高通量测序技术在遗传性白内障诊断中的应用研究

目的探讨高通量测序技术在遗传性白内障诊断中的应用价值。方法提取先证者(34岁先天性白内障孕妇)及其家系18例家庭成员外周血全基因组DNA,采用高通量测序法筛查先证者可疑致病突变位点,采用Sanger测序方法验证先证者及其他家庭成员的可疑致病位点,在先证者孕16周时进行羊水穿刺,提取胎儿DNA并采用Sanger测序法进行验证。结果先证者和家系另10例患者均存在GJA3基因(NM_021954.3)c.176 CT位点错义杂合突变,8例表型正常的家系成员和胎儿均未检测到该位点突变。结论 GJA3基因c.176 CT位点错义杂合突变为该家系致病基因突变,该突变位点具有致病性;高通量测序结合Sanger测序技术是一种成本相对较低、速度较快、结果可靠的分子诊断方法,可应用到先天性白内障的诊断及家庭成员的生育指导。     

高通量测序技术对常染色体隐性Alport综合征两个家系遗传特征的实验诊断研究

目的探讨高通量测序(NGS)技术对常染色体隐性Alport综合征(AS)家系不同临床表型个体的实验诊断作用。方法应用靶序列捕获联合高通量测序的方法对2个AS两家系的先证者进行致病基因突变分析,并通过Sanger测序法对先证者及家系其他成员进行验证,综合分析家系成员临床表现、肾脏病理组织学检查与基因检测结果。结果 2例先证者分别检测到COL4A3c.3769GA和COL4A4c.1715GC纯合突变。先证者父母及同胞均为相应突变的杂合子。先证者均表现为典型的AS;除了家系2的1名成员外,其他杂合子成员均表现为良性家族血尿。结论研究明确了2个AS家系致病机理,发现COL4A3,COL4A4基因突变杂合携带者往往表现为良性家族血尿,NGS技术可在常染色体隐性遗传AS家系不同遗传特征的病因诊断中发挥重要作用,对进一步探索疾病发病机制及规范化诊疗有重要意义。     

腓骨肌萎缩综合征患者MFN2基因突变检测的研究

目的 对1个腓骨肌萎缩综合征核心家系的致病突变进行鉴定和遗传学分析.方法 采用全外显子组测序技术筛选先证者中的致病突变,用Sanger测序技术检测核心家系中致病突变位点的基因型,并对其进行生物信息学分析.结果 先证者MFN2基因存在单碱基杂合突变c.1090C>T p.R364W,母亲与妹妹均为该位点单碱基杂合突变,且...     

一角膜营养不良家系的TGFBI基因突变*

摘要:目的对一角膜营养不良家 系的致病基因进行检测,明确该家系角膜营养不良的致病基因突变位点。方法采集先证者及其家系成员外周血标本，提取基因组DNA,采用全外显子组测序筛查先证者致病基因及突变位点，并通过Sanger测序对 先证者及其家系成员DNA样本进行验证。结果全外显 子测序结果显示，先证者5号染色体上的转化生长因子β诱导基因(TGFBI)4号外显子发生c.370 C>T(p.R124C)杂合突变,8号外显子发生c.1007 A>T(p.E336V)杂合突变。Sanger 测序验证 发现患者父亲及家系其他患者TGFBI基因也发生c.370 C>T(p.R124C)杂合突变,患者母亲及家系其他正常成员未见TGFBI基因发生突变。TGFBI基因c.370 C>T(p.R124C)突变与疾病表型共分离。结论TGFBI 基因e.370 C>T(p.R124C)杂合突变 是导致该家系角膜营养不良的致病原因。     

1例男性乳腺癌患者的临床特征及基因突变分析

目的对1例异时性男性乳腺癌和结肠癌患者及其家系成员进行基因突变分析,以明确病因,便于指导临床风险管理决策。方法采用全外显子测序技术对先证者外周血样本进行基因突变分析,结合表型资料,确定候选基因的可能致病位点。应用Sanger测序技术对先证者及其家系成员候选突变位点进行共分离验证。结果在先证者BRCA2基因第11号外显子中发现c.64026406delTAACT (p.Asn2134fs)杂合突变,该突变在乳腺癌信息中心(BIC)、ClinVar数据库中已有报道,为乳腺癌致病性突变。Sanger测序证实其儿子也为该突变的携带者,而其患结肠癌的母亲未检测到该突变。结论 BRCA2基因c.64026406delTAACT突变是该先证者乳腺癌的致病突变位点,而先证者及其母亲所患结肠癌可能为散发。     

1例罕见Melnick-Needles综合征患者基因变异分析

目的 研究1例Melnick-Needles综合征家系的致病基因并为该家系提供遗传咨询依据。方法 采集先证者即1例不明原因骨骼发育异常、身材矮小的青年女性患者及其父母外周血标本,提取基因组DNA,采用家系全外显子组测序(Trio-WES)筛查先证者致病基因及突变位点,并通过Sanger测序进行验证。结果 先证者位于X染色体上的FLNA基因有一杂合变异位点：NM＿001110556.2:c.3562G>A(p.A1188T),父母均为野生型。根据ACMG指南,提示FLNA基因的c.3562G>A突变为1个致病突变位点,与X连锁显性遗传疾病Melnick-Needles综合征相关。国内未见该致病位点报道。结论 确诊1例罕见Melnick-Needles综合征,致病FLNA突变c.3562G>A在国内为首次报道,为患者及家属遗传咨询提供了依据。     

1个糖原累积症家系的分子诊断与产前诊断

目的对1个糖原累积症(glycogen storage disease,GSD)家系进行基因突变分析,并对该家系中的一高危胎儿进行产前分子诊断。方法采集该家系先证者及其父母外周血,采用二代测序方法查找先证者致病基因及突变位点,Sanger测序进行突变验证。确定先证者及其父母基因型后采集羊水标本,采用PCR扩增及直接测序方法进行产前分子诊断。结果该家系先证者为G6PC基因c.648GT纯合突变。双亲均为G6PC基因c.648GT杂合突变。胎儿携带与父母相同的c.648GT杂合突变。结论建立了对GSD进行分子诊断和产前分子诊断的方法,并成功应用于1个GSD家系。     

1个X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良家系的TRAPPC2基因突变分析

目的确定1个迟发性脊椎骨骺发育不良(spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDT)家系的致病基因。方法收集先证者及家系的临床资料,提取先证者及亲属外周血DNA,用高通量测序技术对先证者的COL2A1、COL1A1、MATN3、TRAPPC2、FGFR3等189个骨骼相关基因的外显子编码区测序,对发现的致病突变进行Sanger测序验证,并对家系其他成员进行该突变的检测。结果在先证者TRAPPC2基因第5外显子上发现了1个移码突变c.271_275del CAAGA半合子缺失,为X-SEDT的致病性突变,同时发现患者母亲为该突变的携带者,而患者父亲和妹妹未检测到该突变。结论用靶向二代测序和Sanger测序结合的方法确定了1个X-SEDT家系的移码突变c.271_275del CAAGA半合子缺失,为临床遗传咨询提供了分子依据。     

应用全外显子组测序技术鉴定1个白化病家系致病基因HPS1

目的采用全外显子组测序鉴定1个常染色体隐性遗传白化病家系患者的致病基因,探讨其发病机制。方法采集先证者及其家系成员外周血并提取其基因组DNA,对先证者进行全基因外显子组测序,并结合序列变异生物信息学分析方法,鉴定其致病基因,利用Sanger测序对基因突变位点验证。结果全外显子组测序结果显示,先证者HPS1基因存在由c.1276_1279dupGGAG(p.Asp427fs)移码突变和c.398+5GA剪切位点变异组成的复合杂合突变,而其表型正常的父亲为c.1276_1279dupGGAG(p.Asp427fs)杂合突变,表型正常的母亲为c.398+5GA杂合突变。结论该白化病先证者由HPS1基因c.1276_1279dupGGAG和c.398+5GA复合杂合突变导致,此患者被诊断为Hermansky-Pudlak综合征1型。外显子测序技术可以快速准确地筛查白化病候选基因,并明确其具体临床亚型,有利于临床医师积极干预患者潜在并发症以及改善患者生存质量。     

MITF基因在瓦登伯格综合征Ⅱ型中的突变分析

目的探讨1例瓦登伯格综合征(WS)家系遗传性致病因素,以期通过遗传咨询而实现WS型耳聋的一级预防。方法纳入三代5名家系成员(汉族)为研究对象,详细询问病史,采集外周静脉血并抽提DNA,采用Sanger测序对3大常见耳聋基因和瓦登伯格综合征候选基因进行全序列筛查。结果 MITF基因截短突变c.C763T(p.R255X)在该家系内呈现基因型-表型共分离。结论截短突变c.C763T导致第255位精氨酸密码子突变为终止密码子,蛋白质合成提前终止,很可能为该家系的遗传性致病因素。MITF蛋白正常功能丧失所致的单倍体剂量不足很可能为该突变的致病机制。遗传咨询、婚育指导和产前诊断技术的应用,可避免由该突变导致的后代耳聋。     

TMPRSS3基因的VUS变异在1个耳聋家系中的致病性分析

目的 针对一对耳聋夫妇和其胎儿进行家系全外显子组检测,为该家系遗传咨询提供参考和依据。方法 收集该家系的临床资料,采集孕妇和其配偶的外周血和孕妇羊水,并提取基因组DNA,应用家系全外显子组测序技术进行产前遗传学检测,发现疑似致病位点进行Sanger测序验证;通过Minigene技术针对可能导致异常选择性剪切突变位点进行分析。结果 孕妇携带跨膜丝氨酸蛋白酶3基因(transmembrane serine protease 3,TMPRSS3)的复合杂合疑似致病突变,孕妇配偶携带GJB2基因c.235delC的纯合致病突变。胎儿携带TMPRSS3基因复合杂合突变,分别来源于父亲的意义未明的c.323-8T>C杂合突变以及来源于母亲的c.325 C>T杂合突变;采用Minigene技术检测发现c.323-8T>C杂合突变未导致明显的剪切改变。结论 TMPRSS3基因的复合杂合突变可能是导致孕妇耳聋的原因,GJB2基因纯合突变是导致孕妇配偶耳聋的原因,胎儿携带的TMPRSS3基因复合杂合突变不会导致耳聋,夫妇再生聋儿的几率很小。     

COL2A1基因新发突变导致先天性脊柱骨骺发育不良的遗传分析及产前诊断

摘要:目的?对1例先天性脊柱骨骺发育不良(SEDC)患儿进行基因检测和蛋白质功能预测，确定其致病原因，为家系遗传咨询及产前诊断提供依据。方法?应用高通量测序法对先证者454个骨病相关基因进行检测，对检出的可疑基因突变进行Sanger测序检测，对父母进行验证并对胎儿进行产前诊断。结果?该患儿检出COL2A1基因c.3589G>A(p.Gly1197Ser)杂合错义突变，其父母均未携带该突变，先证者为新发变异，家系中胎儿产前诊断结果提示胎儿未携带与先证者相同的变异。Polyphen2、Mutation Taster软件对其蛋白质功能预测的结果为有害。结论?COL2A1基因c.3589G>A变异是该SEDC家系先证者的致病原因。     

X连锁隐性遗传脑肌酸缺乏综合征1型1家系基因检测与产前诊断

目的 分析脑肌酸缺乏综合征(cerebral creatine deficiency syndrome, CCDS)1型1家系的致病基因突变情况,并进行产前诊断。方法 采集先证者及其父母外周血提取基因组DNA,采用靶向捕获方法对基因组全部外显子区域进行测序,经比对分析发现可疑变异位点,采用Sanger测序法进行验证。明确致病变异后,采集母亲羊水,进行产前诊断并随访。结果 先证者存在SLC6A8基因(NM＿005629) c.1631C>T错义变异,该突变可导致其编码的544位脯氨酸被异亮氨酸代替;先证者母亲存在SLC6A8基因c.1631C>T杂合变异;先证者父亲SLC6A8基因c.1631C>T位点为野生型。Sanger测序显示,胎儿SLC6A8基因c.1631C>T位点为野生型。出生后随访3个月,发育正常,未见CCDS 1型表型。结论 SLC6A8基因c.1631C>T错义变异是该CCDS 1型家系的致病原因,基因诊断和产前诊断可有效降低生育CCDS 1型患儿的风险。     

1例植物固醇血症的家系调查及致病基因突变研究

目的探讨1例植物固醇血症家系及其致病基因突变。方法对1例诊断为植物固醇血症的患者及其家系成员进行家系调查;通过PCR扩增先证者及其家系成员基因组DNA中ABCG5及ABCG8基因的所有外显子及其侧翼序列,采用Sanger测序法对PCR产物进行基因测序;采用Polyphen2及Mutation Taster生物信息学软件预测突变的致病性。结果 Sanger测序法发现先症者及家系成员中存在多个基因突变,其中ABCG5基因发现3个突变,分别为外显子1 c.64CT(p.Q22X)杂合无义突变、外显子10 c.1336CT(p.R446X)杂合无义突变、外显子13 c.1810CG(p.Q604E)杂合错义突变;ABCG8基因发现4个突变,分别为(ATG前)-19TG纯合突变、外显子2 c.161AG(p.Y54C)纯合错义突变、外显子13 c.1895TC(p.V632A)纯合错义突变、外显子4和5间的内含子g.12902TC纯合突变。Polyphen2及Mutation Taster软件预测ABCG5基因中c.64CT及c.1336CT为致病突变,其他基因突变均为非致病性的多态性位点。结论 ABCG5基因c.64CT及c.1336CT复杂杂合突变是该植物固醇血症家系的基因发病机制。     

1个表皮松解性掌跖角化症家系角蛋白9基因检测及产前诊断

目的分析1个表皮松解性掌跖角化症(epidermolytic palmoplantar keratoderma, EPPK)家系角蛋白9(keratin 9, KRT9)基因突变情况,并进行产前诊断。方法收集EPPK家系6例患者及家系所有表型正常成员外周血,提取DNA,采用PCR扩增KRT9基因第1～7外显子,并采用Sanger法进行基因测序检测KRT9基因突变。明确KRT9基因突变后,采集先证者羊水进行产前诊断并随访。结果 6例患者均检测到KRT9基因第1外显子存在c.487CT(p.R163W)杂合突变,该突变可导致其编码的第163位精氨酸被色氨酸代替(p.R163W),家系中表型正常成员该位点均无突变;先证者羊水产前诊断结果示胎儿未携带致病突变c.487CT,新生儿出生后随访12个月,未见EPPK表型。结论 KRT9基因c.487CT(p.R163W)杂合突变是该EPPK家系的致病机制,基因诊断和产前诊断可有效降低生育患病儿的风险。     

Ⅰ型肢根型点状软骨发育不良家系的遗传学分析

目的分析1个Ⅰ型肢根型点状软骨发育不良家系过氧化物酶生物合成因子7(peroxisomal biogenesis factor 7,PEX7)基因突变情况,探讨其致病原因。方法采集先证者留存羊水样本,先证者父母及其外祖父母、舅舅和50例体检健康者外周血,提取基因组DNA,进行全外显子组测序及生物信息学分析,采用Sanger测序法进行验证。结果先证者母亲及先证者外祖母存在PEX7基因c.45₅2dupGGGACGCC位点杂合突变,先证者父亲存在PEX7基因c.527-1G>C剪接位点杂合突变,先证者存在PEX7基因c.45₅2dupGGGACGCC位点和c.527-1G>C剪接位点复合杂合突变;先证者舅舅及先证者外祖父、50例体检健康者2个位点均为野生型。PEX7基因c.45₅2dupGGGACGCC位点突变为已报道的致病性突变;c.527-1G>C剪接位点突变未报道,为可能致病性突变。结论 PEX7基因复合杂合突变可能是该家系Ⅰ型肢根型点状软骨发育不良患儿的致病原因。     

1例肥厚型心肌病家系的产前诊断和遗传分析

目的对1例肥厚型心肌病(HCM)家系的孕妇进行产前诊断和遗传分析,探讨HCM致病基因突变与临床表型的联系。方法搜集该先证者及其家系成员临床资料,提取先证者外周血DNA、羊水细胞DNA、经培养的羊水细胞DNA,二代测序(NGS)筛查先证者的致病基因位点,PCR扩增产物直接测序验证HCM致病候选基因MYH7和MYBPC3的可疑致病突变序列,并检测羊水细胞潜在的致病突变。用遗传学数据资料和Mutation taster、PolyPhen-2、ANTHEPROT等生物信息学软件预测突变的致病性。结果测序结果显示先证者存在MYH7 c.1988GA(p.Arg663His)和MYBPC3 c.151GA (p.Ala51Thr)杂合突变,其父亲表型正常且未检出异常突变,其表型正常的母亲仅携带MYBPC3 c.151GA杂合突变。胎儿仅存在MYH7 c.1988GA杂合突变,而MYBPC3无异常变异。突变效应预测和蛋白质结构功能分析显示这2种错义突变分别影响蛋白质的疏水性和抗原性,且遗传学数据资料显示MYH7 c.1988GA为明确致病性突变。结论先证者MYH7 c.1988GA为新发致病性突变或由于其父母为生殖嵌合所致,MYBPC3 c.151GA突变可能促进HCM的发生。胎儿虽然仅携带MYH7 c.1988GA,但其表型可能仍为HCM。     

类孟买血型FUT1新等位基因及其家系成员的分子遗传学分析——附1例报告

目的 研究1例FUT1基因236delG突变致类孟买血型及其家系成员的血清学和分子遗传学特征。方法 应用血型血清学方法对先证者及其家系成员进行ABO、H、Lewis血型鉴定,同时应用基因检测方法确认其ABO基因;用PCR方法扩增FUT1基因并对扩增产物进行测序分析;用SwissModel在线服务器对先证者FUT1 236delG酶结构进行3D模拟。结果 血清学结果显示：先证者为罕见的类孟买型ABhm, Le(a-b-),先证者父亲为A型,先证者母亲为B型;基因检测结果显示：先证者为AB型,先证者父亲为A型,先证者母亲为B型;测序结果显示先证者母亲FUT1基因有236delG杂合突变,先证者父亲FUT1基因有551＿552delAG杂合突变,先证者FUT1基因为236delG/551＿552delAG杂合突变;先证者FUT1 236delG酶结构3D模拟显示翻译产物为无实际功能的1个alpha螺旋结构。结论 236delG突变是FUT1基因型中的新发现的突变,它和551＿552delAG突变(FUT1^*01N.06基因型)的杂合型会导致类孟买血型的产生。     

罕见耳聋家系GJB2基因新发突变基因检测和产前基因诊断

目的对1个耳聋家系进行耳聋致病基因检测和胎儿产前诊断,探讨建立遗传性耳聋产前诊断规范流程。方法1个耳聋家系,采用耳聋基因芯片对先证者和家系成员进行遗传性耳聋基因突变初筛;采用PCR反应和Sanger测序进行GJB2基因编码区突变分析,采用羊膜穿刺术对胎儿进行突变位点分析。取50例听力正常的健康人DNA作为对照并对新生儿进行随访,检测新生儿听性脑干反应阈值。结果该家系中检测到已知致病性突变c.235del C和c.299del AT,新发突变c.446CA(p.149AlaAsp);在50例正常人的DNA中未检测到c.446CA(p.149AlaAsp)突变;排除羊水母体污染,检测到胎儿携带235del C杂合突变;新生儿听性脑干反应阈值:左耳25db,右耳30db,听力正常。结论突变c.446CA(p.149AlaAsp)可能是该家系中致病性突变,可能是GJB2基因的一种新致病性突变。     

苯丙氨酸羟化酶缺乏症家系PAH基因新发突变分析

目的 对一个苯丙氨酸羟化酶缺乏症(phenylalanine hydroxylase deficiency,PAHD)家系苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)基因进行突变位点检测和分析,探讨此家系发病原因。方法 采用二代测序技术(next generation sequencing,NGS)和多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)对先证者及其父母的静脉血进行PAH基因组测序和外显子缺失、重复分析。结果 先证者找到1个错义突变和1个剪接缺失,分别为:第6外显子c.630T>G和第2外显子c.61-1G>A,这两个变异在人类基因突变数据库(Human Gene Mutation Database,HGMD)中未见报道,根据美国医学遗传学与基因组学学会(America College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)指南判定为临床意义未明和疑似致病性变异;信息软件REVEL预测结果为有害和未知。采用MLPA对先证者进行外显子缺失、重复分析显示PAH基因外显子拷贝数未发现异常。结论 PAH基因6号外显子c.630T>G和2号外显子c.61-1G>A可能是该PAHD家系的致病突变。