与人汗腺细胞共培养的人骨髓间充质干细胞表型转化及相关机制

目的 研究人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)与经热休克处理的人汗腺细胞(sweat gland cells,SGCs)体外间接共培养状态下的细胞表型转化及相关机制.方法 体外分别分离扩增人MSCs及SGCs,原代SGCs生长融合后于47℃热休克,收集即刻和24 h后的上清加入第3代MSCs,7 d后分别以二步免疫细胞化学法和流式细胞术检测MSCs表达细胞角蛋白7(CK7)、CK18和癌胚抗原(CEA)的情况并与对照组比较.结果 加入SGCs上清后MSCs生长减慢,7 d内无明显形态改变;二步免疫细胞化学法显示部分细胞CK7和CEA染色刚性;流式细胞术显示,诱导组细胞CK7和CEA阳性率分别为5.76%和2.01%,对照组为1.12%和0.51%,两者差异有统计学意义(P＜0.01).结论 SGCs热损伤释放后某些信号物质,可诱导MSCs横向分化.     

脑瘫患者骨髓间充质干细胞传代过程中细胞表型和所分泌细胞因子变化特点

 目的 分析脑瘫患者骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)的基本生物学特性,观察其在传代培养过程中的表型和所分泌的因子变化,为临床应用提供理论依据.方法 密度梯度离心法提取脑瘫患者的BMSCs,采用人淋巴细胞分离液分离BMSCs,在相同条件下观察各代细胞形态、生长情况,检测各代细胞的表型和分泌的细胞因子.结果 BMSCs在第3至第10代,CD29、CD44、CD106等表型的表达变化无统计学差异,CD54的表达变化最大,在第9代时最高.CD14、CD34、CD45和HLA-DR等细胞表型在各代骨髓间充质干细胞中表达均<5%;NGF、NT3、VCAM、ICAM-1、VEGF、BDNF等细胞因子的浓度变化无统计学差异,PGE2的变化需进一步研究予以确认.结论 在体外培养的条件下,8代以前的细胞生长形状稳定,可作为组织工程等临床应用的良好对象.     

特定微环境诱导人脐带沃顿胶间充质干细胞向汗腺样细胞分化的实验研究

目的鉴定人脐带沃顿胶间充质干细胞(hUCWJ-MSCs)经汗腺诱导培养基培养后向汗腺样细胞分化的潜能。方法酶消化法分离培养人正常汗腺细胞,热休克汗腺细胞后收集培养基上清液,按10%的体积分数配制汗腺分化诱导培养基。酶消化法分离获取hUCWJ-MSCs,流式细胞仪分析细胞表型特征;成骨诱导培养基和成脂诱导培养基中培养2～3周后采用碱性磷酸酶染色和油红-O染色对其分化潜能进行鉴定;在汗腺诱导培养基中培养3周,倒置显微镜观察细胞形态变化,分别收集培养1、2、3周时的细胞,采用免疫组织化学和流式细胞术检测汗腺标记物CEA、CK14、CK19的表达,RT-PCR检测汗腺发育基因(EDA)的表达。结果正常汗腺细胞呈铺路石状克隆样增生。hUCWJ-MSCs呈梭形、成纤维细胞样,流式细胞分析显示其CD44、CD105、CD34、CEA阳性率分别为97.37%9、6.26%、0.56%0、.52%;经成骨诱导培养基和成脂诱导培养基培养2～3周后,可诱导成为油红-O染色阳性的脂肪细胞和碱性磷酸酶染色阳性的骨细胞;在汗腺诱导培养基中培养3周后,细胞具有类似汗腺样结构,免疫组织化学DAB显色结果显示分化后的hUCWJ-MSCs表达汗腺细胞标记物CEA、CK14、CK19,流式细胞仪检测其阳性率分别为54.37%、60.25%、62.13%,RT-PCR结果显示其可较高水平地表达EDA基因。结论 hUCWJ-MSCs具有向汗腺样细胞分化的潜能。     

人胚胎骨髓间充质干细胞在大鼠体内分化为肝细胞的研究

目的：观察人胚胎骨髓间充质干细胞(MSC)在受体大鼠体内的分化演变，研究人胚胎骨髓间充质干细胞在活体大鼠体内转化为人肝细胞的可行性。方法：将人胚胎MSC移植到肝损伤合并自身肝细胞再生抑制大鼠的脾脏。术后分时段取脾脏进行免疫组化染色，了解人白蛋白(ALB)、人角蛋白(CK8)、人CK18、人CK19的表达情况。结果：人胚胎MSC移植后10d大鼠脾脏的人CK8、人CK18、人CK19免疫组化染色可见阳性细胞；移植后15d大鼠脾脏组织内人ALB免疫组化染色可见阳性细胞。结论：人胚胎MSC能够在自身肝细胞再生抑制的肝损伤大鼠脾脏内分化为肝细胞。     

成年鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞

目的探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)体外培养条件及定向分化为心肌样细胞的可行性。方法通过取成年SD大鼠股骨干骨髓,进行体外培养和传代,用10μmol/L 5-氮杂胞苷(5-aza)分别对原代、一代和三代MSC进行体外定向诱导,用免疫组化方法分析检测分化后细胞的心肌特异性抗原(肌丝蛋白、肌钙蛋白)并通过RT-PCR鉴定心肌细胞特异因子基因(ANP、GATA-4)的表达。结果原代、一代MSC在体外经5-aza诱导4周后,细胞形态无明显变化,而经5-aza诱导4周后的三代MSC形态变大,呈杆形、球形,诱导细胞相互连接,连接细胞出现肌管样结构。免疫组化检测经10μmol/L 5-aza诱导4周的原代、一代MSC未见肌丝蛋白、肌钙蛋白T阳性细胞,而诱导三代MSC肌丝蛋白阳性比例近20%,肌钙蛋白阳性比例约8%。RT-PCR显示诱导三代MSC 4周后有ANP和GATA-4心肌细胞特异基因表达。结论MSC能够在体外经5-aza诱导分化为心肌样细胞,具有向心肌细胞转化的潜力,是自体心肌细胞移植的一种良好供体。     

胎儿骨髓间充质干细胞的体外培养及其生物学特性的研究

目的：确定人胎儿骨髓间充质干细胞(Fetal mesenchymal stem cells，FMSCs)体外分离和培养的方法，观察其生物学特性，建立稳定的MSCs体外培养扩增体系。方法：通过密度梯度离心、贴壁筛选法分离培养人FMSCs，观察细胞的形态与超微结构，并研究其增殖及生长特征，应用流式细胞术测定细胞周期和CD14、CD29、CD34、CD44、CD45的表达。结果：在体外培养条件下人FMSCs贴壁生长，为成纤维细胞样，CD14／CD34／CD45阴性，CD29／CD44阳性，核浆比大，细胞周期检测C0／C1期约占95％，具有原始细胞的特征。结论：体外培养可获得较均一的FMSCs，形态单一、生长稳定、增殖性较强，可以用于细胞治疗的进一步研究。     

miRNAs在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的观察miRNAs在人骨髓间充质干细胞(MSC)中的表达情况。方法以从骨髓中分离培养的人骨髓MSC为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200nt),经多聚腺苷酸化和5'连接子连接后进行反转录,扩增克隆到得到大约109bp的DNA片段,测序后经生物信息学分析确定miRNAs的表达情况。选取部分miRNAs和新发现miRNAs,合成相应探针,与从人骨髓MSC、人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607和大鼠成骨肉瘤细胞系UMR-106中分离出的小片段RNA进行杂交验证(Northernblot)。结果成功从骨髓中分离培养出骨髓MSC,流式细胞仪检测93%以上的MSC表达CD44,但不表达CD34、CD45。从MSC中克隆测序得到194个克隆体,经生物信息学分析发现52个miRNAs(27种),其中包括26种已知的miRNAs和1种Nature杂志预测的miRNAs(PRE-DICTED-miR-202)。选取4条miRNAs(miR-495、miR-34a、miR-17-5p和PREDICTED-miR-202)进行Northernblot验证,发现它们均在MSC中表达。其中miR-34a和PREDICTED-miR-202只表达于MSC,miR-495在MSC和SOSP-9607中表达,miR-17-5p在3种细胞中均有表达。结论筛选出了在人骨髓MSC中表达的miRNAs,为miRNAs参与调控MSC的自我更新提供了依据,同时为miRNAs在干细胞中的潜在应用奠定了基础。     

诱导骨髓间充质干细胞再生汗腺组织的神经与血管支配研究

目的研究诱导骨髓间充质干细胞再生汗腺组织后的神经与血管分布特征,以确认再生汗腺组织是否受到新生神经的支配和新生血管的血液供应,进而评价再生汗腺组织的质量。方法选择烧伤后行瘢痕切除术患者4例。每例患者均设创面自体骨髓间充质干细胞（MSCs）移植和对照两个部位。移植部位在瘢痕切除的创面上接种经过诱导的MSCs,而对照部位除未接种MSCs外,其余方法同治疗创面。术后3个月在移植部位和对照部位分别进行发汗试验。在移植部位发汗试验呈阳性处取材,同时取对照部位的组织和术中切下的瘢痕组织。采用免疫组织化学二步法检测所取组织标本的S-100蛋白（S-100）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、八因子相关抗原（Ⅷ－RAg）和CD34的表达,并与正常皮肤作比较研究。结果4例创面移植部位发汗试验均呈阳性,对照部位发汗试验阴性。免疫组织化学检测显示移植部位的真皮浅层有结构类似于正常汗腺的组织团块,而对照部位未观察到类似结构。S-100、NSE、Ⅷ－RAg和CD34在移植部位、对照部位、瘢痕组织以及正常皮肤均有表达,并且S-100、NSE、Ⅷ－RAg和CD34在移植部位再生汗腺组织中的分布与在正常皮肤汗腺组织中的分布极其相似。结论诱导骨髓间充质干细胞再生汗腺的组织中均有神经与血管分布,提示形成具有功能的汗腺组织可能受到新生神经的支配和新生血管的血液供应,骨髓间充质干细胞经诱导可以生成形态和功能较好的汗腺组织。     

去舒地尔对人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的影响

目的 探讨HA-1077（fasuclil，法舒地尔）对人骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为表皮细胞的影响。方法 采用直接贴壁法培养并扩增人胚胎股骨骨髓干细胞，免疫细胞化学及流式细胞仪进行表面标志的检测。设对照组、诱导组、HA-1077诱导组1、HA-1077诱导组2，采用免疫细胞化学及流式细胞仪对各组细胞角质蛋白表达变化进行检测，观察其对MSCs分化为表皮细胞的影响。结果 采用直接贴壁法可以获得大量高纯度的人骨髓MSCs，分组培养后第2天开始出现少量细胞角质蛋白阳性表达细胞，随着时间延长，阳性率逐渐提高。7天后流式细胞仪显示单纯诱导组及HA-1077诱导组CK5／8、CKl0／13、CK19阳性率均远高于诱导组（P〈0．01）。结论 HA-1077可能通过抑制Rho-ROCK途径的激活从而促进MSCs体外培养中角蛋白表达的显著提升，Rho-ROCK途径可能在促进MSCs分化为表皮细胞过程中起着重要调控作用。     

骨髓间充质干细胞的成骨研究进展

骨组织工程学研究内容主要包括3方面：①种子细胞的研究；②支架材料的研究；③组织工程化骨的临床应用，其中种子细胞是组织工程研究中首要的、最基本的环节。作为骨组织工程的理想种子细胞。应具有以下特点：结构比较简单，是不具有特定机能的原始细胞；取材容易，对机体损伤小；体外培养增殖能力强；自我更新，一定条件下向特定方向转化；稳定表达成骨细胞表型：植入人体后能继续产生成骨活性；无致瘤性。20世纪70年代中期已证实BMSCs具有自我增殖能力和分化潜能．而且BMSCs具有来源广泛、取材简单、分化成骨潜能强等特点。成为目前骨组织工程种子细胞研究的重点。     

大鼠骨髓间充质干细胞磁标记及MR成像研究

目的应用菲立磁．多聚左旋赖氨酸复合物标记大鼠骨髓间充质干细胞，探讨MR成像显示磁标记干细胞的可行性。方法制备菲立磁-多聚左旋赖氨酸复合物。分离培养Wistar大鼠骨髓间充质干细胞，以菲立磁-多聚左旋赖氨酸复合物标记干细胞。分别于标记后24h及1、2、3周行普鲁士蓝染色观察细胞内铁，台盼蓝排除试验检测细胞活力。应用1．5TMR仪，以SE序列T1WI、T2WI和梯度回波（GRE）序列T2＊WI行磁标记干细胞成像。结果普鲁士蓝染色显示细胞质内大量铁颗粒存在，标记率100％；随细胞分裂增殖，细胞内铁颗粒逐渐减少。干细胞磁标记后24h及1、2、3周的台盼蓝拒染率分别为91．00％、93．00％、91．75％和92．50％，与未标记细胞相比较差异无统计学意义（P〉0．05）。10^3、10^4、10^5个磁标记干细胞T2WI信号降低分别为63．75％、82．31％、91．92％，T2＊WI信号降低分别为68．24％、83．01％、93．94％。10^5个干细胞磁标记后24h及1、2、3周T2＊WI信号降低分别为93．75％、75．92％、41．75％、8．83％。结论应用菲立磁-多聚左旋赖氨酸复合物标记大鼠间充质干细胞安全、有效；T2＊WI对磁标记干细胞的显示最敏感；MR信号改变与干细胞数目及分裂增殖状态相关。     

大鼠骨髓间充质干细胞的钆-荧光双标记及MRI体外示踪的研究

目的 应用多聚胺载体,对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)进行钆喷替酸葡甲胺(Gd-DTPA)及荧光双标记,探讨MSCs MR磁性标记及体外示踪的可行性.方法 以聚乙烯亚胺-罗丹明复合物(JetPEI-FluoR)为载体,制备Gd-DTPA双标记示踪剂,培养分离SD大鼠骨髓MSCs,以此示踪剂体外标记间MSCs.对标记后细胞行生物学性状检测及电镜、荧光镜观察.应用1.5 T MR仪,对标记的干细胞进行sE T1 WI及T2 WI及混合(mixed)回波序列的T1测量,标记细胞正常传代后进行MR检查,观察标记的持久性.标记细胞、未标记细胞的T1 WI信号强度、T1之间的比较使用t检验,台盼蓝拒染率采用两因素重复资料方差分析,不同浓度示踪下细胞吸光度比较采用单因素方差分析.结果双标记示踪剂标记5×105个MSCs,标记成功了4.25×105个,荧光镜下标记率为85%,电镜下钆(Gd)颗粒主要位于胞质内高尔基体周围.双标记示踪剂孵育3、6、12、24 h内标记细胞的台盼蓝拒染率分别为(96.55±2.90)%、(94.17±2.56)%、(97.16±3.12)%、(94.23±2.67)%,相应的未标记细胞的拒染率分别为(95.86±2.67)%、(92.04±2.21)%、(93.38±3.64)%、(92.12±2.53)%,24 h内标记细胞与未标记细胞拒染率差异无统学意义(F=4.523,P＞0.05).细胞增殖实验中,在2.5、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0 μl不同浓度示踪剂时,标记细胞的吸光度分别为(0.1884±0.0151)、(0.1878±0.0190)、(0.1741±0.0160)、(0.1135±0.0215)、(0.1079±0.0145)、(0.0811±0.0079),未标记细胞为(0.1940±0.0116),Gd-DTPA 30.0 μl以下标记细胞与未标记细胞吸光度差异无统计学意义(q'=0.2225～0.9458,P＞0.05).标记后细胞凋亡指数为5.08%,对照组未标记细胞为3.86%.未标记细胞T1 WI平均信号强度及T1分别为240.3±24.7、(2457±56)ms,而标记细胞为336.2±20.7、(1102±64)ms,两者间差异有统计学意义(t值分别为12.656、17.889,P值均＜0.01),T1 WI可监测到最低密度为5×103个标记细胞.标记细胞正常传代后,MRI体外可持续显示至第4代标记细胞.结论应用多聚胺载体对大鼠间充质干细胞进行Gd-DTPA及荧光双标记,安全有效,MRI能示踪体外双标记的干细胞.     

创面收集液对表皮干细胞表型的影响

目的 探讨全层创面收集液对表皮干细胞类型的影响。方法 以聚氨酯海绵收集成年Wistar大鼠背部全层创面渗出液；以快速黏附分离法体外分离、培养新生Wistar大鼠的表皮干细胞，待表皮干细胞呈克隆生长时加入创面收集液干预，分别于干预后的0，6，12，18，24，30，36，42，48，54，60，72h采用流式细胞仪及β1整合素、角蛋白19，14，10免疫组化染色进行细胞增殖分化的鉴定。结果表皮干细胞在创面收集液干预后仍可持续保持片状聚集生长的态势，但出现数量较多的角蛋白14阳性染色细胞群落，且随时间延长该阳性细胞群落呈上升趋势；另出现了散在的角蛋白10染色阳性细胞。结论创面收集液可以快速诱导体外培养表皮干细胞进入分化状态，且多表现为短暂扩充细胞表型，在该过程中表皮干细胞数量仍可维持在一定的水平。     

BMP12诱导恒河猴骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞

目的研究骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞的可能性。方法通过电穿孔法将外源基因BMP12导入骨髓间充质干细胞中，诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞；在形态学和分子生物学水平上对诱导后的细胞加以鉴定。结果光镜下，诱导后的细胞形态发生明显改变；RT-PCR结果表明，诱导后的细胞有BMP12和Collagen Ⅰ的mRNA表达，而没有Coilagen Ⅲ的mRNA表达；诱导后98.39％的细胞呈CD44^ 、HLA-DR^-。结论BMP12能够诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞，间充质干细胞有可能成为肌腱组织工程种子细胞来源之一。     

骨髓间充质干细胞体外培养和成骨诱导

目的：观察骨髓问充质干细胞（MSC）体外培养及诱导成骨分化的特征。方法：采用密度梯度离心和体外扩增培养人骨髓MSC,并进行成骨诱导。应用茜素红染色法和钙钴法分别进行成骨诱导的MSC钙化结节检测和碱性磷酸酶（ALP）检测。结果：MSC成骨细胞诱导培养第l～3天的细胞增殖旺盛,3～5d即融合成单层。随着诱导培养时间的延长,细胞逐渐堆积并矿盐沉积,形成矿化结节。培养14d和21d后,矿化结节形成率分别为（70．5±3．5）％和（87．5±3．5）%,ALP染色阳性率分别为（41．5±1．5）％和（85．2±1．7）％。结论：在体外培养条件下,骨髓MSC可诱导分化为具有含矿化结节及ALP阳性特征的骨样细胞。     

三种培养条件下兔骨髓间充质干细胞的成骨特性

目的 观察三种培养条件下兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化特性。方法 比较BMSCs在普通培养基培养、诱导培养基培养和新鲜兔骨碎粒的共培养三种条件下的成骨分化特性，观察细胞的形态及碱性磷酸酶（ALP）活性、骨钙素水平，并检测Ⅰ型胶原表达。结果 共培养及诱导培养的BMSCs同期ALP活性及细胞内骨钙素均显著高于普通培养组（P〈0．01），诱导培养最高；经过诱导培养及共培养的BMSCs，其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性；对照组Ⅰ型胶原免疫组化弱阳性，骨钙素免疫组化阴性；普通传代的BMSCs 1周及2周的Ⅰ型胶原表达条代灰度均明显低于同期共培养及诱导培养的BMSCs。结论 共培养条件及诱导培养均呈现促BMSCs向成骨方向转化的特点，诱导培养短期能使ALP、骨钙素达到较高水平。