用荧光强度反映Cbfa1活性成骨细胞模型的构建

目的构建稳定表达由6OSE2启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的MG63细胞株,并筛选出能反映Cbfa1活性的细胞株。方法合成6OSE2启动子的序列,并将其构建到T载体中;然后通过双酶切得到启动子片段;与去除CMV启动子的报告基因载体pEGFP-N1的酶切片段连接,构建真核表达载体;并转染到MG63细胞系,经G418筛选得到了稳定转染6OSE2-EGFP基因的MG63细胞株。用不同浓度的IGF-I和VD3处理,通过EGFP荧光强度分析,ALP活性测定,筛选出能够响应IGF-I和VD3的细胞株。结果构建了pUC-6OSE2扩增载体和p6OSE2-EGFP真核表达载体,通过稳定转染以及IGF-I、VD3筛选获得一株荧光强度随IGF-I和VD3处理而增强的细胞株-OSE-MG63。结论构建了能反应Cbfa1活性的成骨细胞模型,为进一步研究微重力对Cbfa1的转录活性及信号传导途径的影响奠定了基础。     

用荧光强度反映Cbfal活性成骨细胞模型的构建

目的 构建稳定表达由60SE2启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的MG63细胞株,并筛选出能反映Cbfal活性的细胞株.方法 合成60SE2启动子的序列,并将其构建到T载体中:然后通过双酶切得到启动子片段;与去除CMV启动子的报告基因载体pEGFP-Nl的酶切片段连接,构建真核表达载体;并转染到MG63细胞系,经G418筛选得到了稳定转染60SE2-EGFP基因的MG63细胞株.用不同浓度的IGF-I和VD,处理,通过EGFP荧光强度分析,ALP活性测定,筛选出能够响应IGF-I和VD3的细胞株.结果 构建了pUC-60SE2扩增载体和p60SE2-EGFP真核表达载体,通过稳定转染以及IGF-I、VD_3筛选获得一株荧光强度随IGF-I和VD_3处理而增强的细胞株.OSE-MG63.结论 构建了能反应Cbfal活性的成骨细胞模型,为进一步研究微重力对Cbfal的转录活性及信号传导途径的影响奠定了基础.     

稳定转染COL1A1-EGFP基因的ROS17/2.8细胞株的建立

目的 构建稳定表达由COL1A1启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的ROS17／2．8细胞株。方法 用PCR方法从大鼠基因组DNA中扩增出长为3．6Kb的COL1A1(Ⅰ型胶原α1链基因)启动子,并克隆到T载体;然后将COL1A1启动子分段酶切,获得不同长度的启动子片段;与报告基因EG—FP相连接,构建成真核表达载体;随后转染ROS17／2．8细胞系,再用G418筛选。结果 得到了稳定转染COL1A1-EGFP基因的ROS17／2．8细胞株。结论 这些细胞株的建立为研究微重力对COL1A1启动子活性及成骨相关基因表达的影响奠定基础。     

大鼠脑胶质瘤荧光素酶动物模型建模细胞株C6-Luc的构建

目的 构建稳定表达萤火虫荧光素酶的大鼠脑胶质瘤细胞株C6-Luc.方法 通过浓度梯度法测定C6大鼠脑胶质瘤细胞的潮霉素最佳筛选浓度.使用FuGENE HD转染试剂将表达荧光素酶的真核质粒pGL4.50转染至C6细胞,应用潮霉素筛选多克隆细胞株,进一步采用有限稀释法筛选单克隆细胞株.采用报告基因分析对单克隆细胞株进行阳...     

骨唾液蛋白非融合荧光蛋白载体的构建及其在特异性骨转移乳腺癌细胞中的稳定表达

目的 构建骨唾液蛋白(BSP)非融合荧光表达载体,建立稳定高效表达BSP和荧光蛋白的乳腺癌细胞系,为进一步研究BSP在乳腺癌细胞骨转移中的作用奠定基础。方法 从构建好的pB-hBSP载体中用PCR方法扩增hBSP基因,通过BglⅡ和PstⅠ两个限制性酶切位点定向克隆至真核表达载体pIRES2一EGFP,构建重组载体pIRES2-hBSP-EGFP。利用脂质体转染的方法将构建好的重组质粒转入特异性骨转移的乳腺癌细胞株MDA-MB-23180中,并利用G418和流式细胞仪筛选阳性克隆。结果 成功构建hBSP和EGFP非融合表达的真核表达载体pIRES2-hBSP EGFP,并成功转染特异骨转移的乳腺癌细胞株,获得hBSP的稳定转染细胞株,荧光显微镜下可观察到荧光蛋白标记。结论 真核表达载体CRFS2-hBSP-EGFP的构建及hBSP稳定转染细胞株的获得为研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用奠定了的基础。     

利用CRISPR/Cas9系统构建HeLa细胞Cdc25C基因敲除稳定细胞株

目的 使用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除人类宫颈癌细胞HeLa中的细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cell division cycle 25 homolog C,Cdc25C)基因,构建Cdc25C基因稳定敲除细胞株.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性识别Cdc25C基因第一外显子相关序列的上下游小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),构建真核重组表达质粒.测序鉴定后,将重组质粒转染至HeLa细胞中,用嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选稳定敲除Cdc25C基因细胞株,再用免疫印迹方法鉴定细胞Cdc25C敲除效果.最后用流式细胞仪检测基因敲除对细胞周期的影响.结果 筛选出稳定敲除Cdc25C基因细胞株,且Cdc25C敲除显著影响G2/M期进程.结论 利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源Cdc25C基因敲除细胞株,为研究Cdc25C在细胞周期进程的功能以及相关癌症的发生奠定了基础.     

EOLA1基因小干扰RNA载体构建及其干扰效应检测

目的 构建人类新基因内皮高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)特异性的小干扰RNA表达载体,并初步验证其对靶基因的抑制作用。方法 构建绿色荧光蛋白(GFP)-EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP-N2／EOLA1,并转染人ECV304细胞株,G418压力筛选获得稳定表达株;针对靶基因EOLA1,设计靶点特异性的寡核苷酸,插入pSlincer3．1／H1质粒。转染重组质粒到稳定表达GFP-EOLA1融合蛋白的ECV304细胞,通过观察转染细胞绿色荧光的强弱和Westem blot实验检测靶基因的抑制情况。结果 获得了稳定表达GFP-EOLA1融合蛋白的细胞株,构建的小RNA干扰质粒siEOLA1能够抑制靶基因EOLA1的表达。结论 成功构建了针对EOLA1基因的siRNA质粒,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

Schlafen2基因在细胞中的表达及其生物学特性研究

目的:建立Schlafen2(Slfn2)基因稳定表达的细胞系以进一步研究其生物学功能.方法:构建pEGFP- Slfn2真核表达载体;瞬时转染pEGFP- Slfn2载体及其对照载体于NIH/3T3细胞,观察细胞中Slfn2基因的表达及分布;稳定转染pEGFP-Slfn2及其对照空载体于NIH/3T3细胞,G418筛选获得抵制的细胞株,用Northern印迹进一步鉴定Slfn2在各细胞株中的表达情况;利用细胞生长曲线和Transwell细胞侵袭实验检测Slfn2对细胞增殖及迁移能力的影响.结果:本研究获得了稳定表达Slfn2的细胞株,该基因表达的蛋白在细胞核及细胞浆均有分布;稳定表达该基因的细胞株的增殖及迁移能力均显著降低.结论:Slfn2基因可能是一个潜在的肿瘤抑制基因.     

C6细胞表达的人Angiostatin Kringle(1-3)体外抑制血管内皮细胞生长的研究

为研究人AngiostatinKringle( 1 3) [AK( 1 3) ]抑制血管内皮细胞生长的活性 ,利用脂质体法将带有大鼠血清白蛋白分泌信号的人AK( 1 3)基因导入大鼠C6胶质瘤细胞 ,并用G41 8筛选获得目的细胞株。采用电镜、流式细胞术、免疫组化和Westernblot等方法 ,检测转染前后细胞超微结构、细胞周期及AK( 1 3)蛋白表达情况 ,并用人脐静脉内皮细胞增殖实验检测目的细胞株表达的AK( 1 3)蛋白抑制血管内皮细胞生长的活性。结果表明 ,成功转染人AK( 1 3)基因的大鼠C6胶质瘤细胞可稳定表达AK( 1 3)蛋白 ,且具有抗血管内皮细胞增殖活性的良好作用 ,为进一步进行体内抗血管生成基因治疗奠定了基础。     

ShRNA介导的Smad4基因沉默对C2C12成肌细胞纤维化的影响

目的:研究慢病毒介导的Smad4-shRNA对TGF-β1诱导的纤维化进程的影响。方法:(1)设计并选择抑制效能最高的Smad4-shRNA,包装生产慢病毒,转染C2C12成肌细胞,并检测转染后细胞的Smad4表达;(2)根据TGF-β1诱导C2C12成肌细胞向成肌纤维细胞分化的模型,以慢病毒介导的Smad4-shRNA转染细胞,将不同处理的细胞分为A、B、C、D四组,分别为C2C12细胞组、TGF-β1诱导组、C2C12细胞转染组和TGF-β1诱导后转染组。通过荧光Realtime-PCR和Westerblot检测各组collagen I和α-SMA表达水平。结果:(1)慢病毒介导Smad4-shRNA1转染C2C12细胞后,其Smad4 mRNA和蛋白表达显著低于未转染组(P<0.05);(2)TGF-β1诱导组α-SMA和Collagen I mRNA及蛋白表达均显著高于C2C12细胞组(P<0.05);(3)TGF-β1诱导后转染组α-SMA与collagen I mRNA及蛋白表达显著低于TGF-β1诱导组(P<0.05),与C2C12细胞组和C2C12细胞转染组相比则无明显差异(P>0.05)。结论:降低Smad4表达能有效抑制成肌细胞及受TGF-β1诱导成肌纤维细胞的纤维化过程,提示Smad4可能成为拮抗骨骼肌纤维化的靶点。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应（PCR）扩增丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS3基因，克隆至真核表达载体pcDNA3.1(－）中，构建HCV NS3基因真核表达载体pcDNA3.1(－）-NS3;以该质粒转染肝母细胞瘤细胞系epG2细胞，免疫印迹方法（Western blotting)检测转染细胞中HCV NS3蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3-promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法（ELISA）检测细胞中氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性。结果显示，质粒pcDNA3.1(－）-NS3在HepG2细胞瞬时表达HCV NS3蛋白，共转染实验中pcDNA3.1(－）-NS3组的CAT表达活性是空质粒对照组的4．6倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS3蛋白反式激活的靶基因，为深入阐明HCV NS3蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论基础。     

分化抑制因子1促进血管内皮细胞增殖的机制研究

目的探讨分化抑制因子1(Id1)促进血管内皮细胞增殖的机制。方法构建p21启动子介导的报告基因p21-Luc,分别转染Eahy926细胞、Id1抑制(siId1细胞)或诱导表达(pcDNAId1)细胞、E2A抑制或诱导表达细胞,检测荧光素酶报告基因活性。提取Eahy926细胞总蛋白,分别加入Id1抗体、E12抗体和E47抗体,免疫共沉淀,以Eahy926细胞作为对照,Western blotting检测Id1、E12和E47的表达情况。分别转染siId1、pcDNAId1载体于Eahy926细胞,与正常Eahy926细胞同步化培养48h后,行细胞染色,用流式细胞仪检测细胞G1期的DNA含量。结果与Eahy926细胞比较,siId1细胞、pcDNAE2A细胞p21基因启动子介导的荧光素酶活性增强,p21蛋白表达增高(P<0.05,P<0.01);pcDNAId1细胞、siE2A细胞p21基因启动子荧光素酶活性降低,p21蛋白表达减弱(P<0.05)。免疫共沉淀结果显示,Id1免疫共沉淀细胞裂解物中同时检测到E47/E12蛋白,E47/E12沉淀物中也能检测到Id1。与正常Eahy926细胞比较,转染siId1的...     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3与乙型肝炎病毒 X蛋白协同反式激活作用的研究

构建丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白3（NS3）的重组表达质粒pcDNA3.1(－）-NS3和表达乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白的重组质粒pcDNA3.1(－）-X，分别瞬时转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，用免疫印记（Western blotting)方法鉴定病毒基因的表达。两个表达质粒分别及同时与报告质粒pCAT 3-promoter共转染HepG2细胞，检测报告基因氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达水平，酶的活性反映了表达的肝炎病毒蛋白对SV40病毒早期启动子功能的影响。结果显示，两个重组表达载体pcDNA3.1(－）-NS3及pcDNA3.1（－）-X在HepG2细胞均以瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白；单独共转染实验中pcDNA3.1(－）-NS3.1(－）-X组的CAT的表达分别是对照的3．6倍和4．4倍，两种质粒共同转染时酶的表达是对照的8．5倍；表达质粒对CAT酶表达的激活作用呈剂量依赖性。研究表明，HepG2细胞中表达的HCV NS3蛋白和HBV X蛋白均具有反式激活SV40早期启动子的功能，并且两种蛋白的反式激活功能具有协同特性。本实验有助于解释HCV、HBV感染，尤其是共同感染的致病（癌）机制。     

乙型肝炎病毒核心启动子区基因异质性及对其转录活性的影响

从慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染患者外周血中扩增核心启动子（CP) 基因序列，克隆入pGEM-Teasy质粒，随机挑选克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度。结果提示，HBV长期携带者体内有准种共存，CP区内存在热点缺失突变及散在点突变。为了进一步探讨CP区基因异质性对其转录活性的影响，将野生株及不同缺失突变的CP基因片段克隆入pcDNA3.1(-)载体的EcoRI位点，筛选反向克隆，经KpnI和XhoI双酶切后克隆入氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因表达载体pCAT3-basic上，构建重组报告质粒。以Lipo-fectamine PLUS转染试剂转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，用ELISA方法检测CAT表达量，反映了CAT基因上游启动子的转录活性。结果显示，成功构建了重组报告质粒，与野生株比较，HBV CP区准种群的存在不同程度地降低了CP基因的转录活性。     

Dominant negative Ubiquitin-conjugating enzyme E2C sensitizes cervical cancer cells to radiation

Abstract

Purpose: To find the radiation sensitivity of human cervical carcinoma cell lines and to investigate the effect of the dominant negative-Ubiquitin-conjugating enzyme E2C (DN-UBE2C) on cell proliferation and radiation response.

Materials and methods: Radiation sensitivities of human cervical cell lines (SiHa, HeLa, BU25TK, ME 180, and C33A) were analyzed by assessing their cell survival after irradiation by MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) assay. Soft agar cloning assay, growth curve and radiation response of DN-UBE2C stably transfected SiHa and HeLa cell lines were assessed by MTS assay and Clonogenic assay.

Results: Difference in sensitivity to radiation was observed among the cervical cancer cell lines studied. SiHa was found to be the most resistant cell line whereas C33A cells were the most sensitive. The growth rate of SiHa and HeLa transfected with DN-UBE2C was significantly reduced compared to vector control. Furthermore, DN-UBE2C-mediated radiosensitivity was correlated with a significant decrease in resistance to radiation by SiHa and HeLa cells after transfection with the DN-UBE2C when compared to control cultures.

Conclusion: These results suggested that the Ubiquitin-conjugating enzyme E2C (UBE2C) gene is a potential therapeutic target for cervical cancer treatment.     

siRNA真核表达载体构建及对细胞MSTN基因抑制的研究

肌肉生长抑制素是肌肉生长的负调控因子。本研究为了得到有效抑制绵羊MSTN基因的siRNA分子,设计8对siRNA寡聚核苷酸引物,经退火与pSilencerTM4.1-CMV neo连接构建siRNA真核表达载体,转染C2C12细胞后,利用RT-PCR及real time PCR检测干扰效果。结果显示,8条siRNA分子中有3条对MSTN基因有显著的抑制作用,其中psi-mstn-717和psi-mstn-986分子对MSTN mRNA抑制效率分别达到61%和53%。本研究证实载体表达siRNA能有效抑制细胞MSTN mRNA的表达,下一步筛选的siRNA将用于体内实验。