白念珠菌耐氟康唑相关基因点突变的检测

目的 探讨ERG11、TAC1、MRR1和UPC2点突变与白念珠菌氟康唑耐药之间的关系.方法 收集耐氟康唑的白念珠菌,尿素裂解法提取DNA,PCR扩增ERG11基因全长以及TAC1、MRR1和UPC2基因的相应片段,送交测序.结果 ERG11基因发现8种点突变,即D116E、Y132H、Y132F、K143Q、T229A、E266D、G448E和G464S,其中K143Q此前未见文献报道.UPC2基因发现1种点突变G648D.TAC1和MRR1基因中均未检测到相应点突变.结论 ERG11点突变与耐药的关系比较明确,TAC1、MRR1和UPC2点突变与耐药的关系有待进一步研究.     

携带G487T和T916C的白念珠菌ERG 11及外流泵基因表达与氟康唑耐药的关系

目的:检测携带相同突变的耐氟康唑白念珠菌多个耐药基因的表达。方法:选取耐氟康唑白念珠菌14株(均携带相同的ERG11突变G487T和T916C),氟康唑敏感白念珠菌14株,通过实时定量PCR反应检测两组多个耐药基因的表达。结果:14株携带相同突变的耐氟康唑白念珠菌主动外排基因CDR1和CDR2 mRNA表达较敏感组显著增加(P0.01);而ERG11、FLU1和MDR1基因mRNA水平较敏感株表达无明显差异(P0.05)。结论:携带G487T和T916C突变的白念珠菌的耐氟康唑机制可能与主动外排泵基因CDR1和CDR2的高表达密切相关。     

DNA芯片鉴定念珠菌种和氟康唑耐药基因ERG11突变

目的 建立DNA芯片技术鉴定念珠菌种和氟康唑耐药基因ERG11突变。方法 根据6种常见念珠菌内转录间隔（ITS2）区种特异性序列和白念珠菌ERG11基因中已证实可导致对氟康唑耐药的6种突变序列设计探针,制备DNA芯片,鉴定12条50 bp的念珠菌种特异性序列和ERG11突变序列及34株念珠菌（其中白念珠菌29株,热带念珠菌、光滑念珠菌、都柏林念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌各1株）。结果 ①芯片正确鉴定12条人工合成序列;②正确鉴定34株试验菌株的菌种;③正确鉴定29株白念珠菌ERG11基因中可致耐药的已知突变。敏感性和特异性均为100%。结论 用DNA芯片进行念珠菌菌种鉴定和白念珠菌ERG11突变筛查,结果可靠。     

浅部与深部感染来源白念珠菌氟康唑耐药株药物敏感性及耐药基因突变比较

【摘要】 目的 比较浅部、深部感染来源的氟康唑耐药白念珠菌体外对8种抗真菌药物的敏感性及耐药基因突变。方法 26株深部感染来源白念珠菌耐药株、33株浅部感染来源白念珠菌耐药株,参照CLSI酵母菌检测方案M27-A4测定上述菌株对氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、两性霉素B、氟胞嘧啶、特比萘芬、米卡芬净8种药物单独或联合的体外敏感性。提取所有耐药菌株DNA,通过PCR检测ERG3、ERG11、FUR1 3种耐药基因的突变情况。满足正态分布和方差齐性检验的定量资料两组间比较采用独立样本t检验,不满足者组间比较采用Mann-Whitney U检验,定性资料组间比较采用卡方检验。结果 氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、氟胞嘧啶的最小抑菌浓度（MIC）在浅部感染组和深部感染组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）,而两性霉素B、米卡芬净的MIC两组间差异无统计学意义（均P > 0.05）。96.6%的菌株特比萘芬MIC值＞64 μg/ml,无法进行组间对比。15株白念珠菌（7株深部感染来源、8株浅部感染来源）特比萘芬 + 唑类（氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑）联合药敏试验均显示为协同效应,部分抑菌浓度（FIC）指数0.033～0.187;氟胞嘧啶 + 唑类、氟胞嘧啶 + 两性霉素B、两性霉素B + 氟康唑组合均无明显协同作用,FIC指数0.56～1.125。浅部感染来源白念珠菌ERG3基因突变包括错义突变V351A（33株,100%）,深部感染来源白念珠菌包括错义突变V351A（13株,50%）、A353T（4株,15%）;浅部感染来源白念珠菌ERG11基因突变包括错义突变I437V（32株,97%）、Y132H（23株,70%）、T123I（16株,48%）、K128T（6株,18%）、D116E（5株,15%）、A114S（4株,12%）、E266D（2株,6%）、G448E（2株,6%）、G465S（2株,6%）,深部感染来源白念珠菌包括I437V（23株,88%）、E266D（13株,50%）、E260G（5株,19%）、V488I（4株,15%）;浅部感染来源白念珠菌 FUR1基因突变包括错义突变R101C（11株,33%）,深部感染来源白念珠菌未检出错义突变。结论 浅部与深部感染来源白念珠菌氟康唑耐药株对药物的敏感性及基因突变位点均有所差别。     

ERG11和ERG3基因突变与念珠菌对氟康唑耐药的关系

目的探讨热带念珠菌、白念珠菌的ERG3、ERG11基因突变与其对唑类抗真菌药物耐药的关系,以初步探讨热带念珠菌对唑类药物耐药的机制。方法收集本院2015年3月-2016年10月期间临床分离的念珠菌52株,经体外药敏试验得到耐氟康唑的热带念珠菌6株、白色念珠菌1株;提取基因组DNA,通过PCR分别扩增6株热带念珠菌与1株白色念珠菌ERG11、ERG3基因,将扩增后的产物分别进行双向测序;将测序结果与热带假丝酵母菌标准菌株、白色念珠菌标准株的序列通过BLAST比对分析,找出突变基因。结果 6株热带念珠菌ERG11基因序列共发现3个同义突变与2个错义突变,ERG3基因共发现4个同义突变,6个错义突变;1株白色念珠菌耐药株ERG11基因共发现2个同义突变与2个错义突变,ERG3基因共发现2个同义突变,未发现错义突变。结论耐药菌株ERG11或ERG3存在不同程度的突变,这些突变可能参与热带念珠菌、白念珠菌耐药性的形成。     

白念珠菌的药物敏感性与基因型的研究

目的 探讨甲紫等5种抗真菌药物对白念珠菌的药物敏感性,分析白念珠菌药物敏感性与其基因型的关系。 方法 根据M27－A2方案检测甲紫、两性霉素B、酮康唑、伊曲康唑、氟康唑对67株白念珠菌的药物敏感性。提取白念珠菌基因组DNA,应用PCR扩增白念珠菌25S核糖体 rDNA基因内含子区,根据PCR扩增片段将白念珠菌分为A（36株）、B（23株）、C（8株）基因型,分析白念珠菌不同基因型与药物敏感性的关系。结果 药敏实验结果显示,67株白念珠菌中,8.96%对氟康唑、2.98%对伊曲康唑、1.49%对酮康唑耐药,两性霉素B无耐药菌株。甲紫的最低抑菌浓度在0.125 ~ 4 mg/L。统计学分析显示,白念珠菌对5种抗真菌药物的敏感性与其基因型无明显相关关系,P值均 > 0.05。结论 氟康唑和伊曲康唑耐药菌株的增多在临床用药选择上应引起注意,甲紫的抗真菌作用值得重视。白念珠菌基因型与抗真菌药物耐药的发生可能无明显相关关系。     

临床分离白念珠菌ERG4基因高表达与唑类抗真菌药物耐药的关系

目的 探讨临床分离白念珠菌ERG4基因高表达与唑类抗真菌药物耐药的关系。 方法 M27-A2微量肉汤稀释法对34株临床分离白念珠菌菌株进行体外药物敏感性试验。抽提白念珠菌ERG4基因的总RNA,并逆转录合成cDNA,采用实时荧光定量PCR（FQ-RT-PCR）方法检测ERG4基因mRNA表达水平。结果 白念珠菌耐氟康唑菌株组ERG4基因表达量（4.20 ± 2.56）高于敏感组（1.72 ± 1.33）（t = 3.99,P < 0.05）;耐伊曲康唑组（3.60 ± 2.47）高于敏感组（1.66 ± 1.61）（t = 3.71,P < 0.05）;耐伏立康唑组（3.99 ± 2.72）高于敏感组（2.07 ± 1.58）（t = 2.91,P < 0.05）;对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑同时耐药菌株组（4.49 ± 2.73）显著高于敏感组（1.69 ± 1.82）（t = 3.81,P < 0.05）。 结论 临床分离白念珠菌耐药菌株ERG4基因高表达与氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑耐药及交叉耐药有关,但白念珠菌ERG4基因高表达在耐药中的作用还有待于通过基因下调进一步研究证实。     

艾滋病患者白念珠菌ERG11基因突变的研究

目的 探讨艾滋病患者的白念珠菌唑类耐药株中唑类抗真菌药物(氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑)的作用靶位基因ERG 11基因突变与耐药的关系.方法 用PCR对临床分离的93株白念珠菌的Erg11基因进行扩增、测序,DNAman软件将测序结果与基因库中的X13296进行比对,将突变碱基翻译为氨基酸,确定是否发生错义突变.结果 共检出40个碱基突变位点,包括27个同义突变位点和13个错义突变位点.耐一种药物的突变菌株中每株菌只发生一处错义突变或无错义突变,而耐二种或三种药物的菌株中每株菌还可以同时出现两处或三处错义突变.结论 ERG 11基因错义突变与白念珠菌耐药有关.     

性病门诊5年中可疑念珠菌性外阴阴道炎患者念珠菌流行病学调查及耐药性监测

目的：研究疑似外阴阴道炎患者念珠菌菌种的分布及对氟康唑和伊曲康唑的药物敏感性监测。方法：常规分离菌株并鉴定，药敏采用E—test方法测定念珠菌的最低抑菌浓度（MIC）。结果：阴道分泌物分离念珠菌419例，其中：自念珠闲348株（83．1％），光滑念珠菌35株（8．4％），近平滑念珠菌17株（4％），热带念珠菌8株（2％），清消念珠菌4株（1％），克柔念珠菌5株（1％）。419株中对氟康唑、伊曲康唑耐药分别有13株（3％）、66株（16％），双重耐药7株占2％。结论：在疑似念珠菌性外阴阴道炎（VVC）患者分离的念珠菌中，仍以白念珠菌为优势菌株。念珠菌对伊曲康唑和氟康唑的耐药显示逐年增高趋势，不同念珠菌对常川抗真菌药物敏感性存在差异，部分菌种存在交叉耐药，非白念珠菌交叉耐药明显高于白念珠菌。     

白念珠菌对氟康唑耐药的差异性膜蛋白质组学分析

目的 鉴定并分析白念珠菌氟康唑敏感株与耐药株的差异表达膜蛋白质。 方法 以同一亲本来源的白念珠菌氟康唑敏感株CA-3和耐药株CA-16为研究对象,以双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）技术分析菌株之间膜蛋白图谱的差异,以基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF-MS）鉴定表达差异的蛋白质,通过白念珠菌蛋白质数据库进行检索分析。结果 白念珠菌氟康唑耐药株较敏感株有22种差异表达蛋白质点,其中有6种蛋白质上调,为Adh1p、Csp37p、Pgk1p、Pgk1p和2个未命名蛋白质（gi227305312、gi53954641）;16种蛋白质下调,分别为Aco1p、Aco1p、Hsp78p、Gut2p、Sdh12p、Ilv2p、Ndh51p、Ndh51p、Atp1p、Pda1p、Srb1p、Idh1p、Tdh1p、Cyt1p、Cox4p、Cox13p。结论 白念珠菌氟康唑耐药株较敏感株差异膜蛋白主要涉及能量代谢、线粒体功能等。 【关键词】 念珠菌,白色; 氟康唑; 抗药性,真菌; 膜蛋白质类; 蛋白质组学     

白念珠菌临床株氟康唑敏感性试验与ERG11基因突变检测

目的 了解白念珠菌临床株对氟康唑的敏感性,筛查临床菌株的ERG11突变,探讨其与耐药的关系.方法 收集鉴定白念珠菌临床株,采用微量稀释法和药敏纸片法体外测定试验菌株对氟康唑的敏感性.分段扩增ERG11基因的第295～777bp(483bp)、第723～1204bp(482bp)和第1179～1667bp(489bp)等3个片段,并测序.结果 共收集念珠菌80株,分离白念珠菌52株,52株白念珠菌均为敏感株.经测序的5株敏感白念珠菌ERG11基因共出现19处突变,其中14处为同义突变,其余5处错义突变(T495A、A530C、G640A、A945C、G1609A)分别可引起羊毛甾醇14α-去甲基酶的下列氨基酸改变:D116E、K128T、E165K、E266D、V488I.结论 白念珠菌临床株对氟康唑敏感性较高;E165K和V488I可能与耐药无关.     

白念珠菌临床株多药耐药蛋白基因表达与氟康唑耐药的关系

目的 探讨临床分离白念珠菌氟康唑耐药株/敏感株多药耐药蛋白基因CDR1、CDR2、MDR1的表达情况。方法 试剂盒法抽提白念珠菌氟康唑耐药株/敏感株的总RNA后，逆转录成cDNA，采用实时定量PCR技术观察白念珠菌多药耐药蛋白基因的表达。结果 白念珠菌耐药株组CDR2基因的△CT值为7.52 ± 2.53，敏感株组为9.28 ± 3.15，两组比较，t = 2.37，P ＜ 0.05，耐药株的表达量要高于敏感株。结论 白念珠菌CDR2基因的高表达与氟康唑耐药有关。     

氟康唑耐药的白念珠菌对唑类药物交叉耐药实验

目的观察对氟康唑耐药的外阴阴道念珠菌病(VVC)白念珠菌对其他唑类药物的敏感性和交叉耐药性。方法用CLSI颁布的M27-A2方案检测氟康唑(FLC)、伊曲康唑(ITC)、伏立康唑(VRC)及联苯苄唑(B IF)对VVC分离的耐FLC白念珠菌的最低抑菌浓度(M IC)。结果19株VVC分离白念珠菌中有11株对FLC,ITC交叉耐药,有5株对FLC,ITC,VRC交叉耐药。结论VVC分离白念珠菌对唑类药物存在交叉耐药性,尤其在FLC与ITC之间明显。     

氟康唑诱导耐药的阿萨希毛孢子菌ERG11基因表达研究

目的 探讨ERG11基因在阿萨希毛孢子菌耐药的作用以及基因表达量与药物浓度间的关系.方法 通过氟康唑体外诱导获得阿萨希毛孢子菌耐药菌株,将敏感株与耐药株同时置于含0~64μg/ml浓度氟康唑的培养基中培养,用实时PCR检测ERG11基因的表达情况.结果 在无药情况下,阿萨希毛孢子菌耐药株组ERG11基因表达(7.542±5.311)高于敏感株组(1.014±0.012),两组比较t=3.002,P=0.03.在不同浓度氟康唑作用下,耐药株组ERG11 mRNA水平分别为9.183±3.226,13.657±5.428,15.292±7.007,13.720±8.550,13.949±2.960,13.123±6.429,亦高于敏感株组3.281±2.068,3.459±1.923,3.242±2.530,3.651±0.728,3.969±1.924,3.824±1.875,均P<0.05.但ERG11表达量与氟康唑浓度之间差异无相关性(耐药株rs=0.229,P=0.096;敏感株rs=0.166,P=0.357).结论 阿萨希毛孢子菌ERG11基因过表达与氟康唑耐药有关.ERG11基因mRNA表达与氟康唑浓度之间无相关性.     

白念珠菌磷脂酶表达水平与氟康唑耐药关系的实验研究

目的 探讨白念珠菌毒力因子磷脂酶B1与耐药间的关系。方法 实验用白念珠菌氟康唑耐药株和敏感株各15株,提取白念珠菌总RNA,应用RT－PCR检测比较其耐药株与敏感株磷脂酶B1 mRNA的表达。盐析法提取白念珠菌耐药株与敏感株胞外蛋白,P0013B 放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液（强）裂解提取细胞内蛋白质,以β-肌动蛋白为内参照,用Western印迹法分别比较胞内和胞外耐药株和敏感株磷脂酶B1蛋白的表达水平。结果 耐药株和敏感株磷脂酶B1mRNA的相对表达量分别为0.6173 ± 0.1090和0.2653 ± 0.0935,耐药株磷脂酶B1mRNA的表达强于敏感株（t = 2.452,P < 0.05）。耐药株和敏感株胞内磷脂酶B1蛋白相对表达量为0.4145 ± 0.2773和0.1825 ± 0.1831,胞外磷脂酶B1蛋白相对表达量为0.2720 ± 0.2194和0.0688 ± 0.0631,耐药株胞内磷脂酶B1和细胞外分泌的磷脂酶B1蛋白表达水平均高于敏感株（t = 2.703、3.443,P值均 < 0.05）。 结论 白念珠菌耐药株毒力因子磷脂酶B1 mRNA及蛋白表达水平均高于敏感株。白念珠菌磷脂酶表达水平与耐药的发生可能存在一定关系。     

汉防己甲素对氟康唑抗白念珠菌增效活性的分子机制探讨

目的 探讨汉防己甲素在体外对氟康唑增效作用的分子机制。方法 分别提取 16 株白念珠菌酵母相总 RNA，采用 RT-PCR 方法比较汉防己甲素作用前及作用24 h后白念珠菌药物外排泵基因 MDR1、FLU1、CDR1、CDR2在氟康唑敏感、剂量依赖性敏感、耐药株中的表达情况。结果 在汉防己甲素作用前，MDR1、FLU1、CDR1、CDR2表达水平在氟康唑敏感、剂量依赖性敏感、耐药株间的差异均有统计学意义（P < 0.05）。汉防己甲素作用24 h后，与作用前相比，MDR1 在氟康唑耐药株中、FLU1在氟康唑剂量依赖性敏感、耐药株中、CDR1和CDR2在氟康唑敏感、剂量依赖性敏感、耐药株中表达水平的差异均有统计学意义（P < 0.05）。结论 汉防己甲素在体外对氟康唑抗白念珠菌活性增效作用的分子机制与抑制药物外排泵基因MDR1、FLU1、CDR1、CDR2的表达均有关。