特异性,用重组表达蛋白制备兔抗H-FABP多克隆抗体。结果成功构建人H-FABP重组蛋白原核表达载体,重组蛋白以包涵体形式表达,其相对分子质量为15kD,与预期一致。亲和层析纯化产物的SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明获得纯度>95%的目的重组蛋白。制备的抗H-FABP多克隆抗体的抗血清ELISA效价可达1∶512000。结论本研究在原核系统中成功表达了H-FABP重组蛋白,并制备多克隆抗体,为H-FABP的结构和功能研究及开发临床诊断试剂盒打下了基础。     

重组人转化生长因子β1原核表达及多克隆抗体制备

目的克隆人转化生长因子β1(TGF-β1)基因,原核表达TGF-β1蛋白,制备兔抗人TGF-β1多克隆抗体。方法应用RT-PCR技术扩增人TGF-β1基因序列,构建pET-28a-TGF-β1重组质粒。转化至E.coli BL21(DE3)中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达。Western-blot检测目的蛋白的抗原性。免疫新西兰白兔,获得兔抗人TGF-β1多克隆抗血清。饱和硫酸铵盐析法纯化多克隆抗体,间接ELISA法检测多克隆抗体效价,Western-blot技术进行抗体特异性检测。结果获得了TGF-β1编码序列和表达载体,目的蛋白主要存在于超声破碎后的包涵体中;经Western-blot检测目的蛋白存在抗原性;获得纯化的兔抗人多克隆抗体效价达1∶10 000。结论获得的兔抗人TGF-β1多克隆抗体效价较高,具有良好的特异性。     

一组miRNA/RNAi通路中关键蛋白-Argonaute系列多克隆抗体制备、鉴定及组织定位初步研究

目的制备一系列Argonaute（AGO）蛋白多克隆抗体,并鉴定其特异性及其在人类正常及肿瘤组织中的分布。方法合成特异性AGO多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白（KLH）作为载体构建多肽免疫原,致敏大白兔,制备系列兔抗人AGO多克隆抗体,然后用亲和层析法纯化抗体。用ELISA和Western方法进行抗体验证,并应用人组织芯片进行AGO的免疫组化研究。结果笔者制备了8个兔抗人AGO蛋白多克隆抗体,经ELISA及Western blot证实兔抗人AGO抗体可特异性识别AGO多肽,在人组织芯片中通过免疫组化染色显示该抗体在大多数正常及肿瘤组织上皮来源细胞胞浆中呈阳性染色,其中Piwils抗体还可使星状胶质细胞瘤、脑脊膜瘤及胃癌癌细胞染色。结论本项研究成功制备系列兔抗人AGO多克隆抗体,为进一步研究AGO在miRNA/RNAi通路中的作用及在人类疾病中的意义提供了有利工具。     

Ⅳ型胶原多克隆抗体的制备及性质研究

目的通过免疫母鸡制备抗人Ⅳ型胶原多克隆抗体（IgY）,为检测人血清Ⅳ型胶原含量提供IgY。方法采用人胎盘来源的Ⅳ型胶原蛋白作为抗原,免疫Leghorn母鸡,采用PEG方法分离纯化鸡卵黄中的抗体,获得抗体粗提物。经SephadexG100凝胶过滤制备多克隆抗体纯品。使用SDS—PAGE、免疫琼脂双向扩散等方法对提取物的含量、纯度及特异性进行鉴定。结果电泳结果显示,抗体粗提物纯度为81％。抗体纯品仅在70kd和25kd处各有一条带,纯度达到96％;免疫琼脂双向扩散实验结果显示,抗体纯品、粗品及免疫三周后鸡血清均与中心孔的抗原形成抗原抗体复合物的乳白色沉淀线。结论本研究分离纯化方法制备的抗Ⅳ型胶原IgY,具有抗体纯度高、特异性强等特点,为多克隆抗体广泛应用奠定了基础。     

以CpG为佐剂的人IL-24多克隆抗体的制备

目的：采用在原核表达系统表达的人IL-24蛋白及人IL-24真核重组质粒免疫新西兰兔，制备兔抗人IL-24多克隆抗体。方法：利用IPTG诱导hIL-24在大肠杆菌中表达，纯化hIL-24重组蛋白，纯化后的蛋白经SDS—PAGE分析，同时提取hIL-24真核重组质粒，用以免疫新西兰兔，并以CpG为佐剂制备多克隆抗体。Western-blot鉴定抗体的特异性，ELISA法测定抗体效价。结果：人IL-24经IPTG诱导后可在大肠杆菌中大量表达，表达量占细菌总蛋白的30％，纯化后的蛋白纯度高；原核表达的重组蛋白和真核重组质粒免疫新西兰兔，通过抗体效价测定，获得了抗血清效价达1：640的多克隆抗体。结论：原核表达的hIL-24蛋白和hIL-24真核重组质粒均能刺激家兔产生抗体．其多克隆抗体的效价较高。     

细胞凋亡过程中核糖体蛋白质S3a水平变化的研究（二）——制备和纯化抗GST／S3a多克隆抗体

目的：制备和纯化抗GST／S3a多克隆抗体。方法：盐析法粗提抗体,用蛋白A－琼脂糖柱纯化IgG,ELISA法检测多克隆抗体水平。结果：ELISA法测定制备和纯化抗GST／S3a多克隆抗体的活性正常,产生了抗原－抗体反应复合物。结论：制备和纯化的抗体血清可以与GST／S3a融合蛋白相结合,产生抗原－抗体反应复合物,说明具有抗GST／S3a融合蛋白的性,为下一步实验奠定基础。     

AIF多克隆抗体的制备纯化和鉴定

目的制备抗AIF多克隆抗体。方法用人工合成的AIF抗原肽免疫实验动物制备多克隆抗体并纯化。利用ELISA和Western blot方法检测多克隆抗体的效价和特异性。结果实验获得的血清抗AIF抗体经间接ELISA法检测,效价达到1∶128 000。Western blot检测表明抗体效价高、特异性强。结论实验获得了高效价的特异性的抗AIF抗体,为进一步研究肿瘤的抗凋亡机制提供新的方法。     

重组人PD-L1在大肠杆菌BL-21中的表达、纯化和鉴定

目的 分离纯化人程序死亡蛋白-1(PD-LI)基因,制备重组人PD-L1蛋白,为进一步研究PD-L1在肿瘤免疫逃逸中的作用和机制建立基础.方法 通过RT-PCR分离纯化人PD-L1基因,并将其克隆到原核表达质粒pGEX-4T一1中,经酶切,测序鉴定分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达.产物经GST蛋白纯化系统进行纯化后,用10%SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定.结果 经RT-PCR分离纯化的PD-L1 cDNA分子由645 bp构成,编码相对分子量约25 KD的蛋白,并与GST形成融合蛋白.GST-PD-L1融合蛋白相对分子量约46 KD.Western Blot结果显示,该蛋白能被兔抗GST和抗PD-L1抗体识别.结论 成功构建了PD-L1原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中获得高效表达.     

抗空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1多克隆抗体的制备与鉴定

目的 表达空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1,并制备针对该蛋白的多克隆抗体.方法 诱导培养工程菌E coli BL21 (DE3)表达空肠弯曲菌PEB1重组蛋白.经镍-琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化,透析并定量后,常规免疫新西兰兔.收集血清,盐析法粗提IgG,应用间接ELISA法和双向琼脂扩散试验检测抗体效价,并通过Western blot和玻片凝集试验检测抗体的特异性.结果 得到高纯度的空肠弯曲菌PEB1重组蛋白.用该蛋白免疫新西兰兔后,获得抗PEB1多克隆抗体.间接ELISA法检测抗体效价为1:2×104,双向琼脂扩散试验检测抗体效价为1:8.结论 运用纯化的空肠弯曲菌PEB1重组蛋白免疫新西兰兔,获得高效价的多克隆抗体.     

Fas胞外区基因的构建、表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的构建Fas胞外区(eFas)基因的表达载体,表达纯化重组蛋白,进行多克隆抗体的制备,为进一步功能研究奠定基础。方法通过重叠PCR获得eFas基因的编码序列,构建pET-22b(+)/eFas表达载体,转化大肠杆菌Rosetta-gami,IPTG诱导表达,Ni-NTA柱亲和纯化,SDS-PAGE鉴定重组蛋白的纯度。将纯化的eFas融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,通过ELISA方法检测多克隆抗体的效价。结果获得了eFas的编码序列与表达载体,目的蛋白主要在包涵体中表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上,纯化的重组蛋白纯度达95%以上。结论eFas融合蛋白基因的构建、表达、纯化以及多克隆抗体的制备,为进一步研究Fas提供了材料。     

牛乳中抗幽门螺杆菌特异性抗体的间接ELISA法的建立

目的 建立抗幽门螺杆菌(Hp)特异性抗体的ELISA检测方法,用于牛乳中抗Hp特异性抗体的检测.方法 超声Hp全菌抗原接种奶牛,按多克隆抗体制备技术制备牛抗Hp抗血清.用纯化牛IgG免疫家兔.制备兔抗牛IgG多克隆抗体.硫酸铵盐析,DEAE-32柱层析分别纯化牛与兔IgG.兔抗牛IgG以辣根过氧化物酶标记.用Hp全菌抗原包被反应板,建立间接ELISA法用于牛乳抗Hp抗体的检测.结果 建立的抗Hp间接ELISA法的最佳包被抗原量为1.47μg/孔,HRP-兔抗牛IgG 1∶600稀释,标准曲线方程为A=0.0124 0.3988 lnC,相关系数r=0.999 8,线性范围为1.8～145μg/ml,回收宰在86.4%～92.8%,变异系数为9.4%～12.3%.结论 初步建立牛乳中抗Hp抗体的间接ELISA测定法,可用于Hp免疫牛乳中抗Hp特异性IgG的检测.     

登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核蛋白多克隆抗体的制备

目的制备登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核蛋白的小鼠多克隆抗体并进行鉴定。方法利用SDS-PAGE电泳的方法将纯化后的登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核表达蛋白浓缩,切割目的条带并研磨制成抗原,皮下多点分次注射BALB/c小鼠,采用Western-Blot、间接免疫荧光法对小鼠血清多克隆抗体进行鉴定。结果经SDS-PAGE电泳成功地将纯化后的登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核表达蛋白浓缩,并获取了抗登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核表达蛋白的多克隆抗体。结论本实验中所用到的登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核蛋白为可溶性抗原,通过切胶研磨制成颗粒性蛋白抗原能获得良好的免疫效果,该方法制备的抗原浓度及纯度高,由此获得了高效价高特异性的多克隆抗体。     

单株抗人肝脏微粒体蛋白及细胞色素P450单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备抗正常人肝脏微粒体(HLM)及细胞色素P450蛋白的单克隆抗体.方法:采用人肝脏微粒体蛋白作为免疫原免疫Balb/C小鼠,按常规方法融合、克隆,经间接ELISA法筛选抗体阳性杂交瘤细胞株,通过单抗亚类、Western blot对抗体进行初步鉴定.结果:成功地制备了一株抗肝微粒体蛋白的单克隆抗体(MAb),命名为MAb 10C7.用鼠单抗亚类快速鉴定纸条鉴定10C7为IgG2b.Western blot分析显示,MAb 10C7可特异识别相对分子量为46kD的人肝脏微粒体蛋白.结论:MAb 10C7抗正常人肝脏微粒或细胞色素P450蛋白的特异性强,对相关蛋白质的功能研究有较好的应用前景.     

3个重要酶的多克隆抗体的制备条件优化

目的制备优质的抗几丁质酶、α-甘露糖苷酶、谷胱甘肽转硫酶的多克隆抗体。方法利用纯化的不同免疫剂量的3种酶分别免疫不同兔龄的新西兰兔。结果使用0.3mg纯化蛋白、免疫6月龄的新西兰兔所制备出的抗体效价高、特异性好。结论这一结果为今后规模化制备相关多克隆抗体奠定了坚实的实验基础。     

HCBP12融合蛋白的表达、纯化及多抗制备

目的：构建丙型肝炎病毒核心抗原结合蛋白12（HCVCore binding protein,HCBP12）原核表达载体,在大肠埃希菌中进行表达、纯化HCBP12融合蛋白并制备兔抗HCBP12多克隆抗体。方法：应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）,以提取的HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得HCBP12基因片段,插入至原核表达载体pET-32a（＋）中,构建原核表达载体pET-32a（＋）-HCBP12,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导,获得HCBP12融合蛋白的可诱导性表达,并通过SDS-PAGE电泳、Western Blot免疫印迹分析和证实融合蛋白表达的特异性。利用Ni＋亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰兔,获得抗HCBP12多克隆抗体。以纯化HCBP12为抗原,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果：HCBP12融合蛋白表达成功。SDS-PAGE分析表明其为包涵体表达。成功获得了融合蛋白纯品及兔抗HCBP12多克隆抗体。ELISA法表明多克隆抗体效价〉1512000,Western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好。结论：成功表达、纯化HCBP12融合蛋白,并获得高特异性、高效价兔抗HCBP12多克隆抗体,为研究HCBP12蛋白的生物学功能及丙肝的临床治疗提供了重要的实验工具。     

整合素阻断剂AP25单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备整合素阻断剂AP25的单克隆抗体,鉴定其效价和特异性.方法 从抗原免疫BALB/c小鼠分离免疫脾细胞,通过杂交瘤技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选杂交瘤细胞株并进行扩大培养.采用小鼠体内诱生法制备腹水,进行纯化后得到抗AP25单克隆抗体,用ELISA和Western blot鉴定其效价和特异性.结果 ELISA检测抗AP25单克隆抗体效价可达1∶2×106,Western blot鉴定抗体特异性良好.结论 获得了能够高表达抗AP25单克隆抗体的杂交瘤细胞株;腹水制备抗体,纯化后得到效价高、特异性良好的AP25单克隆抗体.     

石杉碱甲多克隆抗体纯化方法的研究

目的：根据石杉碱甲多克隆抗体的性质,采用不同的方法对其进行纯化及性质鉴定。方法本实验主要采用硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵沉淀法和Protein A亲和层析法分别对石杉碱甲多克隆抗体进行纯化,并分别对纯化后的抗体纯度、蛋白量和效价进行检测。结果电泳结果示Protein A亲和层析法纯化后仅出现两条色带,无明显杂带,纯度高。饱和硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵沉淀法和Protein A亲和层析法纯化后的抗体蛋白含量分别为4.67mg· mL －1、6.89mg· mL－1和13.44mg· mL －1。 Protein A亲和层析法纯化后抗体的效价大于1∶256000,其性质未发生变化。结论相较于硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵沉淀法,Protein A亲和层析法纯化石杉碱甲多克隆抗体的纯度、蛋白含量、抗体效价更高,纯化效果更优。     

海洋真菌多糖YCP多克隆抗体的制备和鉴定

多糖YCP经CDAP活化与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备了质量比(W(VSA)/W(YCP))为0.15的拟糖蛋白(YCP-BSA),用该拟糖蛋白免疫新西兰大白兔,制备了抗YCP的抗血清,采用辛酸一硫酸铵法纯化,间接EUSA测定,获得了效价为1:20000的YCP多克隆抗体.