乙二胺羟丙基壳聚糖固定化天门冬酰胺酶的反应性质

研究了乙二胺羟丙基壳聚糖固定化L-天门冬酰胺酰反应动力学性能，分别考察了固定化酶耐胃蛋白酶性能，保存条件对固定化酶活力的影响，固定化酶的米氏常数Km以及固定化酶在缓冲液中间歇催化底物和连续催化底物的反应动力学性能，结果表明，在适当的间歇和连续反应条件下，固定化酶均具有良好的水解天门冬酰胺性能和效率。     

壳聚糖固定L-天门冬酰胺酶的研究

研究了以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，固定化Ｌ－天门冬酰胺酶的最适条件，并对固定化天门冬酰胺酶的理化性质进行了初步探讨。分别从不同固定化程序、缓冲液及保护剂等方面进行了固定化天门冬酰胺酶的条件优化；固定化酶的活力回收可达２０％左右。固定化酶的最适范围变宽，由游离酶的最适ｐＨ＝４～６变为ｐＨ＝６～１０。连续使用６次后仍可基本维持固定化酶的活力。固定化酶对胃蛋白酶的水解性也较游离酶大大提高。     

聚乙二醇改性壳聚糖固定化L-天门冬酰胺酶反应性质研究

研究了聚乙二醇改性壳聚糖(PEG-CS)固定化L-天门冬酰胺酶催化缓冲液中天冬酰胺的反应过程,考察了底物浓度、给酶量、温度、搅拌速率等条件对固定化酶在缓冲液中间歇催化反应过程的影响;以及底物浓度、流量、温度、床层高度等因素对固定化酶在缓冲液中连续催化反应过程的影响。实验结果表明:在适当的反应条件下,聚乙二醇改性壳聚糖固定化L-天门冬酰胺酶可以很好地水解缓冲液中的天冬酰胺。     

抗癌酶制剂L—天冬酰胺酶在甲壳素上的固定化

研究了以甲壳素为载体固定化Ｌ－天冬酰胺酶的最适条件,探讨了固定化Ｌ－天冬酰胺酶的一系列理化性质。交联剂用量、缓冲液ｐＨ值和载体活化时间均对Ｌ－天冬酰胺酶的固定化有一定影响,得到的固定化Ｌ－天冬酰胺酶的活力回收可达２５．４％。固定化Ｌ－天冬酰胺酶理化性质的实验研究表明,酶经固定化后,对蛋白水解酶的稳定性及存贮稳定性均较游离酶有很大程度的提高。     

功能基化聚丙烯酸甲酯固定化青霉素酰化酶

合成了一系列大孔丙烯酸甲酯－二乙烯苯交联共聚物,经酰肼化、叠氨后固定青霉素酰化酶,考察了反应条件对固定化酶的影响,当交联剂用量为３０％,至孔剂量为１３０％,混合致孔剂（正庚烷与乙酸乙酯）中正庚烷的质量分数为５５％时,所制的载体经活化后得到的固定化酶酶活较高,为９５ｕ／ｇ（湿）,用分批式反应器连续水解青霉素Ｇ钾盐,使用６３批次后仍保留酶活７９．４％。     

固定化酶催化合成半乳糖寡糖

以壳聚糖固定化米曲霉β－半乳糖苷酶,连续催化合成半乳糖寡糖（ＧＯＳ）,在填充床固定化酶反应器中,研究底物浓度、ｐＨ,反应温度和停留时间对ＧＯＳ连续合成的影响,最佳反应条件为：底物浓度４００ｇ／Ｌ,反应温度５０℃,ｐＨ５．８,停留时间３５ｍｉｎ,产物的最高得率为６２％。     

漆树酶的固定化研究

本文对我国特产资源生漆液中漆树酶的固定化进行了研究。考查了各种无机盐溶液处理不同无机载体,活化反应及漆树酶固定化条件对固定化漆树酶性能的影响。研究表明,经ZrCl_4处理后的多孔硅胶作载体的固定化漆树酶活力回收高、稳定性好、重复使用20次其保留活力仍有75%。同时对固定化漆树酶和自由态漆树酶的反应pH、温度、K_m值作了比较。对漆树酶通过过渡金属氢氧化物固定在无机载体土的机理也作了初步探讨。     

以甲壳胺为载体固定乙酰胆碱酯酶

目的 探讨以甲壳胺为载体固定乙酰胆碱酯酶的最佳条件及固定化酶的理化性质.方法 以戊二醛为交联剂,将乙酰胆碱酯酶固定在甲壳胺上,并分别测定固定化酶与溶液酶的活力.结果 固定化酶与溶液酶的最适温度相同,均为37℃;固定化酶与溶液酶最适pH分别为8.2、8.0;固定化酶在50℃仍有较高热稳定性,而溶液酶活力明显下降;固定化酶的米氏常数Km=0.84 mmol/L,溶液酶的Km=1.16 mmol/L;固定化酶活力回收为44.66%,在重复使用8次后仍能保持原有活力的50%.结论 该固定化酶与溶液酶相比,其热稳定性提高,与底物的亲和能力增大,且重复使用性较好.     

甲醛活化壳聚糖制备固定化l—天冬酰胺酶

研究了以甲醛活化的壳聚糖为载体固定化ｌ－天冬酰胺酶，其活力回收可达到１１３％，比用以戊二醛为交联剂进行固定化的活力回收要高出五倍多。分别从缓冲液的ｐＨ值及甲醛用量等方面进行了固定化ｌ－天冬酰胺酶的条件优化，并且对固定化酶的性质作了探讨。     

酶固定化技术的研究进展

目前,在很多领域内都开始应用固定化酶,这是因为固定化酶有着很多的优点,特别是稳定性和可重复使用性等。固定化酶技术涉及到多个学科,经过多年的发展,已经日趋成熟,随着生物技术的不断发展,固定化酶的应用范围将会越来越广。本文主要介绍酶固定化技术的研究进展,希望可以提供一些有价值的参考意见。     

CMV抗体免疫金快速检测试剂盒的开发与初步应用

目的: 开发一种低成本、简单易用的基于免疫金渗滤法的试剂盒,以用于检测分析血清中的巨细胞病毒抗体. 方法: 将用人工合成的人巨细胞病毒(HCMV)抗原表位的线性肽和分支多抗原肽分别划线固定于硝酸素纤维膜上,制成免疫层析检测试纸条,血清中IgG与测试条上金标记物结合后沿硝酸纤维素膜移动,与膜上的固相抗原结合形成肉眼可见的红色带条并用GICA和ELISA试剂盒对比检测120份血清标本中抗HCMV抗体. 结果: 分支多抗原肽制成的免疫层析检测试纸条的灵敏度为97.9%,特异度为87.5%,两法符合率为95.8%. 结论: GICA检测血清中的抗HCMV抗体特异性强,灵敏度高,简便快速,有广泛应用价值.     

血清蛋白双向凝胶电泳-质谱分析诊断早期肺腺癌的临床研究

目的分析肺腺癌患者与正常人血清双向凝胶电泳的差异蛋白质,从而寻找肺腺癌早期特异性的诊断指标。方法用固相IPG梯度双向凝胶电泳分离肺腺癌患者及正常人血清总蛋白,用PDQuest凝胶图像软件分析,以识别差异蛋白质点。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI—TOF—MS）分析获得肽质量指纹图,然后利用Mascot查询软件搜寻数据库鉴定蛋白质。结果①获得了重复性较好的双向电泳银染图谱。②经PDQuest7．1软件匹配分析,共筛选出22个差异的蛋白点,对7个差异蛋白点进行胶内原位酶解-质谱指纹图分析,获得了7张肽质量指纹图谱,查询数据库鉴定出1个蛋白质-血清淀粉样蛋白A（SAA）。结论①固相pH梯度双向凝胶电泳分离血清总蛋白获得了重复性较好的双向电泳凝胶图谱。②肺腺癌患者血清和正常人血清的蛋白质组表达存在明显差异,这些差异蛋白点为进一步建立人肺癌的2-DE数据库奠定了基础。③SAA蛋白很可能是肺癌的一个潜在标志物。     

LC-MS/MS method for the quantitation of serum tocilizumab in rheumatoid arthritis patients using rapid tryptic digestion without IgG purification

The quantitation of serum tocilizumab using liquid chromatography tandem-mass spectrometry (LC-MS/MS) method has not been widely applied in clinical settings because of its time-consuming and costly sample pretreatments. The present study aimed to develop a validated LC-MS/MS method for detecting serum tocilizumab by utilizing immobilized trypsin without an immunoglobulin G purification step and evaluate its applicability in the treatment of rheumatoid arthritis (RA) patients administered intravenously or subcutaneously with tocilizumab. The tocilizumab-derived signature peptide was deciphered using a nano-LC system coupled to a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer. The serum tocilizumab was rapidly digested by immobilized trypsin for 30 min. The chromatographic peak of the signature peptide and that of the internal standard were separated from the serum digests for a total run time of 15 min. The calibration curve of serum tocilizumab concentration was linear with a range of 2–200 μg/mL. The intra- and inter-day accuracy and relative standard deviation (RSD) were 90.7%–109.4% and <10%, respectively. The serum tocilizumab concentrations in the RA patients receiving intravenous and subcutaneous injections were 5.8–28.9 and 2.4–63.5 μg/mL, respectively. The serum tocilizumab concentrations using the current method positively correlated with those using the enzyme-linked immunosorbent assay, although a systematic error was observed between these methods. In conclusion, a validated LC-MS/MS method with minimal sample pretreatments for monitoring serum tocilizumab concentrations in RA patients was developed.     

人甲胎蛋白异质体肽链和寡糖成分差异与肝癌诊断的关系

采用小扁豆凝集素(LCA)亲和层析法将甲胎蛋白(AFP)分为结合型和非结合型两部分,并分析了人胎儿和原发性肝细胞癌(PHC)患者血清AFP异质体的电泳性质、氨基酸和寡糖成分。发现这两种不同来源的AFP虽同属胎肝型,但电泳性质、氨基酸和寡糖成分仍有差异。PHC血清小扁豆凝集素结合型AFP异质体(AFP-R-LCA)糖链结构中具有岩藻糖残基(α-L-Fuc),这一结构特征的识别,在临床为良性肝病和PHC的鉴别提供理论依据。     

腹膜透析患者发生心血管事件的危险因素分析

目的：探讨持续性腹膜透析患者发生心血管事件的危险因素。方法180例持续性腹膜透析患者,按12个月内有无心血管事件发生分成心血管事件组（73例）和无心血管事件组（107例）,对比分析两组患者的临床资料、生化指标等,采用logistic回归分析不良心血管事件的危险因素。结果两组患者在性别、年龄、原发病、透析疗程、透析前血压、吸烟史、血红蛋白水平、营养状况等方面比较差异均无统计学意义（ P均＞0．05）;心血管事件组患者血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇（ LDL-C ）、血清铁、血清铁蛋白、转铁蛋白饱和度、血磷、全段甲状旁腺激素（iPTH）、高敏C反应蛋白（hs-CRP）、同型半胱氨酸（Hcy）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及铁调素（Hepcidin-25）水平均高于无心血管事件组（P均＜0．01）。 logistic回归分析结果显示：血清总胆固醇、血清Hepcidin-25和TNF-α水平是持续性腹膜透析患者发生不良心血管事件的重要危险因素。结论血清总胆固醇、血清Hepcidin-25和TNF-α水平是导致持续性腹膜透析患者发生不良心血管事件的重要危险因素。     

抗乳铁蛋白单链抗体制备及鉴定

目的制备特异性的可溶性抗乳铁蛋白单链抗体。方法铁蛋白的单链抗体克隆,转化至大肠杆菌HB2151中进行可溶性表达。用固相化的乳铁蛋白从天然噬菌体抗体库筛选出抗乳表达产物以镍离子亲和层析法纯化,并进一步鉴定其纯度、活性等。结果成功筛选并表达了抗乳铁蛋白的单链抗体,该抗体能与乳铁蛋白特异性结合,而与转铁蛋白、溶菌酶、小牛血清白蛋白无交叉反应。结论建立了一种抗乳铁蛋白单链抗体的有效制备途径,为其进一步临床应用的研究奠定了基础。     

神经外科术后中枢性尿崩症ADH变化曲线及其临床意义

目的：探讨神经外科术后并发中枢性尿崩症时血清抗利尿激素（ADH）变化曲线对判断不同类型中枢性尿崩症的临床意义。方法：动态观察神经外科手术后出现中枢性尿崩患者158例，采用放射免疫法测定患者术前及术后2周内不同时间点血清ADH浓度，绘制短 暂性、持续性及三相性尿崩症AHD变化曲线。结果：短暂性和三相性尿崩症术后血清ADH立即下降，于术后第2天达最低值，分别为术前血清ADH浓度的41.7%和63.6%，与术前比较差异有显著性（P<0.05）。短暂性尿崩症于术后第10天恢复术前水平，而三相性尿崩症在术后第7天血清浓度达高峰，超过术前水平，后逐渐下降。持续性尿崩症患者术后 血清ADH于术后1 d后下降，于术后第7天 最低值，为术前血清ADH水平的33.3%，后略有波动，但在2周内一直低于术前ADH水平（P<0.05）。结论： 通过对血清ADH变化曲线的分析，可以区分不同类型的中枢性尿崩症，进行有针对性的治疗，改善患者预后。     

Isolation of human antibodies against hepatitis E virus from phage display library by immobilized metal affinity chromatography

Objective To isolate human antibodies against hepatitis E virus from phage display library by a new method of panning phage antibody library based on immobilized metal affinity chromatography （1MAC）. Methods Phage antibody library was allowed to mix with hex-His tagged expressed HEV specific antigen, NE2, in solution for adequate binding before affinity resin for hex-His was added. The non-specific phage antibodies were removed by extensive washing and the specific bound phage antibodies could then be eluted to infect TG1 or repeat the binding process for subsequent rounds of purification. The specificity of the selected human antibodies were tested by antigen competitive ELISA, human sera blocking ELISA, scFv expression, and sequence analysis. Results His-NE2 specific recombinant phages were successfully enriched after panning procedure. Two individual phage clones, 126 and 138, showed 50% inhibition in NE2 antigen competition ELISA and obvious blocking effect by HEV positive serum in blocking ELISA. Soluble scFv of 126, 138 bound to NE2 specifically. Conclusion Two specific human phage antibodies against hepatitis E virus （HEV） from phage display library were isolated by immobilized metal affinity chromatography. The immobilized metal affinity chromatography applied to phage antibody selection was a helpful supplement to the selection in solution.