沉默p21活化激酶1表达对人黑素瘤A375细胞凋亡及侵袭能力的影响

目的探讨shRNA沉默p21活化激酶1(p21-activated kinase 1, PAK1)基因表达对人黑素瘤A375细胞凋亡、迁移及侵袭能力的影响。方法对数生长期人黑素瘤A375细胞随机分为转染组(转染PAK1特异性shRNA)、阴性对照组(转染NC-shRNA)、空白对照组(不进行转染)。转染后培养72 h,采用实时荧光定量PCR法检测A375细胞PAK1 mRNA相对表达量,采用Western blot法检测A375细胞PAK1及p-PAK1蛋白相对表达量,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力。结果转染后培养72 h,转染组PAK1 mRNA相对表达量(0.45±0.07)、PAK1蛋白相对表达量(0.53±0.01)、p-PAK1蛋白相对表达量(0.21±0.03)均低于阴性对照组(0.98±0.04、0.65±0.02、0.38±0.04)、空白对照组(1.00±0.08、0.67±0.51、0.36±0.02)(P0.05),细胞凋亡率[(11.20±0.21)%]高于阴性对照组[(5.86±0.51)%]、空白对照组[(5.43±0.03)%](P0.05),迁移细胞数[(47.00±2.23)个]、侵袭细胞数[(30.00±4.44)个]较阴性对照组[(76.00±4.85)、(54.00±3.67)个]、空白对照组[(77.90±4.97)、(56.00±4.12)个]少(P0.05),阴性对照组上述各指标与空白对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论沉默PAK1基因表达可促进人黑素瘤A375细胞凋亡,降低其迁移及侵袭能力。     

牛磺酸上调基因1对人绒毛膜癌JEG-3细胞增殖及迁移和凋亡的影响

目的探讨牛磺酸上调基因1(taurine-upregulated gene 1,TUG1)在人绒毛膜癌JEG-3细胞增殖、迁移和凋亡中的作用。方法采用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术构建TUG1慢病毒载体。将对数生长期人绒毛膜癌JEG-3细胞随机分为空白对照组(不作任何处理)、阴性对照组(转染阴性对照靶序列慢病毒载体)和转染组(转染siRNA-TUG1慢病毒载体)。采用实时荧光定量PCR法检测3组TUG1mRNA、caspase-3mRNA、caspase-9mRNA相对表达量,采用Western blot法检测3组TUG1、caspase-3、caspase-9蛋白相对表达量,采用Transwell小室试验检测3组培养24h细胞侵袭能力,采用CCK-8法检测3组细胞培养72h吸光度值,采用流式细胞术检测3组培养72h细胞凋亡率。结果构建siRNA-TUG1载体的慢病毒滴度为3×108 TU/mL;转染72 h,转染组TUG1 mRNA、caspase-3mRNA、caspase-9mRNA相对表达量(0.42±0.02、0.31±0.01、0.21±0.01)低于阴性对照组(1.09±0.03、1.29±0.03、1.02±0.01)和空白对照组(1.01±0.01、1.02±0.02、1.00±0.01)(P0.05),TUG1、caspase-3、caspase-9蛋白相对表达量(0.24±0.07、0.49±0.23、0.11±0.02)低于阴性对照组(7.32±0.05、10.12±1.47、9.98±2.78)和空白对照组(6.08±0.19、9.88±0.93、9.91±1.44)(P0.05);培养24h,转染组迁移细胞数[(52.11±4.09)个]较阴性对照组[(142.11±14.02)个]和空白对照组[(131.32±18.39)个]少(P0.05);培养72h,转染组细胞吸光度值(24.27±3.11)较阴性对照组(51.12±2.47)和空白对照组(60.34±1.24)低(P0.05),细胞凋亡率[(35.21±13.31)%]较阴性对照组[(3.09±1.13)%]和空白对照组[(4.21±1.24)%]高(P0.05);阴性对照组各观察指标与空白对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论 TUG1沉默表达慢病毒载体可明显抑制人绒毛膜癌JEG-3细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡。     

shRNA-FAM-38A基因对宫颈癌CS1213细胞增殖和迁移的影响

目的探讨shRNA-FAM-38A基因在宫颈癌CS1213细胞增殖和迁移中的作用。方法宫颈癌CS1213细胞分为空白对照组、阴性对照组和实验组。空白对照组细胞不转染慢病毒载体,阴性对照组细胞转染无序序列慢病毒载体,实验组细胞转染沉默shRNA FAM-38A慢病毒载体。采用实时荧光定量PCR法检测3组细胞FAM-38A、caspase-3和caspase-9 mRNA相对表达量,采用Transwell小室实验检测3组CS1213细胞迁移细胞数,采用CCK-8实验检测3组细胞增殖率。结果实验组细胞FAM-38A mRNA相对表达量(0.32±0.07)、迁移细胞数[(44.38±5.32)个]、细胞增殖率[(47.54±7.63)%]低于空白对照组[0.95±0.13、(99.72±19.63)个、(144.63±21.75)%]和阴性对照组[1.14±0.23、(119.63±21.87)个、(145.62±11.97)%](P0.05),caspase-3、caspase-9 mRNA相对表达量(5.11±1.21、12.64±2.87)高于空白对照组(0.84±0.09、0.22±0.03)和阴性对照组(0.89±0.12、0.21±0.04)(P0.05),空白对照组FAM-38A、caspase-3、caspase-9 mRNA相对表达量及迁移细胞数、细胞增殖率与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论 shRNA-FAM-38A基因可抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移能力,可作为宫颈癌的潜在治疗靶点。     

DLC-3表达对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响

目的探讨外源性过表达DLC-3对乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移及凋亡活动的影响。方法对数生长期乳腺癌MCF-7细胞分为实验组、阴性对照组和空白对照组,实验组细胞转染DLC-3基因过表达质粒,阴性对照组细胞转染空白质粒,空白对照组细胞仅进行换液处理。3组采用实时PCR法检测细胞DLC-3 mRNA相对表达量;转染12、24 h后,采用细胞划痕实验检测细胞划痕愈合率;转染48 h后,采用CCK-8实验检测细胞增殖率,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果实验组DLC-3 mRNA相对表达量(17 563.57±2 880.85)高于空白对照组(0.56±0.43)和阴性对照组(1.00±0.00)(P0.05),空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义(P0.05);转染48 h后,实验组细胞增殖率[(31.47±5.57)%]低于阴性对照组[(36.27±3.71)%]和空白对照组[(37.90±5.70)%],但差异无统计学意义(P0.05);转染12、24 h后,实验组划痕愈合率[(32.769±4.349)%、(38.237±4.286)%]低于空白对照组[(37.506±1.836)%、(49.052±4.090)%](P0.05),阴性对照组[(35.659±3.970)%、(48.724±5.092)%]与空白对照组比较差异无统计学意义(P0.05);转染48 h后,实验组细胞凋亡率[(15.893±1.597)%]高于阴性对照组[(10.277±1.947)%]和空白对照组[(11.973±1.564)%](P0.05),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论提高MCF-7细胞中DLC-3表达可降低细胞增殖水平,抑制其迁移能力,并促进细胞凋亡。     

同源盒A13在胃癌组织中表达对SGC-7901细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨胃癌组织及癌旁组织中同源盒A13(homeobox gene A13,HOXA13)表达差异,及下调胃癌SGC-7901细胞HOXA13基因表达对细胞增殖和侵袭能力的影响。方法取109例胃癌患者手术切除的胃癌组织和癌旁正常组织,采用免疫组织化学法检测HOXA13蛋白表达;取对数生长期SGC-7901细胞分为转染组(转染siRNA-HOXA13)、阴性对照组(转染siRNA-NC)和空白对照组(不作任何处理),采用MTT法检测转染12、24、48、72、96h时细胞增殖能力,Transwell法检测转染后培养48h时细胞侵袭能力,Western blot法检测转染后培养48h时细胞HOXA13、Twist、E-cadherin和Vimentin蛋白表达。结果胃癌组织HOXA13蛋白阳性表达率(75.23%)高于癌旁正常组织(33.94%)(P0.05);HOXA13蛋白阳性表达率在进展期胃癌(82.98%)、低分化程度(84.93%)、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期(86.27%)、有淋巴结转移者(84.38%)均高于早期胃癌(26.67%)、中高分化程度(55.56%)、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期(65.52%)、无淋巴结转移者(62.22%)(P0.05),在性别、年龄、肿瘤直径上差异均无统计学意义(P0.05);转染组转染后培养24、48、72、96h时吸光度值低于阴性对照组和空白对照组(P0.05),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P0.05);转染组转染后培养48h时侵袭细胞数[(97.14±10.03)个]均较阴性对照组[(115.39±5.77)个]和空白对照组[(125.11±12.45)个]少(P0.05),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P0.05);转染组转染后培养48h时细胞HOXA13、Twist和Vimentin蛋白表达(0.24±0.05、0.34±0.07、0.36±0.04)均低于阴性对照组(0.87±0.11、0.75±0.02、0.75±0.07)和空白对照组(0.88±0.05、0.76±0.05、0.72±0.06)(P0.05),E-cadherin蛋白表达(0.67±0.08)高于阴性对照组(0.33±0.06)和空白对照组(0.35±0.04)(P0.05),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论胃癌组织中HOXA13蛋白呈高表达,其表达程度与肿瘤恶性程度有关;下调SGC-7901细胞HOXA13基因表达可抑制细胞增殖和侵袭能力。     

miR-373对人胃癌SGC7901细胞生物学行为的影响

目的探讨miR-373在人胃癌SGC7901细胞中表达情况及其对胃癌细胞增殖、迁移的影响。方法人胃癌SGC7901细胞和正常胃黏膜上皮GES-1细胞采用反转录PCR法检测miR-373相对表达量。人胃癌SGC7901细胞分为miR-373类似物组、miR-373抑制物组和空白对照组,分别转染miR-373 mimic、miR-373 inhibitor和miR-373 NC。转染后24、36、48、72 h,采用MTT法检测3组细胞增殖率,转染后48 h,采用Transwell小室迁移实验检测迁移细胞数。结果胃癌SGC7901细胞miR-373相对表达量(0.39±0.05)明显高于正常胃黏膜上皮GES-1细胞(0.23±0.04)(P0.05);miR-373类似物组细胞miR-373相对表达量(0.78±0.11)明显高于miR-373抑制物组(0.17±0.02)和空白对照组(0.36±0.06)(P0.05),空白对照组高于miR-373抑制物组(P0.05);转染后24 h,3组细胞增殖率比较差异无统计学意义(P0.05),转染后36、48、72 h,miR-373类似物组细胞增殖率明显高于miR-373抑制物组和空白对照组(P0.05),空白对照组高于miR-373抑制物组(P0.05);转染后48 h,相同面积下miR-373类似物组迁移细胞数[(181.28±11.29)个]明显多于miR-373抑制物组[(61.82±8.29)个]和空白对照组[(109.73±8.22)个](P0.05),空白对照组多于miR-373抑制物组(P0.05)。结论 miR-373可能作为癌基因作用于胃癌组织,且能增强胃癌细胞的增殖和迁移能力。     

磷酸酶及张力蛋白同源物基因对三阴性乳腺癌细胞增殖及侵袭的影响

目的探讨上调磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphate and tension homology deleted on chromsometen,PTEN)基因表达对三阴性乳腺癌细胞增殖及侵袭的影响及其作用机制。方法对数期人三阴性乳腺癌ZR-75-细胞株随机分为PTEN组、突变型PTEN(mutated PTEN,M-PTEN)组和对照组,PTEN组、M-PTEN组分别转染人野生型PTEN真核表达质粒(pBP-PTEN)、突变型PTEN质粒(pBP-M-PTEN),对照组未作处理。转染后24、48、72h,MTT法检测3组ZR-75-1细胞生长抑制率,转染后72h,Transwell法检测3组侵袭细胞比率,流式细胞仪检测细胞周期,Western blot法检测磷酸化局部黏着斑激酶(phosphorylated focal adhesion kinase,P-FAK)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,P-Akt)表达水平。结果 PTEN组PTEN蛋白相对表达量(8.49±2.92)高于M-PTEN组(0.77±0.24)(P<0.05),对照组无PTEN蛋白表达;转染后24、48、72h,PTEN组细胞生长抑制率[(27.33±21.49)%、(37.20±11.48)%、(48.11±8.14)%]均高于M-PTEN组[(5.98±1.44)%、(6.98±2.84)%、(10.83±3.11)%]和对照组[(1.09±0.33)%、(2.10±0.83)%、(4.20±2.71)%](P<0.05),M-PTEN组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);转染后72h,PTEN组侵袭细胞数目[(24.29±5.82)%]低于M-PTEN组[(56.30±11.84)%]和对照组[(89.29±10.49)%](P<0.05),M-PTEN组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);PTEN组G1期细胞比率[(54.89±2.67)%]低于M-PTEN组[(57.02±1.33)%]和对照组[(63.98±1.09)%],S期细胞比率[(36.56±2.10)%]高于M-PTEN组[(35.98±2.67)%]和对照组[(30.78±0.99)%](P<0.05),G2/G1期细胞比率[(1.85±0.33)%]与M-PTEN组[(1.90±1.10)%]和对照组[(1.91±1.00)%]比较差异均无统计学意义(P>0.05),M-PTEN组G1、S、G2/G1细胞比率与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05);PTEN组P-FAK蛋白相对表达水平(0.75±0.12)低于M-PTEN组(2.19±0.82)与对照组(3.23±0.62)(P<0.05),P-Akt蛋白相对表达(2.11±0.42)与M-PTEN组(1.83±0.74)和对照组(1.94±0.53)比较差异均无统计学意义(P>0.05);M-PTEN组P-FAK、P-Akt蛋白相对表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PTEN抑癌基因可通过抑制乳腺癌细胞FAK磷酸化,抑制肿瘤细胞复制,进而抑制乳腺癌细胞增殖及侵袭。     

miR-708对肺腺癌A549细胞增殖和迁移的影响

目的探讨miR-708对人肺腺癌A549细胞增殖及迁移能力的影响。方法对数生长期人肺腺癌A549细胞株随机分为转染组和对照组,转染组通过质粒转染上调miR-708表达,对照组采用常规质粒转染。转染24h,EDU染色后荧光显微镜下观察,计算2组A549细胞增殖率;转染后24、48h,采用细胞划痕实验检测2组A549细胞迁移距离。结果转染24h,转染组A549细胞增殖率[(19.58±1.15)%]较对照组[(42.04±1.04)%]低(P0.05);转染24、48h,转染组细胞迁移距离[(0.47±0.03)、(0.90±0.02)cm]较对照组[(0.75±0.04)、(1.44±0.02)cm]短(P0.05)。结论miR-708可抑制人肺腺癌A549细胞的增殖和迁移能力。     

人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞miR-146a-5p表达及对细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨miR-146a-5p在人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞系中的表达及对SCC9细胞增殖、凋亡的影响。方法取对数生长期人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞和人正常口腔角质HOK细胞,采用实时荧光定量PCR法检测miR-146a-5p mRNA、肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6, TRAF6)mRNA相对表达量。取对数生长期人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞,随机分为观察组(转染miR-146a-5p mimics)和空白对照组(转染等量ddH_2O),转染24、48 h,采用CCK-8法检测2组细胞增殖,FITC-PI荧光双染法检测细胞凋亡;转染24 h,采用实时荧光定量PCR法检测PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相对表达量,Western blot法检测PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量。结果 SCC9细胞miR-146a-5p mRNA相对表达量(8.33±0.58)高于HOK细胞(1.04±0.01),TRAF6 mRNA相对表达量(0.05±0.01)低于HOK细胞(1.05±0.01)(P0.05)。转染24、48 h,观察组SCC9细胞增殖吸光度值(1.65±0.02、1.96±0.04)高于空白对照组(1.33±0.01、1.57±0.02)(P0.05),SCC9细胞凋亡率[(0.89±0.01)%、(1.23±0.01)%]低于空白对照组[(2.77±0.01)%、(4.23±0.01)%](P0.05)。转染24 h,观察组Scc细胞PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相对表达量(2.98±0.05、8.20±0.06、5.34±0.03)高于空白对照组(1.05±0.01、1.03±0.01、1.07±0.01),PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量(2.32±0.01、10.23±0.02、5.25±0.01)高于空白对照组(0.62±0.01、4.58±0.01、0.09±0.01)(P0.05)。结论 SCC9细胞miR-146a-5p表达上调,TRAF6表达下调;miR-146a-5p可促进SCC9细胞增殖,抑制其凋亡,其机制可能是增强PI3K/Akt/mTOR信号通路表达。     

miR-577对胶质瘤细胞上皮-间质转化的调控作用及机制

目的探讨miR-577调控胶质瘤细胞上皮-间质转化活性的机制。方法将人源性胶质瘤细胞U87细胞分为miR-577类似物组、miR-577抑制物组和空白对照组,分别转染miR-577 mimic、miR-577 inhibitor和miR577-NC。转染24 h后,采用划痕实验检测各组细胞迁移距离,采用Transwell小室实验检测各组细胞侵袭细胞数,采用反转录PCR法检测各组细胞β-catenin mRNA表达水平,采用Western blot法检测各组细胞vimentin、E-cadherin蛋白相对表达量。结果 miR-577抑制物组、空白对照组、miR-577类似物组细胞迁移距离[(3.44±0.55)、(2.13±0.21)、(1.04±0.14)mm]、侵袭细胞数[(128.50±8.11)、(84.60±4.20)、(39.80±6.01)个]、细胞β-catenin mRNA相对表达量(0.80±0.06、0.61±0.04、0.45±0.06)和vimentin蛋白相对表达量(0.82±0.06、0.67±0.08、0.31±0.02)均依次降低(P0.05),E-cadherin蛋白相对表达量(0.44±0.04、0.76±0.05、0.89±0.08)依次增高(P0.05)。结论 miR-577可能作为抑癌基因,通过阻断Wnt/β-catenin信号通路的活性,降低人源性胶质瘤U87细胞上皮-间质转化活性,从而抑制肿瘤发展。     

Krüppel样因子4对HeLa细胞生物学行为的影响

目的探讨Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4, KLF4)对HeLa细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法 HeLa细胞和正常宫颈上皮Ect1/E6E细胞采用Western blot法检测KLF4蛋白相对表达量。对数生长期人HeLa细胞分为对照组、HeLa/KLF4组和阴性对照组,其中对照组细胞正常培养,不进行转染;HeLa/KLF4组和阴性对照组细胞分别转染人KLF4表达质粒和KLF4空载质粒;采用CCK-8增殖实验检测转染24、48、72 h后3组细胞生长抑制率,采用CCK-8黏附实验检测细胞黏附能力,采用Transwell侵袭和迁移实验检测3组细胞侵袭细胞数和迁移细胞数。结果 HeLa细胞中KLF4蛋白相对表达量(0.22±0.03)低于正常宫颈上皮Ect1/E6E细胞(0.78±0.10)(P0.05),HeLa/KLF4组细胞中KLF4蛋白相对表达量(0.75±0.09)高于阴性对照组(0.32±0.04)和对照组(0.34±0.05)(P0.05),阴性对照组与对照组比较差异无统计学意义(P0.05);转染24、48、72 h,HeLa/KLF4组细胞生长抑制率均高于阴性对照组和对照组(P0.05),阴性对照组与对照组比较差异无统计学意义(P0.05);培养1、2 h后,HeLa/KLF4组细胞黏附能力低于阴性对照组和对照组(P0.05),培养3、4 h后3组细胞黏附能力比较差异无统计学意义(P0.05);培养24 h后,HeLa/KLF4组侵袭细胞数[(28.48±4.33)个]和迁移细胞数[(97.73±17.88)个]明显低于对照组[(69.34±8.58)、(220.68±34.25)个]和阴性对照组[(62.25±6.78)、(208.14±25.83)个](P0.05),对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 KLF4在宫颈癌中可能起抑癌基因的作用,对宫颈癌细胞增殖、生长有抑制效果,并可降低癌细胞的黏附能力、侵袭和迁移能力,KLF4有可能成为宫颈癌发生、发展研究的新靶点。     

miR-326靶向MAPK/MEK信号通路抑制食管鳞状细胞癌恶性生物学行为

目的探讨miR-326靶向MAPK/MEK信号通路对食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。方法 20例食管鳞状细胞癌患者,取手术切除食管癌组织和癌旁正常组织,采用实时荧光定量PCR法检测miR-326mRNA和MAPK mRNA相对表达量,采用免疫组织化学法检测MAPK蛋白表达。3种食管癌细胞系(KYSE150、EC9706、TE-9)和人正常食管上皮细胞系Het-1A,采用实时荧光定量PCR法检测细胞miR-326 mRNA和MAPK mRNA相对表达量,Western blot法检测细胞MAPK蛋白相对表达量。将对数生长期EC9706细胞随机分为miR-326组、转染对照组和空白对照组,miR-326组和转染对照组分别转染miR-326 mimic和mimic NC,空白对照组细胞不作任何处理,采用Western blot法检测细胞MAPK、p-MEK、p-ERK1、p-ERK2和p-C-Jun蛋白相对表达量,克隆形成试验检测细胞克隆形成率,划痕试验检测细胞划痕闭合率,Transwell小室试验检测细胞侵袭,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。结果食管癌组织miR-326 mRNA相对表达量低于癌旁正常组织(P0.05),MAPK mRNA相对表达量高于癌旁正常组织(P0.05)。KYSE150、EC9706和TE-9细胞miR-326 mRNA相对表达量均低于Het-1A细胞(P0.05),MAPK mRNA和MAPK蛋白相对表达量高于Het-1A细胞(P0.05),且EC9706细胞MAPK蛋白相对表达量最高。miR-326组细胞MAPK 3'UTR WT荧光素酶活性(0.53±0.05)明显低于转染对照组(1.22±0.14)(P0.05),MAPK 3'UTR MUT荧光素酶活性(0.86±0.06)与转染对照组(0.91±0.11)比较差异无统计学意义(P0.05)。miR-326组细胞MAPK蛋白相对表达量(0.32±0.15)低于转染对照组(0.88±0.07)和空白对照组(0.91±0.06)(P0.05),细胞克隆形成率[(21.30±0.55)%]、划痕闭合率[(29.47±4.12)%]和侵袭细胞数[(113.86±3.15)个]低于转染对照组[(75.43±0.81)%、(80.52±2.51)%、(427.27±4.25)个]和空白对照组[(79.13±0.65)%、(83.44±1.87)%、(468.10±3.38)个](P0.05),G_0/G_1期细胞比率[(63.15±1.20)%]和细胞凋亡率[(18.54±0.60)%]高于转染对照组[(41.18±0.60)%、(5.28±1.30)%]和空白对照组[(45.11±0.80)%、(4.13±0.90)%],S期和G_2/M期细胞比率及p-MEK、p-ERK1、p-ERK2和p-C-Jun蛋白相对表达量低于转染对照组和空白对照组(P0.05),转染对照组与空白对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论 miR-326靶向抑制MAPK/MEK信号通路的激活,影响食管鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡。     

RNA干扰沉默survivin基因对食管癌Eca-109细胞放射敏感性的影响

目的探讨RNA干扰沉默survivin基因对食管癌Eca-109细胞放射敏感性的影响。方法构建靶向survivin基因特定序列的小干扰RNA(small interfering,siRNA)真核表达干扰质粒pRNAT-siRNA-survivin转染食管癌Eca-109细胞为干扰组,构建阴性对照质粒pRNAT-siRNA-control转染Eca-109细胞为阴性对照组,未转染的Eca-109细胞为空白对照组,3组采用Western blot检测survivin蛋白表达水平。取对数生长期干扰组Eca-109/si-survivin细胞和空白对照组Eca-109细胞,在直线加速器下分别给予6Gy的X线照射,分别为干扰+X线照射组和单纯X线照射组(X线照射组),采用流式细胞术检测各组细胞凋亡指数,采用MTT法分析细胞存活分数。结果干扰组细胞survivin蛋白表达水平(18.75±3.12)较阴性对照组(44.17±3.15)和空白对照组(46.20±2.62)明显下调(P0.05);干扰+X线照射组细胞凋亡指数[(29.56±0.74)%]明显高于空白对照组[(4.35±0.15)%]、阴性对照组[(4.32±0.32)%]、干扰组[(9.24±0.35)%]和X线照射组[(22.17±0.75)%],差异均有统计学意义(P0.05),干扰组和X线照射组明显高于空白对照组和阴性对照组(P0.05);干扰+X线照射组细胞存活分数[(19.54±1.12)%]明显低于空白对照组[(95.35±1.40)%]、阴性对照组[(93.45±1.38)%]、干扰组[(70.96±0.85)%]和X线照射组[(35.84±0.52)%](P0.05),干扰组和X线照射组明显低于空白对照组和阴性对照组(P0.05)。结论靶向survivin的siRNA能特异性沉默survivin基因表达,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,进而增强人食管癌Eca-109细胞的放射敏感性。     

慢病毒介导的IGF-1R基因沉默对肝细胞癌的增殖和迁移的影响

目的探讨慢病毒介导的胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)基因沉默对肝细胞癌的增殖和迁移的影响。方法设计并筛选高效特异性胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)基因的小干扰RNA,构建稳定遗传的慢病毒载体质粒,观察其转染沉默IGF-1R基因的肝癌细胞株Huh7细胞增殖、迁移以及侵袭能力,进一步观察其对PI3K/Akt及Bax/Bcl-2通路的影响。结果采用倒置相差荧光显微镜观察转染效果,镜下可见较多细胞特异性表达GFP绿色荧光,转染率超过80%。scrambled阴性对照组以及空白对照组IGF-1R mRNA及蛋白的相对表达量显著高于LV-IGF-1R-RNAi转染组(P0.01)。成功转染后,培养细胞72 h、96 h,LV-IGF-1R-RNAi转染组增值率显著低于scrambled阴性对照组以及空白对照组(P0.05或P0.01)。侵袭实验和迁移实验均证实细胞明显受到抑制(P0.01)。蛋白免疫印迹法显示,LV-IGF-1R-RNAi转染组p-PI3K、p-Akt及Bcl-2相对表达量显著低于scrambled阴性对照组以及空白对照组(P0.05);而Bax显著高于scrambled阴性对照组以及空白对照组(P0.05)。结论RNAi技术沉默IGF-1R基因表达能显著抑制肝癌细胞株Huh7细胞的增殖、侵袭作用,而这一作用可能与抑制PI3K/Akt通路蛋白磷酸化及调节Bax/Bcl-2通路蛋白表达有关。     

N-myc下游调节基因2在子宫内膜癌组织中表达及意义

目的探讨N-myc下游调节基因2(N-myc downstream-regulatedgene 2,NDRG2)在子宫内膜癌组织中的表达,及对肿瘤细胞增殖、侵袭的影响。方法行根治性切除术子宫内膜癌患者77例,手术切除的肿瘤组织为子宫内膜癌组,癌旁正常组织为癌旁组,采用实时荧光定量PCR法检测2组NDRG2基因表达,并分析其表达与临床病理特征的关系。将对数生长期子宫内膜癌HEC-1A细胞随机分为NDRG2抑制组(转染NDRG2干扰序列)、NDRG2正常表达组(转染NDRG2干扰对照序列)、空白对照组(不作任何处理),采用实时荧光定量PCR法检测3组转染48 h NDRG2基因表达,CCK-8法检测3组转染48、96 h增殖活力,划痕试验检测3组转染后培养12、24 h迁移能力,Transwell小室法检测3组转染48 h侵袭能力。结果子宫内膜癌组NDRG2 mRNA相对表达量(1.30±0.11)低于癌旁组(1.95±0.15)(P<0.05);FIGO分期Ⅱ~Ⅳ期、中低分化、有淋巴结转移者NDRG2 mRNA相对表达量(1.16±0.07、1.14±0.10、1.24±0.07)低于FIGO分期Ⅰ期、高分化、无淋巴结转移者(1.52±0.13、1.56±0.17、1.48±0.12)(P<0.05);转染48 h,NDRG2抑制组NDRG2 mRNA相对表达量(0.48±0.11)低于NDRG2正常表达组(1.07±0.08)、空白对照组(1.09±0.16);转染48、96 h,NDRG2抑制组增殖活力吸光度(optical density,OD)值(0.47±0.06、0.76±0.03)高于NDRG2正常表达组(0.33±0.07、0.58±0.03)、空白对照组(0.36±0.08、0.61±0.02)(P<0.05);NDRG2正常表达组、空白对照组转染48 h,NDRG2 mRNA相对表达量及转染48、96 h增殖活力OD值比较差异均无统计学意义(P>0.05);NDRG2抑制组转染后培养12、24 h划痕愈合率[(14.32±2.17)%、(34.28±4.95)%]及侵袭细胞数[(122.91±8.87)个]均高于NDRG2正常表达组[(7.14±1.52)%、(12.73±3.02)%、(104.21±2.94)个]、空白对照组[(6.82±1.24)%、(11.64±2.86)%、(99.71±5.40)个](P<0.05),NDRG2正常表达组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论NDRG2在子宫内膜癌组织中呈低表达,下调NDRG2基因表达可促进子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、迁移和侵袭。     

小干扰RNA抑制成纤维细胞激活蛋白3的表达对肺癌干细胞增殖和侵袭的影响

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)抑制成纤维细胞激活蛋白3(fibroblast activation protein 3,FAP3)基因表达对肺癌干细胞增殖和侵袭的影响。方法:采用流式细胞术从肺癌细胞株A549中分选出CD44+/CD133+的肺癌的肿瘤干细胞(cancerstem cells,CSCs)。将肺癌CSCs分为3组:空白对照组(不转染任何质粒)、siRNA-FAP组(转染靶向沉默FAP3表达的siRNA质粒)、阴性对照组(转染包含随机序列的siRNA质粒)。采用MTT比色法检测靶向FAP3表达的siRNA(siRNA-FAP3)转染12、24、48和72h后对细胞增殖的影响;采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法和蛋白质印迹法(Western blot)分别检测转染72h后细胞株中FAP3、Ki67的mRNA和蛋白质的表达情况;采用软琼脂克隆集落形成实验检测siRNA-FAP3对肺癌CSCs侵袭能力的影响。结果:转染48h和72h后,siRNA-FAP3组的细胞增殖抑制率[(24.67±1.08)%,(53.98±3.75)%]大于阴性对照组[(3.76±0.88)%,(4.53±1.01)%]及空白对照组[(2.34±0.41)%,(3.28±0.65)%],差异均有统计学意义(P分别<0.05和0.01)。转染72h后,siRNA-FAP组细胞中FAP3和Ki67基因的mRNA表达水平(0.32±0.06,0.18±0.02)显著低于阴性对照组(1.03±0.12,0.99±0.17)和空白对照组(1.02±0.09,0.97±0.11),差异有统计学意义(P<0.01)。转染72h后,siRNA-FAP组细胞中FAP3和Ki67蛋白表达水平(0.16±0.05,0.25±0.09)显著低于阴性对照组(0.49±0.26,0.47±0.13)和空白对照组(0.59±0.27,0.63±0.22),差异有统计学意义(P<0.05)。siRNA-FAP组细胞克隆形成率[(13.09±5.21)%]显著低于阴性对照组[(77.59±8.29)%]和空白对照组[(83.86±10.11)%],差异有统计学意义(P<0.01)。结论:转染siRNA可有效抑制肺癌CSCs中FAP3蛋白的表达,并且还可抑制CSCs的体外增殖和侵袭能力。     

微小RNA-126对卡波西肉瘤细胞迁移和侵袭能力的影响

目的探讨卡波西肉瘤细胞系转染微小RNA-126(microRNA-126,miR-126)后对细胞迁移和侵袭能力影响。方法卡波西肉瘤细胞株SLK随机分为miR-126模拟物组、阴性对照组、miR-126抑制物组和抑制物阴性对照组,分别将miR-126模拟物25ng、阴性对照25ng、miR-126抑制物250ng和抑制物阴性对照250ng加入转染试剂3μL,室温孵育10min形成转染混合物,分别转染到4组细胞悬液中,孵育48h后行Transwell小室迁移实验和侵袭实验,将Transwell小室基底膜完整切除,行苏木精染色,光学显微镜下计数细胞迁移数目和细胞侵袭数目。结果 miR-126模拟物组细胞迁移数目[(77.33±7.02)个]和细胞侵袭数目[(25.67±2.52)个]较阴性对照组[(96.67±6.11)、(45.67±2.08)个]、miR-126抑制物组[(138.00±8.00)、(76.67±4.16)个]和抑制物阴性对照组[(101.33±9.29)、(47.33±1.53)个]少(P0.05);miR-126抑制物组细胞迁移和侵袭数目较阴性对照组和抑制物阴性对照组多(P0.05);阴性对照组细胞迁移和侵袭数目与抑制物阴性对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 miR-126对卡波西肉瘤细胞侵袭和迁移起抑制作用,可能成为卡波西肉瘤的潜在治疗靶点。     

转化生长因子-β_1对人牙周膜干细胞生物学行为的影响

目的探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)增殖和迁移能力的影响及作用机制。方法对数生长期人PDLSCs随机分为TGF-β1组(培养液+10μg/L TGF-β1)和对照组(培养液),采用CCK-8法检测2组培养第1、2、3、4、5、6、7天细胞增殖能力;培养48h,采用Transwell小室法检测2组细胞迁移能力,Western blot法检测2组Notch1胞内段(Notch1intracellular domain,NICD)蛋白相对表达量。结果 TGF-β1组培养第1天细胞吸光度值(0.45±0.02)与对照组(0.45±0.03)比较差异无统计学意义(P0.05),培养第2、3、4、5、6、7天细胞吸光度值(0.81±0.08、1.82±0.07、2.14±0.09、2.49±0.11、2.69±0.12、2.78±0.08)均高于对照组(0.61±0.04、1.17±0.05、1.47±0.10、1.99±0.11、2.20±0.03、2.29±0.08)(P0.05);培养48h,TGF-β1组迁移细胞数目[(61.40±2.30)%]较对照组[(31.80±1.48)%]多,NICD蛋白相对表达量(0.49±0.01)较对照组(0.35±0.01)高(P0.05)。结论 TGF-β1可激活Notch1信号通路,促进人PDLSCs增殖和迁移。     

卵泡抑素样蛋白5对HCCLM3细胞迁移和侵袭的影响

目的探讨卵泡抑素样蛋白5(follistatin-like 5,FSTL5)在不同肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞株中的表达及在HCCLM3细胞迁移、侵袭中的作用。方法取对数生长期HCC细胞(SMMC-7721、HepG2、HCCLM3、MHCC97H、PLC)和永生化正常肝上皮细胞LO2,采用实时荧光定量PCR法检测FSTL5mRNA相对表达量。将对数生长期HCCLM3细胞随机分为转染组和对照组,转染组转染FSTL5的表达质粒,对照组转染空白质粒;转染24h,采用实时荧光定量PCR法检测2组HCCLM3细胞FSTL5mRNA相对表达量,划痕愈合试验检测HCCLM3细胞迁移能力,Transwell小室法检测HCCLM3细胞侵袭能力,三维培养实验检测HCCLM3细胞伪足生长情况。结果FSTL5mRNA相对表达量在SMMC-7721(0.37±0.03)、HepG2(0.43±0.03)、HCCLM3(0.19±0.02)、MHCC97H(0.28±0.02)、PLC细胞(0.35±0.01)均低于LO2细胞(1.04±0.04)(P0.05),且在HCCLM3细胞表达量最低(P0.05);转染24h,转染组HCCLM3细胞FSTL5mRNA相对表达量(12.04±1.42)明显高于对照组(1.00±0.25)(P0.05),划痕愈合率[(24.7±2.4)%]、侵袭细胞数目[(11.7±2.3)%]均明显低于对照组[(86.7±3.7)%、(34.7±5.9)%](P0.05);三维培养实验结果显示,转染组HCCLM3细胞克隆球未见伪足生成,对照组可见少量伪足生成且延展性较好。结论 HCC细胞(SMMC-7721、HepG2、HCCLM3、MHCC97H、PLC)中FSTL5表达明显降低,过表达FSTL5可抑制HCCLM3细胞迁移和侵袭。     

沉默囊性纤维化跨膜传导调节因子对大鼠海马神经元细胞线粒体功能及氧化应激的影响

目的探讨沉默囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)在大鼠海马神经元细胞线粒体功能及氧化应激中的作用。方法18只SD大鼠随机分为CFTR小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)组、阴性对照组、空白对照组各6只。分离3组海马神经元细胞,取对数生长期细胞进行实验。CFTR siRNA组神经元细胞转染CFTR siRNA,阴性对照组转染阴性对照siRNA,空白对照组不转染。转染后培养48 h,采用Western blot法检测3组神经元细胞线粒体CFTR蛋白相对表达量,JC-1荧光探针检测线粒体膜电位,荧光分光光度法检测线粒体活性氧(reactive oxygen species,ROS)和过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)表达,氧电极法测定线粒体呼吸控制率(respiratory control rate,RCR),荧光素酶发光法检测线粒体三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)浓度,高效液相色谱法检测线粒体谷胱甘肽(glutathione,GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)表达。结果转染后培养48 h,CFTR siRNA组神经元细胞线粒体CFTR蛋白相对表达量(0.09±0.01)、线粒体膜电位[(247.16±34.28)mV]、ATP[(11.71±2.54)mol/g]、RCR(4.69±0.82)、GSH[(0.71±0.12)nmol/μg]、GSH/GSSG值(0.31±0.08)低于空白对照组[0.42±0.07、(432.18±56.04)mV、(24.18±3.64)mol/g、7.94±1.21、(1.62±0.23)nmol/μg、1.65±0.27]和阴性对照组[0.38±0.06、(434.07±52.13)mV、(22.97±3.43)mol/g、7.83±1.18、(1.57±0.21)nmol/μg、1.63±0.24](P<0.05),线粒体H2O2水平(1.73±0.11)高于空白对照组(1.00±0.02)和阴性对照组(1.08±0.06)(P<0.05);空白对照组神经元细胞线粒体CFTR蛋白相对表达量及线粒体膜电位、ATP、RCR、H2O2、GSH、GSH/GSSG值与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论沉默大鼠神经元细胞线粒体CFTR可引起海马神经元细胞线粒体功能障碍,增强氧化应激反应。