两种CXCR4稳定表达的肾癌A498细胞株的构建

目的将表达CXCR4及增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)-CXCR4质粒转入肾癌细胞A498中,并建立稳定转染细胞株。方法针对CXCR4基因构建稳定表达CXCR4质粒,应用脂质体转染技术将稳定表达CXCR4及EGFP-CXCR4质粒转入肾癌A498细胞中,经过G418抗性筛选细胞株。通过共聚焦显微镜观察转染EGFP-CXCR4质粒的A498细胞的表达情况。通过共聚焦显微镜观察EGFP-CXCR4融合蛋白在A498经SDF-1刺激前后的变换。通过蛋白质印迹法检测转染后CXCR4蛋白表达水平的变化,应用MTT法检测转染后的A498细胞增殖能力水平,并通过Transwell实验观察稳定表达CXCR4的肾癌A498细胞株侵袭能力的改变。结果稳定表达CXCR4及EGFP-CXCR4的质粒构建后测序结果与CXCR4DNA序列完全吻合。质粒转入A498细胞后进行G418抗性筛选挑选出合适的细胞株。共聚焦显微镜观察发现,转染EGFP-CXCR4质粒的A498细胞中胞膜及胞质中均有绿色荧光表达,经SDF-1刺激后EGFP-CXCR4向细胞内转移。蛋白质印迹法发现稳定转染CXCR4质粒的A498细胞的CXCR4表达水平高于正常A498细胞。第3天以后,转染pcDNA-CXCR4及pEGFP-CXCR4质粒组的A498细胞增殖水平率高于正常A498细胞(P<0.01)。Transwell实验证实稳定表达CXCR4的肾癌A498细胞株侵袭能力与正常A498细胞株相比增强(P<0.01)。结论成功地构建了CXCR4稳定表达的肾癌A498细胞株,转染后A498细胞的增殖能力增强,侵袭能力增强,为后续实验奠定了基础。     

CXCR4-siRNA重组腺病毒载体沉默人卵巢癌细胞株CXCR4基因表达的研究

目的:研究CXCR4-siRNA重组腺病毒载体对人卵巢癌细胞株SKOV3的CXCR4基因表达的影响.方法:Pac Ⅰ酶切CXCR4-siRNA重组腺病毒载体使其线性化,应用HEK293细胞大量包装扩增病毒,收集病毒液,转染人卵巢癌细胞株SKOV3.细胞分为3组:siRNA组,转染空病毒载体的阴性对照组,细胞不做任何处理的空白对照组.通过PCR、Western blot、免疫组化检测CXCR4基因沉默效果.结果:包装扩增后病毒滴度为6×108 PFU/ml,荧光显微镜下可观察到SKOV3细胞中绿色荧光蛋白的大量表达,重组腺病毒能够有效抑制SKOV3细胞中CXCR4的表达.结论:CXCR4-siRNA重组腺病毒载体可高效转染靶细胞和沉默CXCR4基因的表达,为RNA干扰技术应用于卵巢癌的临床基因治疗奠定基础.     

蛋白免疫共沉淀筛选肾癌A498细胞CXCR4核定位结合蛋白

目的 筛选肾癌A498细胞CXCR4核定位结合蛋白.方法 采用蛋白免疫共沉淀实验寻找特异性条带,再通过蛋白质谱分析、生物信息学分析寻找可能与CXCR4结合的蛋白.结果 CXCR4抗体进行蛋白免疫共沉淀,发现有3条特异性条带.选取特异性条带行质谱分析提示可能的蛋白共有36个.将这36个蛋白与CXCR4进行生物信息学分析发现NR1D2、c-src及HSPA8有可能与CXCR4相互作用,参与CXCR4核定位.结论 NR1D2、c-src及HSPA8可能参与了A498细胞CXCR4核定位的过程.     

热休克同源蛋白73与CXCR4在肾癌A498细胞核内相互作用

目的研究热休克同源蛋白73(heat shock cognate protein 73 000, Hsc73)在基质细胞衍生因子1(SDF-1)/趋化因子CXC受体4(CXCR4)轴促进肾癌转移中的作用,确定Hsc73是否参与了CXCR4的核定位。方法通过蛋白电泳观察CXCR4高表达后Hsc73在A498细胞中的表达情况。通过免疫染色、核蛋白免疫共沉淀等方法观察A498细胞在经过SDF-1刺激后Hsc73在细胞内表达情况,以及Hsc73与CXCR4结合情况。结果CXCR4高表达后,A498细胞中Hsc73表达明显增高。Hsc73主要表达在A498细胞胞质中,在SDF-1刺激后出现部分转移至细胞核。提取SDF-1刺激后的A498细胞核蛋白进行CXCR4免疫共沉淀,其中发现了Hsc73。结论Hsc73作为细胞内常见的分子伴侣蛋白,参与了CXCR4在细胞中的转运。对于SDF-1/CXCR4信号通路激活的部分环节起到了关键作用,并可能参与了CXCR4核转位的过程。     

CXCR4短发夹shRNA表达质粒的构建

目的构建趋化因子受体CXCR4shRNA质粒重组体,并进行序列分析,为下一步探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础.方法设计有小发夹结构的两条DNA序列.经退火成互补双链,再克隆至Psilencer2.1-U6 neo质粒载体中构建重组体,转化DH5a菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析.结果成功构建了CXCR4hRNA质粒重组体.结论CXCR4 shRNA质粒重组体的成功构建为研究CXCR4靶向RNA干扰抗肿瘤的作用打下基础.     

siRNA沉默人乳腺癌细胞株CXCR4基因的实验研究

目的 探讨shRNA- CXCR4对人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s细胞CXCR4基因表达及蛋白表达的影响.方法 通过shRNA-CXCR4沉默CXCR4基因后,RT-PCR、Western blotting检测3株人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s的CXCR4 mRNA及其蛋白的表达.结果 shRNA-CXCR4作用于人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s后能明显抑制其CXCR4基因的mRNA及蛋白表达水平(P＜0.05).结论 shRNA-CXCR4能特异性抑制乳腺癌细胞的CXCR4 mRNA及其蛋白的表达.     

靶向人GSK-3β基因的shRNA真核表达质粒的构建及其在人胰腺癌细胞株PANC-1中的稳定表达

目的 构建针对人糖原合成激酶-3β(GSK-3β)基因的shRNA真核表达质粒,并筛选基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体;转染人胰腺癌细胞株PANC-1,建立稳定表达GSK-3β shRNA的细胞模型.方法 针对GSK-3β基因的mRNA序列设计并分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经...     

CXCR4抑制性多肽对不同乳腺癌细胞株中CXCR4表达的影响

目的:探讨CXCR4抑制性多肽(NT21MP)对HER-2受体表达不同的乳腺癌MCF-7细胞和SKBR3细胞CXCR4受体表达的影响。方法:免疫组化法和RT-PCR法检测MCF-7、SKBR3细胞中HER-2与CXCR4的表达;分别用1μg/ml和10μg/mlNT21MP处理乳腺癌SKBR3、MCF-7细胞48h后,用RT-PCR法和Western blot法检测CXCR4 mRNA及其蛋白的表达。结果:CXCR4在乳腺癌细胞SKBR3和MCF-7表达水平相似(P>0.05),HER-2表达水平差异有统计学意义(P<0.01);NT21MP显著下调人乳腺癌细胞SKBR3、MCF-7细胞中CXCR4受体的表达,但存在细胞差异性(P<0.01)。结论:NT21MP能不同程度地下调乳腺癌细胞MCF-7和SKBR3 CXCR4受体表达。     

CXCR4腺病毒表达载体的构建及其在真皮多能干细胞中的表达

目的构建大鼠CXCR4的腺病毒表达载体,并观察其转染真皮多能干细胞(dermal multipotent stem cells,dMSCs)后的表达情况.方法扩增含有CXCR4的全长cDNA,然后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与pAdEasy-1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组产生含有CXCR4的骨架质粒(pAdEasy/CXCR4).将验证正确的pAdEasy/CXCR4用Pac Ⅰ酶切后转染293细胞,从而包装出CXCR4的腺病毒表达载体(Adv-CXCR4).用Adv-CXCR4转染dMSCs,并采用RT-PCR、免疫荧光细胞化学和荧光激活细胞分类计数的方法检测其表达情况.结果PCR、酶切和测序结果证明,成功地将CXCR4全长cDNA克隆到骨架质粒中,并包装出腺病毒表达载体.同时,Adv-CXCR4转染dMSCs后可有效地增加dMSCs中CXCR4的表达.结论CXCR4的腺病毒表达载体的成功构建和其在dMSCs中的表达,为研究CXCR4在干细胞移植中的应用奠定基础.     

CXCR4 和CXCR7 在肾透明细胞癌 组织中的表达及其临床意义

目的 探讨趋化因子受体4（CXCR4）蛋白和趋化因子受体7（CXCR7）蛋白在肾透明细胞癌 （ccRCC）组织中的表达及其相关性。方法 采用免疫组织化SABC 法检测50 例ccRCC 及20 例癌旁正常 组织中CXCR4 和CXCR7 蛋白的表达。结果 ccRCC 组织中CXCR4 和CXCR7 表达高于癌旁正常组织 （P <0.05）;两者表达与ccRCC 组织的临床分期、病理分级及淋巴结转移关系密切（P <0.05）,与性别、年 龄及肿瘤体积无关（P >0.05）;在ccRCC 组织中,CXCR4 与CXCR7 表达呈正相关（r s=0.467,P =0.001）。 结论 CXCR4 和CXCR7 在ccRCC 组织中呈高表达,两者对ccRCC 的发生、发展及转移有协同作用。     

趋化性细胞因子受体CXCR4在肾透明细胞癌中的分布探讨

目的 研究肾透明细胞癌中趋化性细胞因子受体CXCR4的分布。方法 用免疫组织化学的方法对患者癌组织CXCR4的分布进行探讨，结合手术、病理及临床资料，统计学分析CXCR4表达与淋巴结浸润的关系。结果 所有患者CXCR4呈阳性分布，按照免疫组织化学染色模式将肿瘤分为局灶型及弥散型，其中弥散型又分为强阳性和弱阳性。结合临床资料，发现弥散型和局灶型之间以及强阳性和弱阳性之间在局部淋巴转移方面有显著性差异。结论 CXCR4的表达可能与肾透明细胞癌的转移及预后密切相关。     

稳定表达趋化因子受体CXCR4卵巢癌细胞株的建立与鉴定

目的:构建人CXCR4真核表达重组质粒,转染人卵巢癌细胞SKOV3,建立稳定转染细胞系并观察其表达效果.方法:从人卵巢癌组织中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增CXCR4的基因编码序列,将序列定向克隆至真核表达载体pReceiver-M02,经酶切和测序鉴定后用脂质体介导的转染技术将质粒pReceiver-M02-CXCR4导入不表达CXCR4蛋白的SKOV3细胞,经G418抗性筛选得到阳性细胞克隆并扩大培养成系.分别采用RT-PCR,Western blot和免疫细胞化学方法检测稳定转染细胞株CXCR4 mRNA和蛋白的表达.结果:得到了抗G418阳性细胞克隆;RT-PCR的产物约为304 bp;Western blot可见一清晰的蛋白条带,与CXCR4的蛋白分子质量相符合.免疫细胞化学结果显示,转染质粒的SKOV3细胞质和细胞膜出现棕黄色颗粒.结论:成功建市稳定表达趋化因子受体CXCR4的卵巢癌细胞株,为CXCR4在卵巢癌中的研究工作提供依据及平台.     

CXCR4阳性Lewis肺癌细胞具有促发新生血管形成的特征

目的 研究CXCR4阳性Lewis肺癌细胞(LLC)在新生血管形成时的始动作用.方法 激光共聚焦检测LLC细胞系中CXCR4抗原表达情况,观察小鼠移植瘤组织内CXCR4阳性LLC与新生血管的毗邻关系;以CXCR4作为磁珠分选细胞的表面标志,检测CXCR4阳性和阴性LLC中VEGF、MMP9 mRNA表达情况,同时免疫组化检测两亚群细胞移植瘤中VEGF、MMP9以及CD31表达情况.结果 CXCR4阳性LLC多毗邻内皮细胞,周围形成血管样结构;CXCR4阳性LLC的VEGF mRNA表达(0.439 8±0.059)明显高于CXCR4阴性LLC (0.289 9±0.003 1)(P＜0.01);CXCR4阳性LLC的MMP9 mRNA表达(0.622 3±0.013 6)明显高于CXCR4阴性LLC(0.579 2±0.017 4)(P＜0.05);CXCR4阳性LLC移植瘤组织MVD(56.87±4.83)明显高于CXCR4阴性LLC移植瘤(43.52±4.91)(P＜0.01). 结论 LLC中的CXCR4阳性亚群具有更强上调VEGF、MMP9表达的能力,具有促发新生血管形成的特征.     

靶向干扰CXCR7基因表达对肝癌(HCC)细胞增殖及凋亡的影响

 目的  探讨CXCR7基因在不同肝癌细胞系及肝癌组织中的表达情况,并研究靶向抑制CXCR7基因表达对肝癌细胞增殖及凋亡的影响。方法  应用Western blot检测不同肝癌细胞系及10例肝癌组织中CXCR7蛋白的表达水平。采用短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术沉默HCCLM3与MHCC97L细胞中CXCR7基因的表达,分别采用Western Blot和qRT PCR检测shRNA的靶向沉默效果。通过CCK-8增殖实验与Annexin V-FITC/PI细胞双染色研究CXCR7抑制对HCCLM3与MHCC97L增殖及凋亡的影响。结果  CXCR7表达水平与肝癌细胞的恶性程度呈正相关,肝癌组织中CXCR7表达水平较癌旁显著升高。实验成功构建了9个慢病毒表达载体,其中CXCR7 shRNA 566序列干扰效率最高。增殖实验显示干扰表达组细胞生长速度受到明显抑制(P<0.05);流式细胞仪分析显示干扰CXCR7表达可诱导细胞凋亡的发生。结论  CXCR7表达水平与肝癌恶性程度呈正相关,靶向干扰CXCR7表达可抑制细胞的增殖能力,诱导细胞发生凋亡。     

CXCR3在肾细胞癌中的表达及其临床意义

目的 探讨趋化因子受体CXCR3在肾癌中的表达及临床意义。方法 应用组织芯片技术和免疫组织化学染色方法,检测CXCR3在96例肾癌患者的癌组织及其对应的94例癌旁正常的肾组织中的表达水平。对癌旁正常肾组织与肾癌组织中的CXCR3阳性表达率的差异以及与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分期、福尔曼分级等临床病理特征的关系进行分析。结果 CXCR3在肾癌组织中阳性表达率85.4%(92/96),在癌旁正常组织中的表达阳性率为73.4%(69/94),差异有统计学意义（P=0.04）。福尔曼分级高（Ⅲ-Ⅳ）的肾癌组织的CXCR3表达阳性率为36%（94.7）,福尔曼分级低（Ⅰ-Ⅱ）的肾癌组织CXCR3表达阳性率为46%（79.3）,差异有统计学意义（P=0.036）。肾癌组织中CXCR3的表达高低与患者肿瘤最大径（P=0.000）、组织类型（P=0.430）、肿瘤TNM分期（P=0.695）等因素均无关。结论 肾癌组织CXCR3的表达阳性率高于其在癌旁正常组织中的表达,且福尔曼分级高的肾癌组织中CXCR3的表达阳性率高。CXCR3成为肾癌治疗的新靶点。