前列腺素E_1对高糖培养小鼠肾足细胞整合素及整合素连接激酶影响的研究

目的研究前列腺素E_1(PGE_1)对高糖培养小鼠足细胞整合素及整合素连接激酶(ILK)的影响。方法体外培养和分化小鼠肾小球足细胞,按培养条件不同分为:5.6 mmol/L葡萄糖组(Con),5.6 mmol/L葡萄糖+24.4 mmol/L甘露醇组(5.6 mmol/L+24.4 mmol/L),15 mmol/L葡萄糖组(15mmol/L),30 mmol/L葡萄糖组(30 mmol/L)。每个培养条件分别以0、1、10、20 ng/ml的PGE_1进行干预,24 h后收集足细胞。Western blot检测整合素β1(Integrinβ1)、ILK、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况。结果依次增高葡萄糖浓度下足细胞Integrinβ1蛋白表达相对量依次降低,ILK、α-SMA蛋白表达相对量依次升高。30 mmol/L组足细胞Integrinβ1、ILK、α-SMA蛋白表达相对量为(0.32±0.04)、(1.20±0.02)、(1.24±0.02),与Con组比较差异有统计学意义(P0.05);添加20ng/ml的PGE_1对高糖引起的足细胞上述蛋白异常表达有逆转作用,Integrinβ_1、ILK、α-SMA蛋白相对表达量分别为(0.91±0.02)、(0.26±0.02)、(0.42±0.02),较各组中PGE_1=0时差异有统计学意义(P0.05)。结论 PGE_1对高糖环境中足细胞ILK、α-SMA蛋白表达上调具有抑制作用,对Integrinβ1蛋白表达具有上调作用,对高糖引起的足细胞转分化有抑制作用。     

雷公藤甲素对高糖刺激足细胞转分化的影响

目的 探讨雷公藤甲素（TP）对高糖刺激的足细胞转分化的影响及可能机制.方法 将体外培养的小鼠永生化足细胞分为正常组（加入D-葡萄糖5.5 mmol/L）、高糖组（加入D-葡萄糖30 mmol/L）、TP低剂量组（加入D-葡萄糖30mmol/L＋ TP 3 ng/mL）、TP高剂量组（加入D-葡萄糖30 mmol/L＋ TP 10 ng/mL）及甘露醇组（加入D-葡萄糖5.5 mmol/L＋甘露醇24.5 mmol/L）,采用荧光定量PCR法和Western blot法分别检测各组足细胞Smad3、Smad7、Ssynaptopodin、Ddesmin mRNA及蛋白的表达量.结果 TP低剂量组、TP高剂量组Smad3、Desmin mRNA及蛋白表达均低于高糖组（P＜0.05）,Smad7、Synaptopodin mRNA及蛋白表达均高于高糖组（P＜0.05）.结论 TP可抑制高糖刺激引起的足细胞转分化,其机制可能为在转录水平和蛋白水平调节足细胞Smad3、Smad7表达异常.     

高糖对人肾小球系膜细胞p38MAPK／CREB通路与纤维化的影响

目的探讨高糖环境下人肾小球系膜细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶／cAMP反应元件结合蛋白（p38MAPK／CREB）通路的活性及细胞外基质成分纤维黏连蛋白（FN）的变化。方法以5．6mmol／L葡萄糖培养基培养肾小球系膜细胞为对照组,观察高糖（30mmol／L）培养12、24、48小时。肾小球系膜细胞p38MAPK／CREB活性和FNmRNA、FN的变化。结果与对照组比较,高糖组各时间p-p38MAPK、P—CREB的表达均上升,并随着时间的延长,其表达逐渐升高;FN的表达升高,并且随着时间的延长,其表达进一步升高。结论高糖环境下p38MAPK／CREB通路被激活,FN表达增加,p38MAPK／CREB通路参与了细胞外基质重构的过程。     

高糖对大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响及其机制

目的 探讨高糖对大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）迁移的影响及机制。方法 利用组织块贴壁法培养大鼠主动脉VSMC,以3～5代细胞为靶细胞,待细胞融合后用2%胎牛血清的DMEM同步化12 h,再经含低糖（5.5 mmol/L葡萄糖）、高糖（25 mmol/L葡萄糖）及甘露醇（5.5 mmol/L葡萄糖＋19.5 mmol/L甘露醇）的DMEM处理24 h。以改良Boyden小室观察VSMC迁移能力的变化,细胞免疫荧光分析骨架蛋白F-actin的改变,荧光定量RT-PCR分析收缩型平滑肌标志基因α-SMA和合成型平滑肌标志基因骨桥蛋白（OPN）以及基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）基因的表达情况。结果 高糖促进VSMC迁移。在高糖环境下,VSMC由收缩型向合成型转变,即α-SMA的表达量明显下降,而OPN的表达量明显升高;高糖促进MMP-2、MMP-9的基因表达（分别为低糖组的3.12倍和2.22倍）,使F-actin的排列发生明显改变。结论 高糖促进VSMC迁移,其可能的机制涉及VSMC的表型转变、基质金属蛋白酶表达及F-actin排列的改变。     

内质网应激PERK途径在高糖诱导血管平滑肌细胞向成骨样细胞转化中的作用

目的：研究高糖刺激SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞（VSMCs）向成骨样细胞转分化中内质网应激蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）途径的作用。方法原代培养VSMCs,分为正常对照组（5mmol/L D-葡萄糖）,甘露醇组（5mmol/L D-葡萄糖＋25mmol/L甘露醇）,高糖组（30mmol/L D-葡萄糖）,高糖＋PERK-小干扰RNA（siRNA）转染组（30mmol/L D-葡萄糖＋PERK-siRNA转染）,高糖＋RNA干扰阴性对照组（30mmol/L D-葡萄糖＋乱序RNA转染）。分别作用48和72h。逆转录-聚合酶链反应及Western blot分别从信使RNA（mRNA）和蛋白质水平检测不同时间点内质网应激相关分子GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4的改变,以及成骨样细胞标志性分子核心转录因子（Cbfα-1）、骨钙素以及平滑肌细胞标志性分子α-SMA的改变情况。应用碱性磷酸酶（ALP）活性检测试剂盒检测ALP的活性。结果与正常对照组和甘露醇组比较,在mRNA水平,高糖组和高糖＋RNA干扰阴性对照组PERK和eIF2α表达升高（P＜0.05）,PERK-siRNA转染后其表达水平均降低（P＜0.05）,在蛋白质水平,PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α表达升高（P＜0.05）,PERK-siRNA干预后其表达均降低（P＜0.05）。高糖刺激VSMCs后ALP活性升高（P＜0.05）,PERK-siRNA转染后其表达均降低（P＜0.05）。结论内质网应激PERK途径在高糖诱导VSMCs由收缩表型向成骨样细胞表型转化中发挥作用,抑制PERK途径可以部分阻止这一转化过程。     

高糖高棕榈酸培养对β细胞脂质含量及脂肪酸转位酶表达的影响

目的研究高糖高棕榈酸（PA）培养对β细胞脂质含量及脂肪酸转位酶（FAT/CD36）表达的影响。方法NIT-1细胞分别以5mmol/L葡萄糖（NC组）、25mmol/L葡萄糖（HG组）、0.25mmol/LPA＋5mmol/L葡萄糖（HP组）及0.25mmol/LPA＋25mmol/L葡萄糖（GP组）培养24h后,测定细胞内甘油三酯（TG）含量、胰岛素分泌以及FAT/CD36 mRNA与蛋白的表达。结果（1）与NC组比较,各处理组细胞内TG含量增加,而葡萄糖刺激的胰岛素分泌下降,以GP组变化最明显。（2）在高糖孵育下,HG组和GP组FAT/CD36 mRNA与蛋白表达均较NC组显著增加（P〈0.01）,但HP和GP组与相应的葡萄糖组比较,FAT/CD36表达无明显变化。结论在高棕榈酸的环境下,高糖可进一步促进β细胞脂质沉积,抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌;其中高糖上调脂肪酸转位酶表达可能是其重要机制之一。     

高糖对小鼠足细胞表型转化的诱导作用及机制探讨

目的观察高糖对小鼠足细胞表型转化的诱导作用,并探讨其机制。方法将传代培养后的小鼠足细胞随机分为A、B、C三组,A组常规培养,B组加入终浓度为30 mmol/L的葡萄糖、C组加入终浓度为30 mmol/L的葡萄糖及10μmol/L的蛋白质酪氨酸激酶(JAK2)特异性阻断剂α-氰-(3,4-二羟基)-N-苄基肉桂酰胺(AG490)进行培养,48 h后收集细胞,采用Western blot法检测足细胞中自身标志物人肾病蛋白(Nephrin)、间充质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及磷酸化蛋白质酪氨酸激酶(p-JAK2)蛋白,采用RT-PCR检测足细胞中的Nephrin、α-SMA mRNA。结果 A组足细胞中Nephrin、α-SMA、p-JAK2蛋白积分光密度值分别为0.96±0.01、0.21±0.02、0.39±0.01,B组分别为0.58±0.01、0.66±0.07、0.71±0.02,C组分别为0.87±0.04、0.35±0.02、0.41±0.04;A组足细胞中Nephrin、α-SMA mRNA的相对表达量为1.53±0.04、0.57±0.01,B组分别为0.82±0.09、0.89±0.03,C组分别为1.30±0.04、0.78±0.03。B组与A组比较,P均<0.05;C组与B组比较,P均<0.05。结论高糖可通过激活JAK/STAT信号途径诱导足细胞发生表型转化。     

PI3K／Akt信号途径参与高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化及对分化抑制因子2表达的影响

目的观察PI3K／Akt在高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用及对分化抑制因子2（1d2）表达的影响。方法大鼠肾小管上皮细胞随机分成3组：对照（Con）组,高糖（H—Glu）组和PI3K抑制剂Wortmannin（Wort）组。Con组加正常培养液,限GIu组在培养液中加30mmol／L葡萄糖,Wort组用Wortmannin预处理1h后,加30mmol／L葡萄糖。24h后用免疫细胞化学、Western blot法和RT-PCR法检测α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、p-Akt和Id2的表达。结果Con组α-SMA、p-Akt阳性表达细胞很少,绝大部分细胞出现Id2阳性表达。与COn组比较,H-Glu组出现α-SMA和p-Akt表达升高,Id2表达降低（P〈0．05）。与H-Glu组比较,Wort组α-SMA和p-Akt表达下降,Id2表达升高（P〈0．05）。结论PI3K／Akt可能通过抑制Id2基因表达,参与高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化。     

高糖通过转化生长因子依赖途径介导肾小管上皮细胞-肌纤维母细胞转分化及Ⅰ型胶原合成的机制

目的探讨高糖介导肾小管上皮细胞转分化及Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ）合成的分子机制。方法含35mmol／L葡萄糖培养液培养大鼠肾小管上皮细胞（NRK52E细胞）,免疫化学方法检测p-Smad2／3核转位,ELISA检测细胞培养上清中TGF-β1浓度,RT-PCR和Western blot方法分别检测α-SMA、E-eadherin、Collagen Ⅰ mRNA和蛋白的表达。观察TGF-β1中和抗体对高糖上述效应的影响。结果高糖促进NRK52E细胞合成和分泌TGF-β1。TGF-β1中和抗体能抑制高糖介导的p-Smad2／3核转位,下调高糖介导的α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白表达,上调E-Cadherin蛋白表达（P均〈0．01）。结论高糖介导的肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质Collagen Ⅰ的合成依赖于TGF-β1效应。     

mTOR抑制剂PP242对高糖诱导足细胞损伤保护机制的实验研究

目的探讨高糖诱导的小鼠肾足细胞增殖、凋亡和Podocin蛋白表达的变化以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂PP242的干预效应。方法以体外培养的条件永生性的小鼠肾足细胞为研究对象,将足细胞分为4组。正常组给予葡萄糖5.5 mmol/L;高糖组给予葡萄糖30 mmol/L;PP242干预1组给予葡萄糖30 mmol/L、1μmol/L PP242; PP242干预2组给予葡萄糖30 mmol/L、10μmol/L PP242。用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测PP242对高糖诱导的足细胞增殖的影响,用流式细胞仪检测PP242对高糖诱导的足细胞凋亡的影响,用Western Blot方法检测PP242对高糖诱导的足细胞Podocin蛋白表达。结果高糖诱导足细胞48 h后,与正常组比较,高糖组细胞增殖减少,细胞凋亡增加,Podocin蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P0.05)。高糖诱导经PP242干预后,与高糖组比较,PP242干预1组、PP242干预2组足细胞增殖增加,足细胞凋亡减少,Podocin蛋白表达明显升高,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 PP242可以部分减少高糖诱导的足细胞损伤,具有潜在的足细胞保护作用。     

高糖状态下肾脏系膜细胞葡萄糖转运蛋白1的表达及氟伐他汀的干预研究

目的观察高糖环境中大鼠肾脏系膜细胞（MC）葡萄糖转运蛋白1（GluT-1）及转化生长因子1（TGF-β1）mRNA表达变化以及氟伐他汀（Flu）的干预作用，探讨其保护肾脏的可能机制。方法原代培养MC分为正常对照（NG）组、甘露醇（MG）组、高糖（HG）组及HG＋Flu组，RT-PCR法检测细胞中GluT-1mRNA和TGF-β1 mRNA的表达，放免法测定各组细胞培养上清液中Ⅳ型胶原含量。结果HG组各时相点GluT-1mRNA、TGF-β1 mRNA表达量均高于NC组（P〈0．01），从48h开始HG组细胞上清液Ⅳ型胶原的含量较NC组增高（P〈0．05），而HG＋Flu组GluT-1 mRNA表达量、TGF-β1 mRNA的表达、细胞上清液Ⅳ型胶原含量均较同时点HG组明显降低（P〈0．01）。结论高糖刺激使MC内GluT-1 mRNA表达增高，TGF-β1 mRNA表达上调，Ⅳ型胶原分泌增多。高糖状态下，Flu抑制细胞外基质积聚的作用可能与其抑制高糖引起MC GluT-1过表达、减少TGF-β1的合成有关。     

辛伐他汀对野百合碱诱导肺动脉高压大鼠Rho／Rock的影响

目的观察辛伐他汀在野百合碱（MCT）诱导的肺动脉高压（PAH）大鼠模型中对Rh0／Rock表达的影响,探讨辛伐他汀改善MCT所致PAH的机制。方法雄性SD大鼠30只随机均分为对照组、MCT模型组和辛伐他汀干预组（SS组）。测量各组大鼠干预后平均肺动脉压力（mPAP）、右心室肥厚指数（RVHI）;观测大体的组织形态病理改变,采用免疫组化和Westernblot检测肺组织中的PCNA、α-SMA、Rho／Rock的表达。结果与对照组及干预组相比,MCT组的mPAP及RVHI显著增加（P〈0．05）,PCNA、α—SMA、Rho／Rock的表达显著增多（P〈0．05）;与对照组相比,SS组的mPAP及RVHI差异无统计学意义（P〉0．05）;而PCNA、α—SMA、Rho／Rock的表达显著增多（P〈0．05）。结论辛伐他汀可有效减轻MCT诱导的PAH大鼠肺动脉压力,其机翩可能与辛伐他汀通过Rho／Rock信号通路改善肺动脉平滑肌增生重构有关。     

足细胞特异性因子nephrin及肿瘤蛋白-1在肾小球硬化过程中表达变化

目的：应用嘌罗霉素氨基核苷（PAN）模型，通过观察临床、病理指标及足细胞特异性因子nephrin和肿瘤蛋白-1（WT-1）在足细胞的表达，了解足细胞损害在肾小球硬化过程中的重要作用。方法尾静脉注射PAN制作大鼠肾病模型，测定不同时间点的生化指标，处死大鼠，取其肾脏，石蜡包埋切片，PAS及免疫组化染色，测定肾小球硬化指数（GSI），肾小球面积（GA），nephrin及WT-1的表达，进行统计学分析。结果 PAN组在早期（第8天）表现为典型肾病综合征，后期（20周）表现为慢性肾炎。形态学方面，PAN组的GSI在4，14，20周均明显高于对照组（P＜0.05）。PAN组GA在14周时大于对照组（P＜0.01），但在20周时小于对照组（P＜0.001），并且20周时GSI与GA之间呈强负相关关系。PAN组nephrin表达在4，14，20周时与对照组比较均有所减少（P＜0.05），与此同时，WT-1的表达在14和20周时较对照组明显减少（P＜0.001）。结论（1）在肾炎发展中，随着时间延长，GSI增高，GA缩小，并且GSI和GA之间呈负相关。（2）在肾小球硬化发展中， nephrin和WT-1的表达进行性减少，说明有明显足细胞数量的减少。因此，足细胞的损伤与肾小球硬化密切相关。     

TRAIL体外诱导人肝星形细胞LX-2凋亡作用及调控机制

目的研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导肝星形细胞凋亡情况及调控机制。方法用RT-PCR检测LX-2中α-SMAmRNA和DR5mRNA的表达;MTT比色法、流式细胞术检测外源性TRAIL对LX-2细胞增殖和诱导细胞凋亡的影响;采用Westernblot检测Bax、Caspase3表达。结果培养的LX-2表达α-SMAmRNA和DR5mRNA逐渐增加,TRAIL可以抑制其细胞增殖,与剂量相关（P〈0.05）。与对照组比较,TRAIL诱导活化的LX-2细胞凋亡明显增加（P〈0.05）,Western blot分析显示TRAIL作用下,LX-2线粒体Bax、细胞质Caspase3表达上调。结论外源性TRAIL可以诱导活化的LX-2凋亡,其机制与DR5及线粒体Bax表达上调有关。     

TRAIL诱导大鼠肝星状细胞系HSC-T6凋亡及机制研究

目的研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导肝星状细胞凋亡情况及调控机制。方法用RT-PCR检测大鼠肝星状细胞（HSC-T6）中α-SMAmRNA和DR5mRNA的表达;MTT比色法和流式细胞术检测外源性TRAIL对HSC-T6细胞增殖和诱导细胞凋亡的影响;采用Western blot检测Bax、Caspase3蛋白的表达。结果培养的HSC-T6细胞表达α-SMA mRNA和DR5mRNA随作用时间的延长逐渐增加,TRAIL可以抑制其细胞增殖。TRAIL与对照组比较可以诱导活化的HSC-T6细胞凋亡明显增加（P〈0.05）,Western-blotting分析显示TRAIL作用下,HSC-T6细胞中的线粒体Bax蛋白、细胞浆Caspase3蛋白表达均上调。结论外源性TRAIL可诱导活化的HSC-T6细胞凋亡,可能与DR5及线粒体Bax表达上调有关。     

转化生长因子-beta1与冠状动脉内膜增厚及平滑肌细胞增生的关系

目的通过检测扩张性心肌病(DCM)的冠状动脉组织,研究转化生长因子-beta1(TGF-β1)与冠状动脉的内膜增厚的联系。方法解剖20例DCM心脏移植术的受体心脏的冠状动脉,检测冠状动脉壁的中层和内膜层组织的α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和TGF-β1的蛋白表达水平。结果组织形态观察DCM的冠脉均存在不同程度的内膜层增厚,通过免疫组化染色中对α-SMA阳性区域的分析,发现SMC广泛均一地分布在DCM冠脉壁增厚的内膜中。TGF-β1的表达与α-SMA的表达(r=0.498,P<0.05)及内膜/中层面积比(r=0.465,P<0.05)成正相关,且TGF-β1与内膜中α-SMA阳性区域的面积百分比(r=0.615,P<0.01)也成正相关。结论正常冠状动脉壁中TGF-β1的表达与冠状动脉内膜增厚及SMC在内膜中的增生成正相关。     

法舒地尔抑制大鼠肝纤维化组织ROCK-Ⅰ、α-SMA、p-MBS Thr-697表达

目的 探讨Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil forming protein kinase,ROCK)-Ⅰ选择性阻断剂法舒地尔对大鼠肝纤维化组织ROCK-Ⅰ、α-SMA和p-MBS Thr-697表达及细胞骨架变化的影响.方法 应用Western blot方法测定肝组织...     

内毒素对实验性肝纤维化大鼠基质金属蛋白酶-2的影响

目的探讨内毒素对早期实验性肝纤维化大鼠基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的影响及其在肝纤维形成过程中的作用机制。方法建立实验性肝纤维化大鼠模型,采用免疫组化染色法半定量测定MMP-2、α-SMA在肝纤维化过程中的时序动态表达,网状纤维法判定肝纤维化程度,同时采用ELISA法测定血浆内毒素和TNF-α的水平。结果有内毒素血症发生,不同时期（0、2、4、6周）血浆内毒素水平呈梯度增加,组间差异明显,血浆内毒素与TNF-α及肝组织MMP-2、α-SMA表达有较好的相关性。MMP-2表达的部位、时序、量的变化都与α-SMA的表达大致平行,以中央静脉周围、汇管区、纤维间隔内为明显,提示MMP-2主要由活化的肝星状细胞（HSC）合成。肝纤维化程度与α-SMA、MMP-2在肝脏的表达呈正相关。结论内毒素可能通过细胞因子TNF-α,介导肝组织MMP-2、α-SMA的表达,而后者又与肝纤维化的程度密切相关。     

硫化氢对糖尿病大鼠肾脏病变的减缓作用

目的内源性硫化氢（H2S）干预对糖尿病肾病大鼠肾小球病变的影响。方法把SD大鼠随机分成4组。建立糖尿病大鼠模型后,其中2组分别给以硫氢化钠和DL-propargylglycine治疗8周。免疫组化法检测肾组织中α平滑肌肌动蛋白（α—SMA）及纤维粘连蛋白（FN）分布及含量的变化。结果与H2S组相比,糖尿病大鼠肾脏中α—SMA和FN的分布范围广泛,含量明显增加（P〈0．01）。结论外源性H2S干预能够减缓糖尿病大鼠肾小球病变的进展。