不同培养基和不同体积分数小牛血清对许旺细胞生长状态的影响

背景：许旺细胞目前正越来越多地被运用于神经修复、构建载体细胞等,但如何高效快速地培养获取大量许旺细胞尤为关键。传统方法存在细胞培养周期长、污染率高、生长状况不稳定等不足。 目的：观察比较不同培养基和培养基中不同体积分数血清对许旺细胞的生长、增殖能力的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2008-01/07在昆明医学院神经科学研究所完成。 材料：SPF级新生一两天龄ICR小鼠30只,由昆明医学院动物科提供。DMEM/F12培养液、RPMI 1640培养液、L-DMEM培养液为Gibco公司产品,小牛血清为Hyclone公司产品。 方法：取ICR新生小鼠,无菌条件下取出坐骨神经,组织块消化法体外分离培养许旺细胞,设立4组：DMEM/F12培养液组、RPMI 1640培养液组、L-DMEM培养液组、生理盐水组。每组又分为4个亚组：不含血清、含体积分数为10%,15%,20%小牛血清。各组细胞接种后进行传代培养,使用差速贴壁和阿糖胞苷处理的综合法对许旺细胞进行纯化。 主要观察指标：传代培养后1,3,5,7,9,11,13 d,相差显微镜下观察细胞形态及生长情况,免疫细胞化学染色检测细胞纯度,MTT法绘制细胞生长曲线。 结果：①不含血清时,各组许旺细胞生长状态均较差;添加血清后各组许旺细胞消化传代后6 h即大量贴壁,48 h后出现聚合增殖现象。②含血清的DMEM/F12培养液组、RPMI 1640培养液组、L-DMEM培养液组许旺细胞能较好地生长,纯度均达到90%以上,且DMEM/F12培养液组在细胞纯度、细胞总数方面均略优于RPMI 1640培养液组及L-DMEM培养液组;生理盐水组许旺细胞生长欠佳,纯度也不甚理想。③与生理盐水组比较,DMEM/F12、RPMI 1640及L-DMEM培养液组MTT吸光度值均显著升高(F=92.814,P < 0.05),但此3种基础培养基之间比较无明显差异(F=0.909,P > 0.05)。培养1,3,5,7,9,11,13 d,DMEM/F12、RPMI 1640及L-DMEM培养液组在含不同体积分数小牛血清的条件下MTT吸光度值均存在明显差异(F=50.850,P < 0.05),体积分数为15%时许旺细胞数量最多,且纯度也相对最高。 结论：血清体积分数的变化是许旺细胞培养过程中是主要因素,含体积分数为15%小牛血清血清的DMEM/F12培养液培养许旺细胞效率最高。     

羊水干细胞分泌细胞因子及其对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响

背景：关于细胞移植的功效,重点在于其分泌的促增殖或抗凋亡的细胞因子,羊水干细胞能否分泌相关细胞因子有必要深入分析。 目的：观察分离培养的羊水干细胞分泌细胞因子情况,及其对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的作用。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-12/2009-06在南昌大学第一附属医院高血压病研究所完成。 材料：10例剖宫产孕妇足月羊水,50 mL/例,用于分离培养羊水干细胞,同时留取其产后脐静脉用于分离培养内皮细胞,取前均获孕妇知情同意。 方法：①贴壁法分离培养羊水干细胞,达80%融合时胰酶消化传代,取传至第3代细胞,调整细胞密度为5×108 L-1,分为2组：缺氧羊水干细胞组通入体积分数为2% O2 + 体积分数为5% CO2 +体积分数为93% N2,常规羊水干细胞组通入体积分数为5% CO2 +体积分数为95%空气,两组细胞37 ℃培养24 h,收集各自培养上清液及细胞以备分析。②取体外分离培养的第2代人脐静脉内皮细胞,以2×104细胞/孔的密度接种于12孔板,分为3组：对照组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液2 mL,常规羊水干细胞组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液1 mL +羊水干细胞培养液1 mL,缺氧羊水干细胞组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液1 mL + 缺氧诱导羊水干细胞培养液1 mL,培养3 d,加入10 μg/L 肿瘤坏死因子α诱导细胞凋亡。 主要观察指标：流式细胞仪测定羊水干细胞表面抗原表达,ELISA法测定羊水干细胞分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子情况,RT-PCR法测定细胞因子mRNA的表达,检测内皮细胞增殖率及凋亡率。 结果：培养7 d后羊水干细胞呈长梭形,以漩涡状、辐射状排列,第3代羊水干细胞呈CD29+,CD105+,CD34-。常规培养的羊水干细胞可分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子;缺氧诱导条件下血管内皮细胞生长因子水平明显增加(P < 0.01),其mRNA表达明显上调(P < 0.05),而肝细胞生长因子含量及mRNA的表达均无明显变化(P > 0.05)。与对照组比较,培养3 d后常规羊水干细胞组、缺氧羊水干细胞组内皮细胞数均明显增加(P < 0.05),肿瘤坏死因子α诱导凋亡24 h后内皮细胞凋亡率均明显降低(P < 0.05),且缺氧羊水干细胞组变化幅度大于常规羊水干细胞组(P < 0.05)。 结论：羊水干细胞可分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子,羊水干细胞培养液能促进内皮细胞增殖,抑制内皮细胞凋亡。经缺氧处理后,羊水干细胞分泌血管内皮细胞生长因子的能力增加,对内皮细胞的增殖和凋亡干预作用增强。     

电针诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

背景：目前经报道的成骨诱导方法很多,为骨髓间充质干细胞的成骨诱导提出很多新的思路及方法。但是电针是否能诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化尚不清楚。 目的：尝试应用电针治疗仪诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,评价其作为骨组织工程种子细胞的可行性。 方法：从患者髂后上棘抽取骨髓,分离培养鉴定为骨髓间充质干细胞后,取第3代细胞进行培养。当细胞铺满培养瓶底90%以上时进行胰酶消化,分别以3.0×103/cm2的浓度接种于6孔培养板中。实验随机分为3组：空白对照组：加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培养液;化学诱导组：每孔内加2 mL含10%胎牛血清的L-DMEM培养液,当细胞贴壁生长达到60%~70%汇合时,加入骨诱导剂;电针刺激组：加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培养液,电针刺激,采取连续波输出,基波脉冲频率为50 Hz,基波脉冲宽度0.5 ms,持续作用30 min,共电针刺激28 d。相差倒置显微镜观察细胞形态变化;茜素红染色结果;细胞诱导14,28 d后碱性磷酸酶活性;RT-PCR测定细胞中骨钙素mRNA的表达;Western Blot测定细胞中骨钙素蛋白表达。 结果与结论：①在28 d的诱导过程中,化学诱导组5~7 d细胞汇合成单层,细胞突起互相连接,并可重叠生长而不发生细胞间的接触抑制现象;电针刺激组9 d或10 d发现细胞体积大,呈三角形、多角形或鳞形;空白对照组细胞形态仍然是纺锤状。②化学诱导组和电针刺激组28 d在倒置相差显微镜下均观察到有矿化结节出现,进行茜素红均呈阳性反应,而空白对照组呈阴性反应。③骨髓间充质干细胞在体外进行诱导时化学诱导组和电针刺激组碱性磷酸酶水平在14,28 d高于空白对照组(P < 0.05);且化学诱导组碱性磷酸酶14 d时高于电针刺激组(P < 0.05),但28 d时差异无显著性意义(P > 0.05)。④空白对照组骨钙素mRNA及蛋白含量均低于化学诱导组和电针刺激组(P < 0.05)。提示电针可定向诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。     

黄精含药血清促进骨髓间充质干细胞增殖的效应及机制

背景：近年来,对传统单味中药有效成分、复方中药及含药血清调控骨髓间充质干细胞增殖与分化作用的研究已有报道,但鲜有涉及到机制的研究。 目的：观察黄精含药血清体外对骨髓间充质干细胞增殖的影响,并分析其作用途径与机制。 方法：雄性SD大鼠用于骨髓间充质干细胞的提取;雌性SD大鼠以中药水溶液灌胃后定时取血制备含药血清。全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,将传至P3代的细胞,制备成单细胞悬液接种于96孔培养板后,分别加入黄精含药血清及空白血清,各组血清浓度分别为培养液体积的5%,10%,15%,20%,25%及30%。MTT法检测黄精含药血清对骨髓间充质干细胞增殖的影响;RT-PCR检测各细胞因子mRNA表达;实时PCR检测粒细胞集落刺激因子mRNA表达。 结果与结论：与空白血清组相比,体积分数10%的黄精含药血清具有明显促进骨髓间充质干细胞增殖的作用(P < 0.05),并显著促进粒细胞集落刺激因子mRNA的表达(P < 0.05)。提示体积分数10%的黄精含药血清具有促进骨髓间充质干细胞增殖的作用,可能与其促进粒细胞集落刺激因子mRNA表达有关。     

无血清培养肾癌干细胞及其鉴定

背景：肿瘤干细胞理论的产生,对肿瘤的发生、发展及其发病机制有了更新的认识,为肿瘤研究提供了新的方向,通过无血清培养技术已从许多肿瘤中分离并鉴定出特定的肿瘤干细胞。目前,无血清培养已成为培养肿瘤干细胞的经典培养方法。 目的：运用无血清培养的方法从肾癌细胞中获取肾癌干细胞,并进行鉴定。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-02/2009-02在江苏大学完成。 材料：肾癌细胞株OS-RC-2由上海中科院细胞库提供。 方法：取处于对数生长期的肾癌细胞OS-RC-2,悬浮于预先配好的DMEM/F12无血清培养基中(含表皮生长因子20 μg/L,碱性成纤维细胞生长因子20 μg/L),观察生长情况,培养7 d后运用流式细胞仪测定CD133及CD34的表达。以不含细胞因子的高糖DMEM/F12培养液培养细胞作为阴性对照。另外收集无血清培养7 d的肾癌细胞球,重悬于含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM/F12培养基中,进行干细胞分化实验观察。 主要观察指标：①倒置显微镜下观察肾癌干细胞生长情况。②流式细胞仪检测肾癌干细胞及肾癌细胞中CD133及CD34的表达。③收集无血清培养7 d后的肾癌干细胞重新常规培养并观察其分化情况。 结果：①肾癌细胞接种于含细胞因子的无血清培养基2 d后可见有细胞球生成,7 d后细胞球明显增多,体积增大。对照组肾癌细胞则贴壁生长,未见细胞球生成。②流式细胞仪检测显示,肾癌细胞球中CD133+CD34-表达率(8.33±1.26)%,对照组肾癌细胞表达率(1.24±0.36)%(t =-19.71,P < 0.05)。③肾癌细胞球重新悬浮于含体积分数为10%胎牛血清的培养液2 d后可见细胞球分散为单个细胞,恢复原来贴壁生长特点,CD133及CD34表达与阴性对照相同。 结论：利用含细胞因子表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子无血清培养的方法可以从肾癌细胞中获取肾癌干细胞。     

脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的比较

背景：为避免骨髓间充质干细胞培养过程中应用异种血清的排斥以及提高骨髓间充质干细胞培养效率,制备脐带血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞是目前的研究热点。 目的：比较脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性。 设计、时间及地点：开放性实验,于2006-10/2008-06在中南大学湘雅二医院细胞生物实验室完成。 材料：16份骨髓标本由中南大学湘雅二医院和湖南省湘潭市中心医院提供。 方法：采用Ficoll Paque细胞分离液从16例新鲜成人骨髓穿刺液中分离骨髓间充质干细胞,分别用含体积分数为10%脐带血清、成人自体血清的DMEM/F12培养基培养,取第4代细胞进行实验。流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系分别诱导各组骨髓间充质干细胞定向分化,通过细胞形态观察、免疫表型及免疫化学染色进行鉴定。 主要观察指标：①细胞形态。②骨髓间充质干细胞计数和细胞周期。③表面标志物的鉴定。④免疫组织化学染色观察骨髓间充质干细胞诱导成骨、成脂情况。 结果：①脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞在增殖数量和速度上优于成人自体血清组(P < 0.05)。两种血清培养条件下,只有少数细胞处于活跃的增殖期,脐带血清组S期细胞多于成人自体血清组(P < 0.05)。②脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞表达CD29、CD73、CD105的阳性率均在90%以上,高于成人自体血清组(P < 0.05);而CD31、CD34、CD45的阳性率均在2%以下,CD31阳性率低于成人自体血清组(P < 0.05)。③脐带血清培养的骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞阳性率和脂肪细胞阳性率均高于自体血清组(P < 0.05)。 结论：脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞的纯度和体外诱导分化能力比成人自体血清组高,更适合临床应用。     

树突状细胞-细胞因子诱导杀伤细胞体外抗白血病K562细胞的效应

背景：将细胞因子诱导的杀伤细胞与树突状细胞联合起来治疗恶性肿瘤,将有助于解除部分肿瘤患者T细胞的免疫无能,从而发挥协同抗肿瘤作用。 目的：观察细胞因子诱导的杀伤细胞与树突状细胞共同培养对体外抗白血病K562细胞株的效应。 方法：分离正常人外周血单个核细胞,诱导成树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞。将树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞共同培养3 d作为效应细胞,流式细胞术检测细胞表型;以K562为靶细胞,分别以单个核细胞,细胞因子诱导的杀伤细胞,树突状细胞和树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞为效应细胞,采用MTT法进行体外杀伤实验。 结果与结论：随着效靶比的增加,各组效应细胞对K562细胞的杀伤活性也增加;同一效靶比下,各组效应细胞对K562细胞的杀伤活性不同,其中树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤活性最强,可达(77.88±1.57)%(P < 0.01)。提示树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞抗白血病细胞的作用显著,较单纯应用细胞因子诱导的杀伤细胞或树突状细胞具有更强的抗肿瘤活性。     

大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养条件

背景：间充质干细胞适合生长、培养的条件尚不十分明确,目前对于间充质干细胞的分离纯化以及体外培养亦没有统一的方法,而培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是进行以上实验的重要前提。 目的：寻求适宜有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性。 设计、时间及地点：分组对比观察,实验于2007-04/09在重庆医科大学附属第一医院实验中心完成。 材料：6~8周龄雄性Wistar大鼠1只,体质量120 g,用于间充质干细胞的分离及培养。 方法：采用全骨髓培养法获取间充质干细胞,按不同接种密度(1×106,5×105,1×105,5×104,1×104 cm-2)、血清体积分数(体积分数5%,10%,15%的胎牛血清)、首次换液时间(接种后6,12,24,48,72 h)及pH值(分别为7.0~7.1,7.1~7.2,7.2~7.3,7.3~7.4,7.4~7.5)分组接种,10 d后进行活细胞计数。 主要观察指标：不同培养条件对间充质干细胞生长的影响;倒置显微镜下观察原代及传代间充质干细胞的形态变化;采用四甲基偶氮唑盐法绘制细胞的生长曲线,并计算细胞倍增时间;常规SABC免疫组织化学法检测传代间充质干细胞CD44、CD34的表达;流式细胞仪检测传代间充质干细胞生长周期。 结果：①以1×106,5×105 cm-2密度接种的细胞数较多,余3种接种密度获得细胞数明显低于上述2种密度(P < 0.05)。首次换液时间为48 h获得的细胞数量最多,各组间相比,差异有显著性意义(P < 0.05)。体积分数5%血清组较体积分数10%、15%血清组细胞数量少(P < 0.05)。pH值为7.1~7.2,7.2~7.3的培养液细胞生长活跃,细胞数量多,以pH值为7.0~7.1和pH 7.4~7.5培养的细胞生长缓慢,数量较少。②刚接种的间充质干细胞呈圆形,培养6~8 h后开始贴壁,呈纺锤状或类圆形;约10 d左右细胞基本汇合长满瓶底;传代后,细胞形态以梭形为主;经过一二次传代后,细胞呈放射状或平行排列,形态趋于一致。③传代一二天细胞生长缓慢,生长停滞期;自3 d起,细胞生长进入对数生长期,四五天达到高峰;之后进入平台期,细胞倍增时间约为39.5 h。④传代间充质干细胞存在CD44抗原表达,而CD34呈阴性表达。⑤传代后82.93%的间充质干细胞处于G0/G1期,G2+M+S期细胞占17.07%。 结论：细胞较佳接种密度为5×105 cm-2,合适血清体积分数为10%,首次换液时间为48 h,pH值为7.2左右;在适宜的培养条件下,间充质干细胞在体外生长状态良好,增殖速度快。     

不同体积分数富血小板血浆对犬骨髓间充质干细胞增殖的影响*

背景：间充质干细胞的增殖和分化与富血小板血浆中的血小板浓度密切相关,浓集倍数过小可能达不到应有效应,太大则对骨再生产生抑制作用。 目的：观察不同体积分数的富血小板血浆对犬骨髓间充质干细胞增殖的影响。 设计：细胞学体外观察。 材料：健康12月龄雄性比格犬,由中南大学湘雅医学院实验动物部提供。 方法：取生长良好的第5代犬骨髓间充质干细胞,调整细胞浓度至3×108 L-1,以200 μL/孔接种于96孔板,常规培养24 h后,弃原培养液及未贴附的细胞。取制备好的富血小板血浆凝胶,加入含青霉素、链霉素的无血清低糖DMEM培养基分别稀释成5%,6.25%,7.5%,8.75%,10%共5个体积分数,向上述96孔板中每孔加入200 μL,放入培养箱内,并设立空白对照。 主要观察指标：MTT法观察不同体积分数富血小板血浆对犬骨髓间充质干细胞增殖活性的影响。 结果：与空白对照组比较,干预早期各体积分数的富血小板血浆组均可促进犬骨髓间充质干细胞增殖。随干预时间的延长,体积分数为8.75%,10%富血小板血浆组在第6天增殖速度开始呈缓慢上升,进入平台期;体积分数为5%,6.25%富血小板血浆组细胞数量呈快速增殖,尤以体积分数为6.25%富血小板血浆组为甚。 结论：富血小板血浆可在干预早期显著促进犬骨髓间充质干细胞增殖,其增殖强度与富血小板血浆体积分数相关,低体积分数条件下普遍取得较佳的增殖效应。     

细胞因子诱导杀伤细胞/自然杀伤细胞培养过程中CD16及CD11a的表达变化

背景：由于细胞因子诱导杀伤细胞、自然杀伤细胞上表达的CD16和CD11a均与其介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用和直接接触杀伤的抗肿瘤效应密切相关,因此了解两种细胞扩增过程中这两种分子表达的强弱,对根据免疫效应细胞的最终用途决定两种细胞的最佳收获时机具有重要意义。 目的: 了解细胞因子诱导杀伤细胞和自然杀伤细胞在培养过程中的CD16和CD11a表达的变化规律。 设计、时间及地点：细胞移植免疫学动态观察,于2006-09/2008-03在中山大学附属第二医院完成。 材料：脐血来自本院健康足月妊娠产妇。 方法：采用Ficoll-Hypaque法分离脐血单个核细胞,接种于含体积分数为0.15胎牛血清的IMDM,双抗生素青、链霉素各1×105 U/L 24孔培养板中,在培养体系中加入白细胞介素2、白细胞介素7、白细胞介素15、干细胞因子及FLT3L制备细胞因子诱导杀伤细胞和自然杀伤细胞,每隔3天半量换液及全量补充上述细胞因子。 主要观察指标：流式细胞仪检测CD3+CD56+细胞因子诱导杀伤细胞以及CD3-CD56+自然杀伤细胞在4周培养过程中CD16和CD11a表达的变化。 结果: CD16在细胞因子诱导杀伤细胞、自然杀伤细胞上的表达随着培养时间的延长逐渐增加,在两类细胞上均在培养的第4周达到最高峰,分别为（55.99±3.90）%和（7.86±1.66）%,但CD16在自然杀伤细胞上表达比例较低,整个培养过程中自然杀伤细胞上CD16的均数表达没有超过8%。CD11a在细胞因子诱导杀伤细胞培养的第3周,自然杀伤细胞培养的第2 周达到最高峰,分别为（49.32±6.32）%和（82.31±11.33）%,之后逐渐出现下降,到培养第4周几乎消失。 结论:CD16和CD11a在细胞因子诱导杀伤细胞和自然杀伤细胞上的表达随培养时间呈动态变化,使用单克隆抗体联合细胞因子诱导杀伤细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用效应时,细胞的收获期可在细胞培养的第4周,利用细胞因子诱导杀伤细胞和自然杀伤细胞的直接杀伤效应进行细胞过继免疫,那么收获细胞的时间以细胞培养的第3周为宜。     

Survivin拮抗肽对人胶质瘤U251细胞凋亡的影响

目的探讨Survivin拮抗肽对人胶质瘤U251细胞体外增殖的抑制作用及细胞周期的影响。方法将U251细胞与不同浓度的Survivin拮抗肽进行体外培养,采用四甲基偶氮唑蓝法测定不同浓度的Survivin拮抗肽对U251细胞的生长抑制率;采用流式细胞仪分析细胞周期与细胞凋亡。结果浓度为5、10、20ug／ml的Survivin拮抗肽均能抑制U251细胞的生长,且抑制率与Survivin拮抗肽浓度及作用时间成正比（P〈0．01）。20ug/ml Survivin拮抗肽作用U251细胞72h,抑制率达63．33％。流式细胞仪结果显示,终浓度为5、10、20ug／ml Survivin拮抗肽亦能促进U251细胞凋亡,且随作用浓度增大及作用时间延长凋亡率明显上升（P〈0．01）;20ug／ml Survivin拈抗肽作用U251细胞72h,凋亡率为31．29％。不同浓度的Survivin拮抗肽作用U251细胞72h,随作用浓度增大,G2/M期细胞构成比明显上升（P〈0．01）。结论Survivin拮抗肽对U251细胞增殖具有抑制作用和促进凋亡,其抗胶质瘤细胞增殖作用机制可能为诱导肿瘤细胞凋亡,调控肿瘤细胞周期。     

中药双黄补对体外培养人牙周膜细胞增殖活性的影响

背景：目前的研究大多为单味中药或单一中药成分对体外培养人牙周膜细胞的影响,而中药组方提取液对体外培养细胞影响的研究较少。 目的：观察中药双黄补对体外培养的人牙周膜细胞增殖活性的影响。 设计、时间及地点：对比观察实验,于2008-11/2009-02 在河北医科大学第四医院科研中心完成。 材料：人牙周膜细胞组织选自河北医科大学第四医院口腔科要求手术拔除的埋伏多生牙者。黄连、黄芩、骨碎补均购自河北医科大学第四医院中药房。 方法：采用组织块法体外培养人牙周膜细胞。水提醇沉法制备双黄补提取液。以每 1 mL药液含生药 1 g加入体积分数20%的胎牛血清培养液,稀释成质量浓度为10,25,50,100,150,200,250,500,750,1 000 mg/L,分别作用于体外培养的人牙周膜细胞,以不加双黄补提取液的培养细胞为对照。 主要观察指标：采用四甲基偶氮唑蓝法测定培养细胞增殖活性的变化,应用流式细胞术检测100 mg/L的双黄补提取液对牙周膜细胞周期的变化和对成纤维细胞生长因子18水平的影响。 结果：双黄补对人牙周膜细胞的增殖活性的影响存在质量浓度和时间效应,各质量浓度双黄补均能促进体外培养人牙周膜细胞的增殖活性,其中以100 mg/L质量浓度促增殖活性作用最明显(P < 0.01),相同质量浓度不同作用时间对细胞促增殖活性作用也不同,以48 h作用最明显(P < 0.05)。与对照组相比,100 mg/L的双黄补促进牙周膜细胞成纤维细胞生长因子18水平增高,S期和G2M期细胞数目增多,在48 h最明显。 结论：中药双黄补可增强人牙周膜细胞的增殖活性,具有明显的浓度效应和时间效应。     

壮筋续骨汤含药血清体外培养大鼠成骨细胞的增殖*☆

背景：壮筋续骨汤具有促进胫骨骨折愈合的作用。 目的：观察壮筋续骨汤含药血清对体外培养大鼠成骨细胞增殖的影响。 方法：大鼠灌胃给予壮筋续骨汤后制备含药血清。取第2代生长状况良好出生48 h内的SD大鼠成骨细胞,对照组和壮筋续骨汤组分别加入5%,10%,20%的正常SD大鼠血清和含药血清培养72 h。 结果与结论：MTT法检测发现壮筋续骨汤含药血清对成骨细胞的增殖有明显的促进作用,以10%壮筋续骨汤组作用最明显(P < 0.05)。流式细胞仪检测各组细胞DNA合成期(S期)的比例,发现壮筋续骨汤组处于S期的细胞比例明显大于对照组 (P < 0.05)。说明壮筋续骨汤含药血清能促进成骨细胞DNA的合成,使更多的细胞进入S期,促进体外培养的成骨细胞增殖。     

当归补血汤载药血清干预后骨髓基质细胞中粒细胞集落刺激因子和白细胞介素3的分泌

背景：实验表明,当归补血汤的有效成分多糖对造血干细胞和造血祖细胞的增殖分化存在显著的促进作用,对造血微环境具有重要的调控作用。 目的：观察当归补血汤载药血清干预后小鼠骨髓基质细胞中粒细胞集落刺激因子和白细胞介素3的分泌状况。 方法：分离骨髓基质细胞,于96孔板培养,在相差显微镜下观察细胞形态和生长状况;将细胞分4组,加含有不同剂量的当归补血汤载药血清进行干预,采用MTT法检测各组细胞的增殖活性,ELISA法检测粒细胞集落刺激因子和白细胞介素3的表达情况。 结果与结论：当归补血汤载药血清可明显促进骨髓基质细胞的增殖,促进骨髓基质细胞分泌粒细胞集落刺激因子和白细胞介素3,呈剂量依赖性,含等效剂量载药血清组促增殖作用和促分泌作用优于其他各组,浓度过高可减弱细胞的增殖分泌效应。     

神经干细胞条件培养液对脊髓神经组织细胞生长的作用

目的 探讨不同浓度神经干细胞条件培养液对体外培养脊髓组织中不同细胞成分生长的影响.方法 从胚胎脑组织中分离、培养神经干细胞;从胚胎脊髓中分离脊髓神经组织成分.采用免疫组织化学方法对分离培养的神经干细胞及培养的脊髓神经细胞进行染色鉴定.将脊髓神经组织细胞悬液置于不同浓度的神经干细胞条件培养液中培养.分析不同浓度的干细胞条件培养液对不同细胞成分生长的影响.结果 与对照组比较,30%及50%浓度的神经干细胞条件培养液明显促进人脊髓神经元的生长,而其它浓度条件液对胶质细胞生长作用较强.结论 人胚胎神经干细胞条件培养液对体外培养的脊髓神经元或胶质细胞促生长作用的差异与其浓度有关.     

大鼠内皮祖细胞磁性标记及体外磁共振成像

目的 探讨超微超顺磁性氧化铁(USPIO)对内皮祖细胞(EPCs)生物活性的影响及优化细胞体外磁共振扫描序列.方法 常规培养并鉴定EPCs.USPIO(25 μg/mL)标记EPCs,普鲁士蓝染色计算细胞标记阳性率,台盼蓝染色、MTT比色法等观察细胞生物活性变化.再用100 μL8%明胶将细胞浓度调整为2×106/mL、1×106/mL、5×105/mL、2.5×105/mL,对不同浓度的标记细胞行T2map和T2*map序列扫描.结果 免疫细胞化学染色及Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白染色、荧光素标记的荆豆凝集素-1染色均显示培养细胞为EPCs.普鲁士蓝染色显示USPIO标记5 d后阳性率达(98.45±0.05)%.台盼蓝染色、MTT比色法等证明USPIO标记不影响细胞生物活性.T2map和T2*map体外磁共振扫描显示,弛豫率与细胞浓度呈线性正相关(r1=0.990,P1=0.010;r2=0.975,P2=0.025),且R2*效应的直线斜率为R2也的3.58倍.结论 USPIO可有效标记EPCs,同时对细胞的生物学活性无明显影响.T2*map和T2map序列均可反映不同浓度USPIO标记细胞的信号变化,其中T2*map序列更敏感.

Abstract：

Objective To explore the influence of ultra-small super-paramagnetic iron oxide (USPIO) on the biological activity of endothelial progenitor cells (EPCs) and optimize their MR imaging sequence in vitro. Methods EPCs were cultured and the USPIO particles were inducted as magnetic markers, with the concentration of 25 μg/mL. For different concentrations of cells (2×106/mL, 1×106/mL,5×105/mL and 2.5×10VmL) disposed by 100 μL 8% gelatin, the T2 map and T2* map sequences were used to measure the relaxation time and rate. Results Immunocytochemistry, acetylated low density lipoprotein staining marked with Dil and Ulex europaeus agglutinin Ⅰ staining marked with fluorescein demonstrated that these cells were EPCs. USPIO labeled EPCs efficiently, with (98.45 ±0.05)% positive rate of labeling on the 5th d, and trypan blue staining and MTT assay indicated that it had no significant effect on the stem cell growth and proliferation. The T2 map and T2* map sequences showed that the relaxation rates (R2 and R2*) were linearly related to the cell concentrations in vitro (r1=0.990,P1=0.010;r2=0.975 ,P2=0.025), and the slop of R2* was 3.58 times of the R2's. Conclusion USPIO can label the EPCs efficiently without changing the biological characteristics of cells. Both T2* map and T2 map sequences can test the signal changes with different concentrations of labeled cells, and the former is more sensitively than the later.     

成骨生长肽对人牙周膜细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响

背景：成骨生长肽是新近发现的一种生长因子,具有促进有丝分裂、促进成骨等作用,在组织损伤后的修复过程中发挥了重要的生理作用。 目的：观察成骨生长肽对体外培养的人牙周膜细胞增殖及其碱性磷酸酶活性的影响。 设计、时间及地点：细胞水平的对比观察实验,于2006-02/06在教育部口腔生物医学工程重点实验室完成。 材料：临床上因正畸需要拔除的牙周健康、无龋的新鲜第1前磨牙牙周膜组织。成骨生长肽购于美国Sigma公司。 方法：在体外培养的人牙周膜细胞中加入10-11,10-10,10-9,10-8 及10-7 mol/L不同浓度的成骨生长肽,用四甲基偶氮唑盐比色法检测细胞的增殖率;以流式细胞仪法检测细胞的增殖周期;应用酶联免疫法检测细胞内碱性磷酸酶活性。 主要观察指标：细胞培养第1,2,3天观察细胞增殖情况;第6天观察细胞内碱性磷酸酶活性。 结果：成骨生长肽浓度在10-11~10-7 mol/L时,对人牙周膜细胞的增殖率有明显的促进作用(P < 0.05),最佳作用浓度为 10-9 mol/L。当成骨生长肽浓度在10-9 mol/L时,能明显提高细胞S期所占的比例,从而加速细胞的增殖活动。成骨生长肽在10-11~10-7 mol/L时,能显著提高细胞内碱性磷酸酶活性(P < 0.05),最佳作用浓度为10-9 mol/L。 结论：成骨生长肽可促进人牙周膜细胞的增殖活性,同时可以提高细胞碱性磷酸酶的活性。     

不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响**☆

背景：骨髓间充质干细胞在培养过程中,常在基础培养基中添加一定的血清,最常见的是小牛血清和胎牛血清,但这存在着一定的生物安全性隐患。 目的：观察不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响。 方法：自成年大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,采用全骨髓贴壁法培养。分别以下列血清微环境培养：自身血清组：分离细胞后原代用含大鼠自身血清的培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养;同种异体血清组：分离细胞后原代用含同种异体血清的培养基培养,以后用胎牛血清培养基培养;胎牛血清组：分离后用含胎牛血清培养基培养,以后一直用含胎牛血清培养基培养;DMEM组：分离细胞后原代用不含血清的DMEM培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养。在倒置相差显微镜下观察细胞的形态;细胞的贴比率;生长曲线;流式细胞仪观测细胞表面CD11b、CD45和CD90表达。 结果与结论：大鼠自身血清微环境及同种异体血清微环境细胞形态均一性、在融合度均高于其他组;首次传代天数低于其他组。24,48,72 h贴比率自身血清组、同种异体血清组和胎牛血清组均高于DMEM组(P < 0.01)。在细胞生长曲线中大鼠自身血清组倍增速率最快,其次为同种异体血清组,再者为胎牛血清组,而DMEM组细胞未见明显倍增现象。流式细胞仪检测含血清培养基培养条件下各组第3代细胞CD11b和CD45阳性细胞率均达到98%以上,CD90阳性率小于2%,可以得到纯度较高的骨髓间充质干细胞。但是在无血清微环境条件下,CD11b的阳性率为95.83%、CD90阳性率达2.07%,而CD45阳性率仅为64.79%,可见无血清环境下培养的骨髓间充质干细胞纯度明显低于含血清微环境。提示大鼠自身血清微环境下更有利于骨髓间充质干细胞的贴壁、生长及纯化。     

4-羟基他莫昔芬对泌乳素腺瘤GH3细胞增殖和分泌的影响

目的探讨雌激素受体拮抗剂4-羟基他莫昔芬（OHTam）对泌乳素腺瘤GH3细胞增殖和分泌泌乳素的影响。方法用逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）的方法测定泌乳素腺瘤GH3细胞中雌激素受体-mRNA（ER—mRNA）的表达,并观察在去激素培养条件下以及不同浓度的OHTam和雌二醇（E2）对GH3细胞生长速度、生长抑制率、雌激素受体-mRNA（ER—mRNA）及泌乳素分泌水平的影响。结果在E2（10^-8mol／L）组细胞吸光度为0．561±0．018,抑制率为-0．06,细胞计数、生长抑制率、ER—mRNA及泌乳素分泌水平与去激素培养组差异显著（P〈0．05）;E2（10^-6mol／L）＋OHTam（10^-6mol／L）组吸光度为0．504±0．014,抑制率为0．08,细胞计数、ER—mRNA及泌乳素分泌水平与E2（10^-8mol／L）组差异显著（P〈0．05）。结论泌乳素腺瘤GH3细胞有雌激素受体表达,E2可以促进GH3细胞的增殖和泌乳素的分泌,而雌激素受体拮抗剂OHTam能够有效抑制雌激素的作用。