原花青素对Aβ_(25-35)诱导PC12细胞凋亡的影响及其机制的研究

目的　探讨原花青素(Procyanidins,PC)对β淀粉样肽25~35(βamyloidpeptide25 -35, Aβ25-35 )诱导PC12细胞凋亡的影响及其机制。方法　采用MTT比色法分析细胞存活率, Hoechst33258 PI荧光染色法检测凋亡, RT PCR检测P53和bcl 2基因mRNA表达,Westernblot检测P53和Bcl 2蛋白表达。结果　不同剂量PC预处理PC12细胞 1h可剂量依赖性对抗Aβ25-35引起的凋亡,提高细胞的存活率,减少Aβ25-35引起的核固缩,凝聚和碎裂,降低P53mRNA表达以及P53蛋白表达,增加bcl 2mRNA表达以及Bcl 2蛋白表达。结论　PC可剂量依赖性对抗Aβ25-35对PC12细胞的毒性作用,其机制可能与下调凋亡基因P53和上调抗凋亡基因bcl 2表达有关。     

β-淀粉样蛋白对大鼠海马细胞内钙浓度和线粒体膜电位的影响

目的 研究β-淀粉样蛋白(Aβ25-35)对SD大鼠脑海马细胞内Ca2+-ATPase、游离钙离子浓度和线粒体膜电位的影响,探讨Aβ25-35对大鼠神经毒性作用的机制.方法 将90只SD大鼠按体重随机分为6组,采用海马内注射染毒方式,剂量分别为Aβ10、5和1 μg/只组,设立生理盐水组、假手术组和正常对照组.分别于术后7、14和21 d处死实验大鼠,取海马检测神经细胞内Ca2+-ATP活力、细胞内游离钙离子浓度和线粒体膜电位的改变.结果在术后7、14和21 d时,Aβ10 μg/只组海马细胞内Ca2+-ATPase分别为(0.24±0.05)、(0.14±0.01)和(0.09±0.01)U/mg,显著低于生理盐水组(P<0.01),同时具有明显的剂量-时间依赖关系;Aβ25-35可以增高细胞内Ca2+浓度,与生理盐水组相比,差异有统计学意义(P<0.01),并且具有明显的剂量-反应关系与剂量-时间关系,差异有统计学意义(P<0.01);同时,Aβ25-35染毒组实验动物细胞内线粒体膜电位随时间延长和剂量升高而降低,差异有统计学意义(P<0.01);假手术组、生理盐水组与正常对照组之间各指标检测差异无统计学意义.结论 Aβ25-35可以通过增加细胞内钙浓度,破坏线粒体功能而发挥神经毒性作用.     

姜黄素影响Aβ_(25-35)诱导PC12细胞周期变化与细胞凋亡的可能机制

目的探讨姜黄素(curcum in,Cur)对β-淀粉样肽(25-35)[β-amyloidpeptide-(25-35),Aβ25-35]诱导体外血清饥饿培养的PC12细胞周期异常与凋亡保护作用的可能机制。方法5μmol.L-1Cur预处理同步于G0期的PC12细胞,加入终浓度为25μmol.L-1Aβ25-35处理0～20h,用RT-PCR和Western blot从mRNA及蛋白水平检测p21、CDK4、E2F1、bax的表达。结果与Aβ25-35诱导组比较,Cur保护组p21mRNA和p21蛋白的表达增加;CDK4、E2F1、baxmRNA和CDK4、Bax蛋白的表达降低。结论Cur可能通过上调p21的表达,下调CDK4、E2F1、bax的表达,对Aβ25-35诱导的PC12细胞周期异常与凋亡起保护作用。     

尼古丁对Aβ_(25-35)诱导学习记忆障碍小鼠的治疗作用

目的探讨nAChR激动剂尼古丁对β-淀粉样蛋白(Aβ25-35)诱导的学习记忆障碍小鼠模型的治疗作用以及可能的作用机制。方法小鼠侧脑室注入凝聚态Aβ25-354.5μl。次日,用药组给予尼古丁0.2和2 mg.kg-1(ip,bid×7d),对照组及模型组ip生理盐水。给药结束4 d后(造模成功后11 d),进行各组行为学及皮层、海马组织乙酰胆碱酯酶(AChE)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)活性指标的检测。结果定位航行实验发现,训练d 4,模型组小鼠的上台潜伏期和游泳距离明显高于对照组和0.2、2 mg.kg-1尼古丁治疗组(P<0.01);空间搜索实验发现,实验d 5撤除平台,模型组在平台所在象限(第Ⅱ象限)中游泳的时间百分比明显低于对照组(P<0.01)和0.2及2 mg.kg-1尼古丁治疗组(P<0.05);模型组在平台所在象限(第Ⅱ象限)中游泳的距离百分比明显低于对照组(P<0.01),但与0.2及2 mg.kg-1尼古丁治疗组无差别(P>0.05)。酶活性检测发现尼古丁治疗组的AChE及ChAT的活性较对照组明显升高(P<0.01);尼古丁治疗组(2 mg.kg-1)MDA的活性较模型组明显降低(P<0.01),尼古丁治疗组(0.2 mg.kg-1)的活性较模型组无改变(P>0.05);尼古丁治疗组的GSH活性较模型组明显升高(P<0.01)。结论尼古丁能够改善Aβ25-35诱导痴呆小鼠的学习记忆功能障碍,该作用与其增强ChAT的活性以及抗氧化应激有关。     

Aβ25-35对原代培养小鼠皮层神经元突触素和PSD-95表达的影响

目的:观察Aβ25-35对小鼠皮层神经元突触损伤作用,观察PSD-95和突触素的表达,进而探讨阿尔茨海默病的发病机制。方法:将小鼠(出生48h内)断头取脑,急性分离皮层神经元,在24孔培养基上培养7d,经NSE染色鉴定为神经元,将Aβ25-35配制成浓度为5μmol/L,分别在0h、1h、2h、4h、6h致伤皮层神经元(每个时间点分别为4孔,设对照组),经免疫组化观察突触素和PSD-95的表达情况。结果:Aβ25-35作用1h后突触素、PSD-95免疫反映复合物的灰度值明显下降,即二者的表达明显减少,1-6h与同期时间点对照组相比差异有显著性(P<0.01),于6h后突触素、PSD-95几乎未见到表达。     

芥子碱对Aβ_(25-35)诱导的认知功能障碍小鼠海马神经元再生的影响

目的探讨芥子碱对Aβ25-35诱导的认知功能障碍小鼠海马神经元再生的影响。方法采用侧脑室内注射Aβ25-35诱导认知功能障碍小鼠模型,并分为4组:假手术组、Aβ25-35组、假手术+芥子碱组和Aβ25-35+芥子碱组。采用Y型电迷宫法检测学习和记忆行为;TUNEL法检测海马CA1区的神经元凋亡情况;ELISA法检测海马的丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性;Western blot法检测海马生长相关蛋白43(GAP-43)和突触素(P38)的蛋白水平。结果相比于假手术组,Aβ25-35组的学习次数、海马MDA和TNF-α的水平增加,记忆次数减少、海马CA1区神经元凋亡率升高、GAP-43和P38的蛋白水平降低(P<0.05);而芥子碱处理可改善以上症状,但仍与假手术组有差异。结论芥子碱可改善Aβ25-35诱导的认知功能障碍小鼠的学习和记忆功能障碍,降低海马神经元凋亡,并缓解海马区与神经再生相关蛋白及分子的水平。     

APP17肽对Aβ25-35诱导神经细胞凋亡保护作用

目的通过形态学和生化学指标观察APP17肽对Aβ25-35诱发SH-SY5Y细胞凋亡是否有保护作用,并对其保护作用机制作进一步的探讨.方法选用细胞形态观察、半定量LM-PCR DNA ladder Assay和流式细胞仪定量测定细胞凋亡率的方法观察APP17肽是否对Aβ25-35诱发SH-SY5Y细胞凋亡有保护作用;通过测定细胞MTT代谢率,共聚焦显微镜观察Aβ25-35和APP17肽对细胞内过氧化物含量、线粒体膜电位的影响以及Western Blotting 观察细胞内凋亡诱导因子AIF及核转录因子NF-κB的表达情况,探讨了APP17肽的保护作用机制. 结果 APP17肽可以明显改善Aβ25-35造成的细胞形态损伤,显著降低细胞凋亡比率;与Aβ25-35损伤组相比,APP17肽预孵育能明显提高细胞MTT代谢率,稳定线粒体膜电位,减少AIF的表达;有效降低Aβ25-35引起的细胞内过氧化物含量增高;并且使具有神经保护作用的核转录因子NF-κB表达增加. 结论 APP17肽可以稳定线粒体功能、降低细胞内过氧化物含量,激活NF-κB并使其持续表达,对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡有比较明显的保护作用.     

知母皂苷BⅡ对Aβ_(25-35)诱导的原代大鼠神经细胞损伤的保护作用

目的研究甾体皂苷类化合物知母皂苷BⅡ对Aβ25-35诱导的原代大鼠神经细胞损伤的保护作用。方法体外培养原代大鼠神经细胞,采用MTT(四甲基偶氮唑盐)法检测细胞增殖活性;采用分光光度法测定细胞培养液中LDH(乳酸脱氢酶)漏出率、SOD(超氧化物歧化酶)活力、MDA(丙二醛)含量以及AChE(乙酰胆碱酯酶)活力。结果知母皂苷BⅡ10-4、10-5mol.L-1能明显增强Aβ25-35(20μmol.L-1)诱导的神经细胞增殖活性,降低LDH漏出率,并能明显提高其SOD活力、降低MDA含量,同时对AChE活力具有一定的降低作用。结论知母皂苷BⅡ能明显改善Aβ25-35诱导的原代大鼠神经细胞损伤,可能与其提高模型细胞的抗氧化能力,改善胆碱能系统相关。     

Aβ25-35寡聚体对原代培养海马神经元突触的损伤作用

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种以进行性认知功能减退为特征的神经变性疾病。典型的病理学改变为：老年斑、神经原纤维缠结、神经元突触功能异常。AD的病因复杂,AD是多种因素共同参与的结果,其中老年斑的主要成分β-淀粉样蛋白（Amyloid-β,Aβ）被认为是该病发病机制中的起始因素和关键环节,尤其是可溶性Aβ寡聚体的神经毒性作用日益被重视,突触功能障碍及缺失是与认知功能下降关系最为密切的病理变化。     

蒲公英总黄酮改善Aβ25-35诱导的阿尔茨海默病大鼠记忆功能障碍的观察

目的：探索蒲公英总黄酮对Aβ25-35诱导的阿尔茨海默病（AD）大鼠记忆功能的影响以及潜在机制。方法：将50只健康SD大鼠随机分为正常对照组、模型组和蒲公英总黄酮低、中、高剂量组（100、200、400 mg·kg-1）。采用大鼠右侧海马CA1 区注射1 μL Aβ25-35建立AD大鼠模型,术后各组进行灌胃治疗21d。治疗结束采用Morris水迷宫法观察大鼠的记忆能力;分离海马组织并制备组织匀浆,采取二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)荧光法检测活性氧 (ROS) 水平;利用硫代巴比妥酸法和黄嘌呤氧化酶法检测丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性;将海马组织制备切片,应用TUNEL染色观察海马神经元凋亡;Western blot法检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax和Caspase-3的蛋白表达。结果：与正常对照组相比,模型组大鼠逃逸潜伏期明显延长,空间探索时间明显缩短,海马组织ROS水平增加,MDA含量明显增高,SOD活性明显下降,海马神经元细胞凋亡增加,Bax和Caspase-3表达上调同时Bcl-2表达降低。与模型组相比,不同浓度的蒲公英总黄酮均能缩短逃逸潜伏期,延长空间探索时间,降低ROS水平和MDA含量,升高SOD活性,减少神经元细胞凋亡,同时上调Bcl-2表达,降低Bax和Caspase-3表达,并且呈现浓度依赖性关系。结论：蒲公英总黄酮能够保护Aβ25-35诱导的大鼠记忆能力损伤,这可能与拮抗氧化应激介导的神经元细胞凋亡有关。     

p25/cdk5可能参与人参皂苷Rb1减轻Aβ_(25-35)诱导的tau蛋白过度磷酸化

目的探讨在Aβ25-35诱导的皮层神经元tau蛋白过度磷酸化中,人参皂苷Rb1对周期依赖性蛋白激酶(cyc lin-de-pendent k inase 5,CDK 5)的激动亚基p35/p25的影响。方法通过蛋白免疫印迹法和免疫细胞化学染色法检测胎鼠皮层神经元CDK 5的两个亚基cdk5和p35/p25的蛋白水平,以及CDK 5的磷酸化底物tau蛋白在Ser199/202、Thr205、Ser396和Ser404位点的磷酸化水平。结果凝聚态Aβ25-35(20μmol.L-1)作用于皮层神经元12 h,可使皮层神经元中p25的数量增多,以及tau蛋白在Ser199/202、Thr205、Ser396和Ser404位点的磷酸化水平增高,但对cdk 5亚基表达水平影响并不明显。Rb1和calpain特异性抑制剂calpeptin可减少皮层神经元p25的生成,同时人参皂苷Rb 1和CDK 5特异性抑制剂roscovitine可减轻凝聚态Aβ25-35诱导的皮层神经元tau蛋白的过度磷酸化水平。结论p25/cdk 5可能参与人参皂苷Rb1减轻Aβ25-35诱导的tau蛋白过度磷酸化。     

TAT-tCNTF融合蛋白对Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

目的确定TAT-tCNTF融合蛋白能够透过细胞膜进入细胞内,并研究其对Aβ诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。方法重组PCR获得人截短型CNTF基因后,与pBV220-TAT载体连接,在大肠杆菌中表达,细胞免疫荧光方法检测TAT蛋白运载融合蛋白穿过SH-SY5Y细胞膜的作用,Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞产生神经毒性,采用MTT(四甲基偶氮唑盐)法检测融合蛋白对细胞存活率的影响,Heochst33342/PI荧光双染法进行细胞凋亡和坏死的形态学观察,并进行LDH释放分析进一步检测TAT-tCNTF对细胞损伤后的保护作用。结果成功构建pBV220-TAT-tCNTF表达载体,Western blot结果表明重组融合蛋白可以与CNTF抗体特异性结合,细胞免疫荧光方法显示TAT-tCNTF能大量进入细胞,而rhCNTF只有微量进入细胞。对Aβ25-35诱导损伤的SH-SY5Y细胞MTT、Heochst33342/PI荧光双染法及LDH分析都表明TAT-tCNTF能明显提高细胞的存活率。结论TAT-tCNTF融合蛋白可以跨越细胞膜,能够保护Aβ25-35诱导损伤的SH-SY5Y细胞,具有促进细胞生存生长的活性。     

Aβ25-35对原代培养大鼠皮质神经元的损伤作用

目的 考察Aβ25-35对原代培养大鼠皮质神经元的损伤作用.方法 将原代培养的大鼠皮质神经元分为对照组、谷氨酸(glutamate,Glu)组及3个浓度的Aβ25-35组,每组各6孔.观察神经元的形态改变,并测定细胞存活率及培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的活力值.结果 与对照组比较,Glu组可造成大鼠皮质神经元明显损伤,形态发生显著改变,细胞存活率为(53.1±5.5)%(P<0.01),并且培养液中LDH漏出显著增多,LDH的活力值为(39.9 4±2.9)U/g Prot (P<0.01);Aβ25-35三个剂量组神经元存活率均显著降低,分别为(69.3±5.9)%(P<0.01)、(52.7±3.0)%(P<0.01)和(33.2±1.8)%(P<0.01),Aβ25-35低、中剂量组培养液中LDH漏出未见明显改变,LDH活力值分别为(23.5±1.4)U/g Prot和(24.7±1.3)U/g Prot(P>0.05),Aβ25-35高剂量组培养液中LDH漏出显著升高,LDH活力值为(38.8±2.0)U/g Prot(P<0.01),与Glu组相当(P>0.05).结论 Aβ25-35能剂量依赖性地损伤皮质神经元,1 μmol/L Aβ25-35剂量组处理24 h后细胞存活率可降低50%左右,可用于Aβ25-35体外诱导阿尔茨海默病细胞模型的建立.     

姜黄素影响Aβ25-35诱导去血清培养PC12细胞周期变化与细胞凋亡的可能机制

目的：探讨姜黄素（Curcumin，Cur）对Aβ25—35诱导体外去血清培养PC12细胞周期异常与细胞凋亡的可能影响机制。方法种人培养瓶或板的PC12细胞贴壁后用常用的去血清培养法使细胞同步于G0期，每次实验分对照组（0）、诱导组和保护组；流式细胞仪检测分析细胞周期的改变与凋亡的时间关系；通过RT-PCR和Western blot从mRNA及蛋白水平检测cyclin D1、cdk4、pRb、E2F1、bax等基因表达水平的变化。结果：（1）去血清培养24h．PC12细胞大约90％同步于G0／G1期；（2）25μmoL／L Aβ25-35处理8、16h。     

Aβ（25-35）对原代培养大鼠皮质神经元的损伤作用

目的考察Aβ25-35对原代培养大鼠皮质神经元的损伤作用。方法将原代培养的大鼠皮质神经元分为对照组、谷氨酸（glutamate,Glu）组及3个浓度的Aβ25-35组,每组各6孔。观察神经元的形态改变,并测定细胞存活率及培养液中乳酸脱氢酶（LDH）的活力值。结果与对照组比较,Glu组可造成大鼠皮质神经元明显损伤,形态发生显著改变,细胞存活率为（53.1±5.5）%（P〈0.01）,并且培养液中LDH漏出显著增多,LDH的活力值为（39.9±2.9）U/gProt（P〈0.01）;Aβ25-35三个剂量组神经元存活率均显著降低,分别为（69.3±5.9）%（P〈0.01）、（52.7±3.0）%（P〈0.01）和（33.2±1.8）%（P〈0.01）,Aβ25-35低、中剂量组培养液中LDH漏出未见明显改变,LDH活力值分别为（23.5±1.4）U/gProt和（24.7±1.3）U/gProt（P〉0.05）,Aβ25-35高剂量组培养液中LDH漏出显著升高,LDH活力值为（38.8±2.0）U/gProt（P〈0.01）,与Glu组相当（P〉0.05）。结论 Aβ25-35能剂量依赖性地损伤皮质神经元,1μmol/LAβ25-35剂量组处理24h后细胞存活率可降低50%左右,可用于Aβ25-35体外诱导阿尔茨海默病细胞模型的建立。     

脂质体转染TRPM7 siRNA对Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞分泌炎症因子的影响

目的利用小干扰RNA(siRNA)抑制TRPM7基因的表达,研究TRPM7对Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞分泌炎症因子的影响。方法通过Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞构建阿尔采末病体外模型,MTT法测定Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞最佳作用浓度与时间点,将人工合成抑制TRPM7基因的siR-NA片段,通过脂质体LipofectamineTM2000转染到SH-SY5Y细胞内;RT-PCR检测TRPM7、NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA表达,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒的测定细胞上清乳酸脱氢酶(LDH)的含量;ELISA测定细胞上清中TNF-α、IL-6的含量。结果转染siRNA后SH-SY5Y细胞的TRPM7、NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA表达较模型组明显下降,细胞上清中TNF-α、IL-6、LDH的含量表达较模型组明显下降。结论应用siR-NA干扰靶向抑制TRPM7基因,可以下调TNF-α、IL-6等炎症因子的释放,这一过程可能是通过抑制NF-κB信号转导通路的激活,从而减少炎症因子的释放,进而减轻Aβ对SH-SY5Y细胞的毒性作用。     

蒲公英总黄酮抑制Aβ25-35诱导的海马神经元细胞凋亡的研究

目的：研究蒲公英总黄酮用于防治阿尔兹海默症（AD）的机制,探讨蒲公英总黄酮对Aβ25-35诱导海马神经元细胞凋亡的影响,并进一步探究其潜在机制。方法：对海马神经元胞进行原代培养,经20 μmol·L-1 Aβ25-35诱导,细胞逐渐出现凋亡,用MTT法结合流式细胞仪,观察不同浓度的蒲公英总黄酮的细胞活力和细胞凋亡情况。用硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化酶法来检测各组细胞中丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）活性。Western blot检测各组细胞凋亡相关的基因Bcl-2、Bax和Caspase-3的蛋白表达。结果：20 μmol·L-1 Aβ25-35组细胞比对照组活力下降,凋亡增加,MDA 含量上升,SOD 活性降低。与20 μmol·L-1 Aβ25-35组相比,各浓度下的蒲公英总黄酮均能够提高细胞活力,升高细胞内SOD活性,抑制细胞凋亡,降低MDA含量,同时上调Bcl-2表达,降低Bax和活化状态下的Caspase-3蛋白的表达,并呈浓度依赖性相关。结论：蒲公英总黄酮能够减少Aβ25-35诱导神经元细胞的细胞凋亡,这可能与拮抗其氧化损伤有关。     

吡格列酮对Aβ25-35所致痴呆大鼠的学习记忆能力及海马内氧化应激的影响

目的 研究吡格列酮对Aβ25-35所致痴呆大鼠学习记忆能力和海马内氧化应激反应的影响.方法 侧脑室注射Aβ25-35建立大鼠AD模型,吡格列酮(40mg/kg、80 mg/kg)灌胃21d,次日行Morris水迷宫实验,前5天定位航行训练,第6天进行空间探索实验.行为学实验后第2天麻醉,断头取脑,提取脑组织匀浆,以备ELISA实验.ELISA实验研究大鼠海马内的氧化应激反应.结果 Morris水迷宫结果显示,模型组大鼠潜伏期较空白对照组明显延长,而穿过平台次数和平台滞留时间缩短.经吡格列酮治疗后,潜伏期显著缩短,穿过平台次数和滞留时间也相应增加.ELISA结果显示,模型组大鼠海马内酶性抗氧化剂GSH-Px和SOD活性较空白对照组明显降低,而脂质过氧化产物MDA含量增加.经吡格列酮治疗后,GSH-Px和SOD活性提高,MDA产生减少.结论 吡格列酮能改善痴呆大鼠的学习记忆能力,其机制可能与对抗海马内的氧化应激反应有关.     

阿魏酸钠对抗Aβ25-35诱导的鼠神经元凋亡作用研究

目的 探讨阿魏酸钠对β淀粉样蛋白(Aβ25-35)通过谷氨酸诱导的鼠皮层神经元凋亡的影响.方法 培养的皮层神经元分别与谷氨酸(20μmol/L)、Aβ25-35(5μmol/L)、Aβ25-35(5μmol/L)+谷氨酸(20μmol/L)孵育,采用Hoechst 33258荧光染色法分析神经细胞凋亡;然后用谷氨酸( 50μmol/L)诱导神经元凋亡,采用荧光染色法和Westem blot观察阿魏酸钠的保护作用.结果 单独应用Aβ25-35(5μmol/L)和单独加入谷氮酸(20μmol/L)引起的皮层神经元凋亡率与对照组无明显差异;Aβ25-35与皮层神经元共同孵育5天,接着用谷氨酸处理24h,细胞凋亡率从正常的9.2%+1.5%增加到43%±8%:阿魏酸钠能够显著降低谷氨酸诱导的神经细胞凋亡百分比至21%±5%,并对抗谷氨酸引起的Bcl-2蛋白表达的降低.结论 阿魏酸钠能够减弱Aβ25-35提高谷氨酸毒性诱导的鼠皮层神经元凋亡.