陈氏益气活血化湿方通过调控足细胞自噬减轻PAN诱导的足细胞损伤

目的:本研究旨在观察陈氏益气活血化湿方水溶剂对氨基核苷嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside,PAN)诱导足细胞损伤的保护作用,并探讨这一作用与足细胞自噬(autophagy)的关系。方法:体外培养永生化小鼠足细胞系作为研究对象,采用细胞增殖检测试剂盒(CCK-8法)、western bloting法检测不同浓度PAN对足细胞的存活率的影响,建立PAN诱导的足细胞损伤模型。后将足细胞分为:正常组、PAN组、PAN+中药低剂量组、PAN+中药高剂量组,采用western bloting法检测足细胞p-mTOR、mTOR、LC3、synaptopodin蛋白的表达情况。结果:(1) CCK-8、western bloting检测结果显示50μg/ml浓度时P-mTOR表达最明显(P 0. 001),确定为造模浓度;(2) PAN造成足细胞p-mTOR表达升高,LC3II、synaptopodin蛋白表达降低(P 0. 05),mTOR磷酸化水平升高,足细胞自噬功能受到抑制,足细胞骨架蛋白表达降低(P 0. 01),足细胞受损;(3)陈氏益气活血化湿方水溶剂处理细胞后p-mTOR表达降低,LC3II、synaptopodin蛋白表达升高(P 0. 05),且高剂量组效果优于低剂量组。结论:陈氏益气活血化湿方水溶剂可能是通过上调足细胞自噬功能,发挥足细胞保护作用。     

法舒地尔对血管紧张素Ⅱ诱导足细胞骨架重构的干预作用

目的 观察ROCK抑制剂法舒地尔对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导小鼠足细胞骨架重构的影响,探讨法舒地尔在足细胞病变中的保护机制.方法 体外采用AngⅡ(]0-7 mol/L)致足细胞损伤模型.不同浓度法舒地尔(10-8、10-7、10-6mol/L)与足细胞预孵育30 min或60 min后,再加入含AngⅡ(10-7 mol/L)的培养基,继续作用24 h.异硫氰酸荧光素(FITC)-鬼笔环肽荧光染色和Western印迹法分析足细胞骨架相关蛋白F-actin和synaptopodin 的变化,并进一步观察细胞内调节骨架装配的Rho-ROCK信号通路的活性,即采用Western印迹法检测Rho激酶1(ROCK-1)及磷酸化肌球蛋白磷酸酯酶靶点亚单位1(MYPT1)表达,代表ROCK的表达及活性.结果 与对照组相比,AngⅡ可明显降低足细胞synaptopodin的表达(P＜0.05),使F-actin重构,而法舒地尔预处理可减轻AngⅡ介导的synaptopodin的下调(P＜0.05)和F-actin的重构.法舒地尔可下调AngⅡ诱导的足细胞ROCK-1 (P＜ 0.05)及MYPT1蛋白表达(P＜0.05).结论 法舒地尔可稳定足细胞的细胞骨架,拮抗AngⅡ对足细胞的损伤.法舒地尔的上述作用可能与细胞内Rho-ROCK信号通路有关.     

温阳活血利水法对足细胞骨架及相关蛋白影响

目的:观察温阳活血利水方含药血清对嘌呤霉素损伤小鼠永生系足细胞组织蛋白酶L(cathepsin L,Cat L)的转录因子Dendrin、膜相关鸟苷酸激酶转化蛋白2(membrane-associated guanylate kinase inverted2,MAGI-2)、下游底物synaptopodin、Rho A mRNA与蛋白表达变化以及足细胞骨架蛋白actin、中间丝分布情况的影响,探讨温阳活血利水方的作用改善肾病综合征蛋白尿及足突融合的机制。方法:体外培养小鼠足细胞,采用嘌呤霉素45 mg/L、中药含药血清或地塞米松与足细胞孵育12 h,荧光定量PCR检测Cat L、synaptopodinmRNA表达变化; western blotting测定MAGI-2、synaptopodin、Cat L、Rho A的蛋白表达;细胞免疫荧光观察Dendrin的分布以及细胞骨架蛋白微丝和中间丝的荧光分布变化。结果:嘌呤霉素作用足细胞12 h后,Dendrin转核比例增多(与正常组对比P 0. 01),MAGI-2、Rho A、synaptopodin蛋白的表达显著性下降(与正常组对比,均P 0. 01),Cat L mRNA与蛋白的表达显著性升高(与正常组对比,均P 0. 01),synaptopodin mRNA表达没有变化(与模型组比较P 0. 05),足细胞伪突回缩变短,中间丝和微丝结构紊乱,杂乱无章排列,结构不清晰。地塞米松、10%与20%含药血清干预后Cat L mRNA与蛋白表达减少,MAGI-2、Rho A、synaptopodin蛋白的表达有所增多,Dendrin转核比例减少(与模型组对比,均P 0. 01),均改善了足细胞骨架结构。结论:温阳活血利水方能减少足细胞受损后Dendrin核内转移,降低胞质cat L水平,从而减少synaptopodin降解,使Rho A表达增加,改善微丝(F-actin)和中间丝的重构,稳定细胞骨架结构,减少足突融合,从而减少蛋白尿。     

雷公藤甲素对PAN致足细胞损伤中mTOR/p70S6K/4EBP1信号通路的影响

目的:探讨雷公藤甲素(triptolide,TP)对m TOR/p70S6K/4EBP1信号通路的影响及其保护足细胞的可能机制。方法:氨基核苷嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside,PAN)刺激体外培养的足细胞24 h建立模型。细胞增殖检测试剂盒(CCK-8法)检测不同浓度雷公藤作用下PAN损伤足细胞的细胞存活率。后将足细胞随机分组:(1)对照组;(2)PAN组(PAN组,PAN 50μg/ml);(3)TP组(PAN 50μg/ml+TP 10 ng/ml),予以相应刺激24 h。采用实时荧光定量PCR检测足细胞m TOR、4EBP1、p70S6K、Akt、synaptopodin mRNA表达量,western blot检测足细胞p-mTOR、p-4EBP1、p-p70S6K、p-Akt、synaptopodin蛋白表达量。结果:(1)CCK-8结果显示,PAN造成足细胞损伤时加入浓度为3、10 ng/ml雷公藤甲素浓度均使足细胞活性上升,10 ng/ml时作用最明显(均P0.05)。(2)PAN增加m TOR、4EBP1、p70S6K、Akt mRNA及蛋白的表达量,减少synaptopodin mRNA及蛋白表达水平(均P0.05)。(3)雷公藤甲素共处理细胞后,m TOR、4EBP1、p70S6K、Akt mRNA及蛋白的表达水平明显下降,而synaptopodin mRNA及蛋白表达水平明显升高(均P0.05)。结论:雷公藤甲素可能通过抑制m TOR/p70S6K/4EBP1信号通路,减轻足细胞损伤。     

微小RNA-130b在嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞损伤中的作用及机制

目的探讨微小RNA-130b(miR-130b)在嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside,PAN)诱导的足细胞损伤中的作用及机制。方法小鼠肾脏足细胞系MPC5予以PAN 25、50、100μg/mL干预,实时定量PCR检测MPC5细胞系内miR-130b及其宿主基因2610318N02Rik(RIK)表达;转染miR-130b抑制剂(miR-130b inhibitor)或对照(NC inhibitor)后予以PAN 100μg/mL刺激,24 h后采用Western blot检测足细胞裂孔膜蛋白Synaptopodin和Nephrin蛋白表达变化;采用鬼笔环肽染色检测足细胞骨架改变;采用流式细胞技术检测细胞凋亡变化;采用Targetscan 7.2预测miR-130b潜在靶基因,Western blot检测miR-130b模拟物(mimic)对于潜在靶基因PGC1α蛋白表达的影响;采用双荧光素酶报告基因系统检测miR-130b mimic对于荧光活性的影响。结果 PAN可以抑制足细胞内的miR-130b及宿主基因RIK表达;与转染NC inhibitor组比较,miR-130b inhibitor提高足细胞裂孔膜蛋白synaptopodin和nephrin表达;鬼笔环肽染色显示抑制miR-130b可以部分缓解PAN诱导的足细胞骨架紊乱及重组;流式细胞技术检测结果示干扰足细胞miR-130b表达可以减少PAN诱导的细胞凋亡;Targetcan 7.2分析显示PGC1α是miR-130b的潜在靶基因,Western blot结果显示,转染miR-130b mimic可以降低足细胞内PGC1α表达;双荧光素酶报告基因系统结果示,与NC mimic及突变的PGC1α3'-UTR共转染组比较,miR-130b mimic与野生型PGC1α3'-UTR共转染组荧光素酶活性降低。结论 miR-130b通过靶向抑制PGC1α表达参与PAN诱导的足细胞损伤。     

雷公藤甲素对PAN致足细胞损伤中自噬作用的影响

目的:通过观察雷公藤甲素对氨基核苷嘌呤霉素(puromycin amino nucleotide,PAN)损伤足细胞的m TOR通路及自噬水平的影响,探讨雷公藤甲素(triptolide,TP)对m TOR-自噬通路的影响及其保护足细胞的可能机制。方法:体外培养的小鼠足细胞系(MPC5)为研究对象,PAN分别不同时间(0 h、1 h、3 h、4 h、6 h、24 h)刺激小鼠足细胞,检测p-m TOR、Beclin1、synaptopodin表达含量的变化,成功构建PAN致足细胞损伤模型。后将足细胞随机分为以下4组:(1)对照组(Con组);(2)PAN组(PAN组,PNA 50μg/ml);(3)雷帕霉素(rapamycin,Rap)组(Rap组,PNA 50μg/ml+RAP 200 ng/ml);(4)PAN+TP组(TP组,PNA 50μg/ml+TP 10 ng/ml)。各组培养时间均为4 h;采用western blot检测足细胞p-m TOR、p-Akt、p-ULK1、LC3、Beclin-1、Synaptopodin蛋白表达量。结果:PAN处理不同的时间梯度,与Con组相比,PAN处理4 h后,诱导p-m TOR的表达、减少Beclin1、synaptopodin表达(P0.05),成功建立PAN作用致体外足细胞损伤模型。与PAN组比较,雷公藤甲素可使p-m TOR、p-ULK1及p-Akt的表达明显上调(P0.05),而LC3、Beclin1及Synaptopodin的表达明显下降(P0.05)。结论:实验表明足细胞损伤可能与足细胞内自噬水平的变化有关,PAN刺激可能呈时间依赖性通过m TOR通路降低足细胞自噬水平,诱导足细胞损伤;雷公藤甲素可能通过作用m TOR通路调节足细胞自噬水平,从而对足细胞起保护作用。     

甘西鼠尾草总酚酸提取物对嘌呤霉素氨基核苷诱导损伤的足细胞中Toll样受体4表达的影响

目的:探讨SPE及其单体对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)诱导的损伤足细胞中Toll样受体4(TLR4)通路表达的影响。方法:足细胞与含有甘西鼠尾草总酚酸提取物(SPE)、迷迭香酸(RA)、丹酚酸B(SalB)、RA+SalB混合及他克莫司的完全培养液预先孵育30 min,再加入PAN(100μg/ml)继续作用24 h,观察足细胞骨架结构F-actin变化,western blot及半定量RT-PCR检测足细胞中TLR4、myd88、phosphor-NF-κB(pp65)在蛋白及mRNA水平的表达量变化。结果:(1)PAN作用24 h后,足细胞骨架蛋白F-actin明显损伤,微丝解聚、胞体回缩,少数细胞尚存排列紊乱的丝状结构,而提前给予保护药物SPE、SalB、RA、SalB+RA混合药物及他克莫司组的足细胞损伤明显减弱。(2)western blot数据显示,PAN诱导的损伤足细胞中TLR4、myd88及pp65蛋白的表达与正常组相比均有明显上调(P0.05);保护药物组:TLR4蛋白表达较模型组有明显下降(P0.05);My D88蛋白表达除SalB高剂量组及SalB+RA低剂量组较模型组无显著下降外,其余均能明显下调其表达量(P0.05);pp65在保护药物组中的表达均较模型对照组低(P0.05)。(3)半定量RT-PCR结果显示,模型对照组中TLR4、My D88及NF-κB的mRNA表达量明显高于正常对照组;保护药物组中:TLR4 mRNA表达量在各药物处理组中均明显低于PAN组(P0.05),其中的SPE高、低剂量组,RA高、低剂量组,SalB+RA高剂量组与正常组相接近(P0.05);My D88 mRNA表达量在SPE及其单体处理后均有明显下调(P0.05);NF-κB mRNA表达量除SalB高剂量组中无明显下调外(P0.05),其余各保护药物组均下调(P0.05)。结论:SPE及其活性单体对PAN诱导损伤足细胞的保护作用机制可能部分通过抑制TLR4信号相关蛋白表达来实现;甘西鼠尾草总酚酸提取物中的单体迷迭香酸对TLR4及其下游信号分子My D88、NF-κB的抑制作用优于丹酚酸B和混合给药组。     

Cdc42在种植体纳米化影响成骨细胞功能中的作用

目的 研究Cdc42在纳米化种植体促进成骨细胞功能中的作用.方法 将纳米化种植体与成骨细胞联合培养,通过Western Blot检测Cdc42活性蛋白含量,以及荧光染色检测成骨细胞内F-actin分布,扫描电镜观察成骨细胞形态,MTT检测成骨细胞增殖.结果 纳米化种植体使成骨细胞内Cdc42活性蛋白含量明显增多,Toxin B抑制后其活性明显下降,纳米化种植体表面成骨细胞形态不规则,细胞骨架明显,伸出较多伪足,采用Toxin B处理后细胞形态变圆,伪足减少.成骨细胞增殖功能随种植体纳米化而明显增高,在Toxin B处理后下降.结论 种植体粗化使Cdc42表达增加,可能通过Cdc42调节成骨细胞的黏附及增殖.     

黄芪甲苷保护嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞损伤及机制探讨

目的探讨黄芪甲苷对嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞凋亡的影响及可能机制。方法构建嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞损伤模型,根据不同处理将足细胞分成:Control组、PAN组(50μg/mL嘌呤霉素氨基核苷处理24 h)、AS-IV组(分别用5μg/mL、15μg/mL、30μg/mL黄芪甲苷处理24 h)、AS-IV+PAN组(先用黄芪甲苷预处理30 min,再用50μg/mL嘌呤霉素氨基核苷处理24 h)。采用CCK-8检测足细胞生长活力,Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡,免疫荧光法检测足细胞标记蛋白,Western blot检测caspase-3、cleaved caspase-3及VEGFR2/GIV通路的蛋白水平。结果与Control组比较,PAN组足细胞的凋亡率显著增加(P0.05),nephrin、podocin、p-AKT的蛋白水平明显降低(P0.05),cleaved caspase-3、p-VEGFR2、p-GIV的蛋白水平均明显上调(P0.05);与PAN组比较,AS-IV+PAN组足细胞的凋亡率显著降低(P0.05),nephrin、podocin的蛋白水平明显增加(P0.05),cleaved caspase-3的蛋白水平显著下降(P0.05),p-VEGFR2、p-GIV、p-AKT的蛋白水平进一步上调(P0.05)。结论黄芪甲苷可以保护嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞损伤,VEGFR2/GIV通路可能参与其调节的作用机制。     

活性维生素D_3对阿霉素诱导的足细胞转分化的干预作用

目的:探讨活性维生素D3对阿霉素诱导的足细胞上皮-间充质细胞转分化(EMT)的干预作用。方法:以体外培养的小鼠足细胞系为研究对象,分六组:正常组(C组)、阿霉素组(即模型组,ADR组)、缬沙坦组(ARB组)、低剂量活性维生素D3组(LVD组)、高剂量活性维生素D3组(HVD组)、缬沙坦+高剂量活性维生素D3组(AHVD组)。干预24 h、48 h后采用RT-PCR检测synaptopodin、P-cadherin、desmin、FSP-1 mRNA的表达。Western Bolt检测synaptopodin、P-cadherin、desmin蛋白的表达。结果:与C组相比,24 h及48 h ADR组synaptopodin、P-cadherin mRNA及蛋白表达均下降(P0.01)、desmin mRNA及蛋白表达上调(P0.01)和FSP-1 mRNA表达上调(P0.01)。与ADR组相比,24 h时ARB组、LVD组、HVD组、AHVD组synaptopodin mRNA表达均升高(P0.01)但四组之间差异无统计学意义。48 h时与ADR组相比,LVD组及HVD组synaptopodin mRNA及蛋白表达均升高(P0.05)。48 h四个药物干预组P-cadherin mRNA及蛋白表达均升高(P0.05)。24 h及48 h四个药物干预组desmin mRNA及蛋白表达均下调(P0.01),FSP-1 mRNA表达均下调(P0.05),但四组之间差异无统计学意义。结论:阿霉素可诱导小鼠足细胞发生EMT,活性维生素D3可通过修复足细胞synaptopodin、P-cadherin及抑制desmin、FSP-1的表达来拮抗足细胞EMT而起到保护足细胞的作用。缬沙坦和活性维生素D3在抑制足细胞EMT方面无协同作用。     

机械激活离子通道压力蛋白与细胞骨架的相关性研究

目的探讨周期性机械牵张应力作用下,人软骨细胞中新型机械激活离子通道压力蛋白(Piezo1)与细胞骨架的关系。 方法体外培养骨关节炎病人软骨细胞,然后利用多通道细胞牵张应力加载系统处理细胞,根据预实验结果分成无牵张应力组(空白组),2 h牵张应力组,12 h牵张应力组,24 h牵张应力组,48 h牵张应力组和相应的抑制剂浓度为0.275 mmol/L的蜘蛛毒液肽(GsMTx4)组以及浓度为0.573 mmol/L细胞松弛素D组。免疫组化鉴定软骨细胞,荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测不同力学条件刺激下各组细胞的Piezo1的表达量。以及细胞松弛素D作用下Piezo1的表达量。免疫荧光定位人软骨细胞Piezo1蛋白的表达,激光共聚焦显微镜观察各组细胞的细胞骨架以及Piezo1蛋白共染相关性。RT-q PCR结果比较采用单因素方差分析,两两组间比较采用q检验。 结果RT-q PCR检测结果显示,2 h牵张应力组比空白组Piezo1的表达量有所增加,但差异无统计学意义(P>0.05)。12 h牵张应力组比空白组相比有统计学意义(F＝9.785,P<0.05)。24 h牵张应力组表达量最多,48 h牵张应力组表达量有所降低。经GsMTx4处理后的各组Piezo1的表达量均出现明显降低(F＝13.907,P<0.001)。在牵张应力作用下,2 h牵张应力组至24 h牵张应力组细胞骨架呈渐进性增粗、浓集现象,但是48 h牵张应力组软骨细胞却出现了细胞骨架的松散与降解。相应的RT-qPCR结果显示Piezo1 mRNA表达量与细胞骨架的浓集与松散情况具有相同的趋势。GsMTx4处理后的各加力组表达均下降。 结论机械敏感性离子通道Piezo1的开放和关闭是与细胞骨架微丝F-actin肌动蛋白密切相关,由细胞骨架F-actin形变激活Piezo1蛋白通道,并与力学加载呈时间依赖性。     

高糖刺激对体外培养小鼠足细胞snail表达和转分化的影响

目的：研究高糖刺激对体外培养的小鼠足细胞snail表达及上皮细胞-间充质细胞转分化的影响.方法：以体外培养的小鼠永生化足细胞为研究对象,将其分为正常糖组、高糖刺激组、甘露醇对照组,培养时间为48 h.倒置显微镜下观察各组足细胞形态,采用荧光定量PCR法检测各组足细胞snail、synaptopodin、α-平滑肌肌动蛋（α-SMA）mRNA的表达,采用免疫细胞化学和western blot检测各组足细胞snail、synaptopodin、α-SMA蛋白的表达量.结果：正常状态下足细胞呈树枝分叉状,几乎不表达snail,高糖刺激48 h后足细胞形态发生明显改变,并且snail、α-SMA mRNA和蛋白表达量较对照组明显上调,synaptopodin表达较对照组减少（P＜0.05）.结论：高糖刺激可诱导足细胞snail的表达和转分化的过程,这可能参与了糖尿病肾病的发生、发展过程.     

地塞米松通过稳定podocin的表达和分布抑制嘌呤霉素对小鼠肾小球足细胞的损伤

目的 观察嘌呤霉素（PAN)和地塞米松（DEX）对足细胞分子podocin表达和分布的影响,探讨DEX改善蛋白尿的机制。 方法 体外培养小鼠足细胞（MPC5）,分为对照组、PAN组和DEX组。对照组用含0.02% DMSO的RPMI-1640培养液培养;PAN组加入PAN;DEX组同时加入PAN和DEX。处理后8 h、24 h和48 h,观察细胞形态并摄像,用图像处理软件分析各组细胞形态及胞体面积的差异。用RT-PCR、Western印迹和间接免疫荧光染色检测各时间点podocin mRNA和蛋白的表达及分布。 结果 正常足细胞呈星形,胞体大并有树样突起,细胞相互连接。PAN刺激8 h,足细胞胞体面积缩小,为对照组的43%;24 h为10%;48 h为5.7%（P < 0.01）;部分足细胞足突及细胞连接消失。DEX组在8 h、24 h和48 h,足细胞胞体面积显著大于PAN组,分别为对照组的43.9%、26.2%及29.6%（P < 0.05）, 足突形态正常。PAN组podocin mRNA表达量呈下降趋势,蛋白表达量显著降低（P < 0.01）,分布异常。DEX组podocin mRNA和蛋白的表达量及分布与对照组相似,48 h时mRNA和蛋白的表达量均显著高于PAN组（P < 0.05）。 结论 DEX直接作用于足细胞,稳定podocin mRNA和蛋白的表达量及分布,该作用可能与其能保护足细胞及改善蛋白尿有关。     

丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物基于TGF-β1抑制人皮肤成纤维细胞的研究

目的：研究丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物对转化生长因子-β₁(Transforming growth factor-β₁,TGF-β₁)诱导人皮肤成纤维细胞(Humanskinfibroblasts,HSF)抑制瘢痕形成的影响及分子机制。方法：配制丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物(丹参酮ⅡA与隐丹参酮标准品按照1∶1的比例配置)溶液，采用TGF-β₁诱导HSF细胞增殖构建增生性瘢痕体外细胞模型；采用MTT法测定丹参酮ⅡA与隐丹参酮对HSF细胞增殖的影响；采用WesternBlot法检测HSF细胞中TGF-β₁/Smad信号通路下游信号分子p-Smad2、Smad3蛋白以及Survivin蛋白表达水平变化。结果：丹参酮ⅡA与隐丹参酮能剂量依赖地抑制HSF细胞的增殖，降低p-Smad2、Smad3蛋白和Survivin蛋白表达水平。结论：丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物可能通过下调p-Smad2、3和Survivin蛋白的水平，抑制HSF细胞的增殖，发挥抑制瘢痕的作用。     

Cdc42在人乳腺癌细胞MCF-7阿霉素敏感株和耐药株中的表达

目的探讨细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)在乳腺癌细胞MCF-7阿霉素敏感株和耐药株MCF-7/Adr中表达的变化以及对细胞耐药性的影响。方法将Cdc42 siRNA转染MCF-7/Adr细胞株后,用RT-PCR和Weastern Blot方法检测MCF-7组,MCF-7/Adr组,MCF-7/Adr siRNA干扰组细胞Cdc42的转录以及蛋白的表达水平;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定siRNA处理后阿霉素(ADM)对MCF-7/Adr细胞的杀伤作用;用荧光分光光度计测定细胞内ADM药物浓度。结果 MCF-7/Adr细胞中Cdc42 mRNA及蛋白表达量显著高于MCF-7细胞(P0.05);siRNA干扰后Cdc42表达受到明显抑制(P0.05),并显著提高细胞内ADM的浓度(P0.05)。结论特异性siRNA能明显抑制Cdc42 mR-NA及蛋白表达,并逆转细胞耐药性。     

血管紧张素Ⅱ对足细胞nephrin 磷酸化水平的影响

目的 通过建立血管紧张素Ⅱ( AngⅡ)输注大鼠模型及体外足细胞培养,观察AngⅡ刺激对足细胞nephrin磷酸化水平的影响.方法 30只SPF级Wistar大鼠皮下埋置渗透性微泵,随机分为AngⅡ组(AngⅡ400 ng· kg-1·min-1,n=12)、替米沙坦(Tel)组(AngⅡ+Tel 3 mg· kg-1·d-1,n=12)和正常对照组(生理盐水代替AngⅡ,n=6),于实验0、7、14、21、28 d测量大鼠尾动脉收缩压,收集24 h尿液,检测尿白蛋白.分别在14、28 d处死动物,收集血液标本,检测血肌酐;收集肾脏标本,透射电镜观察肾小球足细胞形态,放免法检测血浆及肾组织AngⅡ水平;Western印迹检测nephrin表达及其磷酸化水平.体外培养小鼠永生化足细胞,AngⅡ (10-6 mol/L)刺激不同时间,并行洛沙坦(10-5 mol/L)干预,Western印迹法检测足细胞nephrin 表达及其磷酸化水平.异硫氰酸荧光素( FITC)-鬼笔毒环肽(phalloidin)染色标记足细胞F-actin,用外周F-actin环评分系统(CFS)半定量分析足细胞骨架运动.结果 (1)与正常对照组同时间点相比,AngⅡ组大鼠自7d起尾动脉收缩压开始升高(P＜0.05),随着作用时间的延长,血压持续升高.AngⅡ输注7d大鼠开始出现蛋白尿,并持续增加.各组大鼠血肌酐、尿肌酐及内生肌酐清除率无明显变化.AngⅡ输注大鼠血浆及肾组织AngⅡ浓度明显增高(均P＜0.05).(2)与正常对照组相比,AngⅡ输注组大鼠肾小球足细胞nephrin表达明显减少,其磷酸化水平亦显著下降(P＜0.05).(3)与正常对照组相比,AngⅡ刺激早期(3～6 h),足细胞nephrin磷酸化表达即明显下调(P＜0.05),刺激12～24 h维持低水平表达.(4)AngⅡ刺激后,F-actin排列紊乱,逐渐向细胞外周分布形成F-actin环,CFS评分显著高于正常对照组(P＜0.05).结论 正常状态下足细胞nephrin维持一定水平磷酸化状态,AngⅡ可以诱导足细胞nephrin磷酸化水平下调.nephrin磷酸化水平改变可能是AngⅡ诱导足细胞骨架重排、足突融合的重要分子机制.     

通络益肾方不同给药时期对DN大鼠足细胞损伤的影响

目的:观察通络益肾方对糖尿病肾病(DN)大鼠足细胞超微结构及骨架蛋白表达的影响。方法:60只SD大鼠随机抽取10只为假手术组,余大鼠采用右肾切除+腹腔注射链脲佐菌素制备DN模型。成模后的大鼠随机分为DN模型组(模型组),缬沙坦治疗组(西药组),通络益肾方早期给药组(中药早期组)、6周给药组(中期给药组)、8周给药组(晚期给药组)。每组10只。西药组予缬沙坦7.2 mg/kg灌胃,中药组予通络益肾方水煎液13.6 g/kg灌胃。中药早期组在造模成功后即予中药灌胃,中药中期和晚期组分别在造模成功后第6周、第8周开始中药灌胃。假手术组及模型组予蒸馏水灌胃。每日1次,共6周。检测大鼠24 h尿蛋白定量(24 h PRO)、尿白蛋白、肾功能;透射电镜观察足细胞超微结构,免疫组化法检测α-actintin-4、synaptopodin、F-actin表达,RT-PCR检测Nephrin、CD_2AP、α-actinin-4、synaptopodin、F-actin mRNA的表达。结果:(1)与假手术组比较,模型组24 h PRO、尿白蛋白、血尿素氮、血肌酐均明显升高(P0.01)。与模型组比较,西药组、中药早期组、中药中期组上述指标均明显下降(P0.01);与中药早期组比较,中药中期和晚期组各检测指标均不同程度升高(P0.01,P0.05);(2)足细胞超微结构的变化:模型组足细胞结构不清、数目减少、密度降低,骨架纤维排列紊乱;西药组及中药各治疗组足细胞病变减轻,足细胞较为完整,足突排列相对整齐,细胞骨架纤维排列相对整齐,足突融合减轻;中药早期组优于中药中期组和中药晚期组;(3)免疫组化结果显示:与假手术组比较,模型组α-actintin-4、synaptopodin、Factin表达显著下降(P0.01)。与模型组比较,西药组、中药早期组、中期组上述指标均明显升高(P0.01,P0.05),中药晚期组差异无统计学意义(P0.05);(4)与假手术组比较,模型组Nephrin、CD2AP、α-actinin-4、synaptopodin、F-actin mRNA表达均明显下降(P0.01)。与模型组比较,西药组及中药早期、中期组的各基因表达均显著升高(P0.01,P0.05),中药晚期组synaptopodin和F-actin表达差异无统计学意义(P0.05)。结论:通络益肾方可通过上调DN大鼠足细胞裂孔隔膜蛋白及骨架蛋白的表达而发挥其保护足细胞,抑制DN进展的作用,且给药时间越早,持续时间越长,效果愈显著。     

益气活血化湿方及其拆方对足细胞的保护作用

目的:本研究探讨益气活血化湿方及其拆方对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)诱导的足细胞损伤的保护作用。方法:培养足细胞并鉴定,建立PAN诱导的足细胞损伤模型。实验分为对照组(Con)、模型组(Model)、环孢素组(CsA)、全方组(QF)、益气组(YQ)、活血组(HX)、化湿组(HS)。分别利用RT-PCR与Western Bloting分析各组细胞CD_2AP、α-actinin4 mRNA和蛋白表达水平。结果:(1)Synaptopodin阳性表达,确立稳定的细胞培养条件;(2)明确造模浓度及各组用药浓度;(3)与Con比较,Model组α-actinin4 mRNA与蛋白表达均升高(P0.05),CD_2AP mRNA与蛋白表达均下调(P0.05);与Model比较,各用药组均能下调α-actinin4 mRNA与蛋白表达(P0.05),上调CD_2AP mRNA与蛋白表达;QF与HS均能下调α-actinin4 mRNA与蛋白表达(P0.05),二者差异无统计学意义(P0.05);QF与YQ均能上调CD_2AP mRNA与蛋白表达(P0.05),下调α-actinin4蛋白表达(P0.05),二者差异无统计学意义(P0.05)。结论:益气活血化湿方及其拆方能够通过修复骨架蛋白CD_2AP和抑制α-actinin4表达从而发挥足细胞保护作用,其中益气方和化湿方分别在修复CD_2AP表达与抑制α-actinin4表达方面作用显著。     

1,25(OH)2D3抑制嘌呤霉素氨基核苷酸肾病大鼠足细胞凋亡

目的 观察1，25（OH）2D3对嘌呤霉素氨基核苷酸（PAN）肾病大鼠足细胞凋亡的影响。 方法 72只雄性SD大鼠随机分为健康对照组（NC）、PAN组和1，25（OH）2D3治疗组 [1，25（OH）2D3 0.2 μg·kg-1·d-1灌胃]。一次性尾静脉注射PAN 100 mg/kg体质量建立足细胞损伤的PAN肾病动物模型。于3、7、14、21 d分批处死动物，分别检测不同时间点尿蛋白量（24 h）和肾功能。光镜和透射电镜观察肾组织学改变。TUNEL法检测足细胞凋亡。RT-PCR、免疫荧光、免疫组化分别检测nephrin、TGF-β1 mRNA和蛋白的表达。Western印迹检测磷酸化（p）-Smad2/3的表达。 结果 （1）PAN组各时间点BUN、Scr、尿蛋白量（24 h）[7 d时，（20.26±4.87） mg比（1.01±0.41） mg，P < 0.01]均高于同期的NC组，而肾小球足细胞显著减少[14 d时，(10.9±4.2) 个/肾小球切面比(31.9±6.2)个/肾小球切面，P ＜ 0.01]，且足突增宽融合。1，25（OH）2D3治疗组各时间点尿蛋白量（24 h）[7 d时（9.95±3.82） mg]和BUN、Scr显著低于PAN组（P < 0.05），且肾脏病理改变减轻。（2）PAN组7 d时nephrin mRNA和蛋白的表达显著降低，nephrin由正常的沿毛细血管襻线状分布向颗粒状、团快状改变，足细胞凋亡数显著增加[14 d时，（37.4±7.9）个/肾小球切面]。与PAN组相比，1，25（OH）2D3治疗组各时间段nephrin mRNA和蛋白的表达显著增加，且保持着正常的沿毛细血管襻线状分布，足细胞凋亡数显著减少[14 d时，(21.9±6.2) 个/肾小球切面，P < 0.01]。（3）PAN组TGF-β1 mRNA和蛋白的表达以及p-Smad2/3蛋白的表达均高于NC组（P < 0.01），1，25（OH）2D3治疗组TGF-β1 mRNA和蛋白的表达以及p-Smad2/3蛋白的表达低于PAN组（P < 0.01）。 结论 1，25（OH）2D3能有效地抑制PAN诱导的足细胞凋亡，减少尿蛋白，其对足细胞损伤的保护作用可能与抑制TGF-β1信号通路有关。     

小檗碱在高糖及糖基化终末产物诱导足细胞损伤中的保护作用

目的探讨小檗碱对糖基化终末产物(AGE)和高糖诱导下足细胞损伤及其骨架蛋白的影响及机制。 方法以条件永生性人足细胞作为研究对象,于含10%胎牛血清及100 U/L γ-干扰素的RPMI 1640培养液中进行体外培养,细胞增殖并诱导分化后进行分组处理。分别用高糖(30 mmo/L)、AGE(100 μg/ml)、小檗碱(10 μmo/L)处理48 h后,激光共聚焦检测技术观察纤维状肌动蛋白(F-actin),球状肌动蛋白(G-actin)变化;原位细胞免疫组化检测cspase-3,nephrin表达。采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析。 结果共聚焦显微镜下观察显示,高糖及AGE作用下,足细胞F-actin出现重排,G-actin易位,小檗碱干预后有所恢复。免疫组化结果显示,对照组及高糖组几乎未见capase-3阳性表达,但高糖＋AGE组,capase-3呈阳性表达(F＝99.339,P<0.001);高糖＋AGE组nephrin表达显著降低(F＝165.84,P<0.001),与对照组及高糖组比较,差异均有统计学意义。小檗碱作用后,高糖＋AGE组capase-3的水平下降(F＝6.927,P＝0.048),nephrin表达水平升高(F＝165.84,P＝0.025),差异均有统计学意义。 结论在持续的高糖和AGE作用下,可引起足细胞骨架蛋白F-actin、G-actin重构及分布异常,并诱导足细胞凋亡,小檗碱能改善高糖和AGE引起的足细胞骨架蛋白损伤,并抑制足细胞的凋亡,其机制可能与nephrin的参与有关。