中药复方血清药理研究方法学探讨——Ⅳ

家兔灌胃桂枝汤,１日１次,连续３ｄ药以及１日２次,连续３ｄ给药,末次给药后０．５－９ｈ采血,分离血清,观察各含药血清对病致细胞病变作用的影响。结果：上述各方法制备的含药血清抗副感流毒致ＣＰＥ作用所表现出的有效时间点分别为：无明显有效时间点、４－５ｈ、２ｈ、５－７ｈ、１－６ｈ,１日２次给药３ｄ及１日３次给药后采集的含血清可引起培养细胞明显的退行性改变。     

黄连解毒汤含药血清对血管内皮细胞增殖及粘附中性粒细胞能力的影响

以体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为模型,应用MTT和蛋白染料染色法,观察给药一次及连续给药3d后5,1,1．5,2,2．5h所取黄连解毒汤（HLJDT）含药血清对HUVEC增殖及粘附中性粒细胞（PMN）能力的影响,以探讨HLJDT含药血清制备的最佳取血时间点及其抗炎作用机制,结果：（1）与对照血清相比,40％及20％浓度的含药血清HUVEC产有不同程度的抑制增殖作用,而10％浓度时无明显抑制作用;（2）各点的HLJDT含药血清均有一定的抑制HUVEC－PMN粘附的作用,且与取血时间点存在一定的时效关系。其抑制细胞粘附的最佳时间点为连续给药3d组的1．5h左右。结论：HLJDT含药血清能抑制HUVEC－PMN粘附,可能是HLJDT抗炎作用的机制之一。     

西黄丸含药血清干预人乳腺癌细胞增殖的药效强度及其与采血时间的关系

目的探讨西黄丸大鼠含药血清对人乳腺癌细胞增殖的作用特点。方法 SD大鼠48只随机分为空白对照组12只及西黄丸0. 5 h组、西黄丸1 h组、西黄丸2 h组、西黄丸3 h组各9只。西黄丸各时间组给予2. 4 g/(kg·d)西黄丸混悬液灌胃,每日2次,空白对照组大鼠给予等体积蒸馏水,连续给药7次。于末次给药0. 5、1、2、3 h后对相应组采血,制备含药血清。MDA-MB-435和MCF-7细胞分别设10%空白血清组、20%空白血清组、30%空白血清组、10%西黄丸血清组、20%西黄丸血清组和30%西黄丸血清组,每组6个复孔。加入相应含药血清培养后,采用MTT方法检测不同采血时间点、不同浓度的西黄丸大鼠含药血清对乳腺癌细胞株增殖的抑制作用。结果与其他时间点相比,西黄丸大鼠各浓度含药血清作用24、48 h均为采血时间2 h含药血清对MDA-MB-435细胞的抑制增殖作用最强;西黄丸大鼠各浓度含药血清作用24、48、72 h均为采血时间3 h含药血清对MCF-7细胞的抑制增殖作用最强(P 0. 05);且均为30%西黄丸含药血清对MDA-MB-435、MCF-7两种细胞株增殖的抑制作用最强(P 0. 05)。结论西黄丸采血时间2 h含药血清对MDA-MB-435细胞的抑制增殖作用最强,采血时间3 h含药血清对MCF-7细胞的抑增殖作用最强,且以30%含药血清抑制作用最强。     

六味地黄丸对肿瘤细胞抑制作用的研究

目的 探讨六味地黄丸对不同肿瘤细胞的抑制作用.方法 采用中药血清药理学方法,选择不同剂量的六味地黄丸水溶液以灌胃方式给药,以空白血清组为对照组,应用MTT法检测考察不同给药天数、不同采血时间点大鼠含药血清对人肝癌细胞BEL-7402、肺癌细胞A549共同孵育不同时间段的抑制作用.结果 六味地黄丸低剂量组(4.8 g·kg-1)给药5d与10d,在末次给药1h眼眶取血制作的含药血清与肝癌细胞孵育48 h的抑制作用最明显,抑制率分别为43.2％和42.8％.与空白对照血清组比较,差异有统计学意义(P＜0.01),但是从给药天数上比较差异无统计学意义(P＞0.05).低剂量组(4.8 g·kg-1)给药5d末次给药4h取血制作的含药血清培养基,与人肺癌细胞孵育72 h的抑制作用为49.2％;给药10 d末次给药2h眼眶取血制作的含药血清培养基,与人肺癌细胞孵育48 h的抑制作用为47.2％,与空白对照血清组比较差异都有统计学意义(P＜0.01),但是从给药天数上比较差异无统计学意(P＞0.05).结论 对人肝癌细胞BEL-7402进行干预时,六味地黄丸含药血清的制备方法以低剂量(4.8 g·kg-1),给药5d,给药后1h取血,与肝癌肿瘤细胞培养48 h的抑制作用最为理想.对人肺癌细胞A549进行干预时,六味地黄丸含药血清的制备方法以低剂量(4.8 g·kg-1),给药5d,给药后4h取血,与肺癌肿瘤细胞培养72 h的抑制作用最为理想.     

冠心止痛胶囊含药血清内皮保护作用与体内给药时效关系研究

目的:观察冠心止痛胶囊含药血清对过氧化氢(H2O2)损伤内皮细胞的保护作用与体内给药的时效关系。方法:建立体外培养的HUVECs细胞H2O2氧化损伤模型,以冠心止痛胶囊不同给药方案所制备的含药血清对氧化损伤内皮细胞存活率、乳酸脱氢酶活性、一氧化氮、内皮素-1、组织型纤溶酶原激活物、组织型纤溶酶原激活物抑制剂的含量为指标,评价不同方案制备的含药血清对内皮细胞的保护作用。结果:不同方案所制备冠心止痛胶囊含药血清对H2O2诱导的HUVECs损伤均具有保护作用,连续3 d、5 d、7 d给药组含药血清的药效明显强于单次给药,连续5 d、7 d组的含药血清作用强于3 d组,但连续5 d、7 d组含药血清药效无统计学差异。结论:冠心止痛胶囊含药血清的药效与给药时间存在一定时效关系,以2次/d连续5 d给药后所制备的含药血清药理效应最佳。     

强骨宝方糖尿病模型鼠不同时效与量效的含药血清对成骨细胞增殖的影响

目的：探讨强骨宝方糖尿病模型鼠含药血清促进体外培养成骨细胞增殖的最佳时相与量效。方法：采用胰蛋白酶-Ⅱ型胶原酶消化法从1—2日龄SD大鼠颅盖骨中分离出成骨细胞，鉴定细胞后，用不灭活的不同时效（灌胃3d、5d，末次灌胃后1h、3h）、不同浓度（5％、10％、20％）的强骨宝方糖尿病模型鼠含药血清加入成骨细胞培养体系，培养镐、72h，应用MTT比色法来检测其对成骨细胞增殖功能的影响。结果：各时相的强骨宝方糖尿病模型鼠含药血清对成骨细胞的增殖作用呈浓度依赖性，即20％〉10％〉5％；其中以3d末次灌胃后1h、20％的含药血清作用最明显，在成骨细胞培养48h、72h后均具有显著促进其增殖作用。结论：灌胃3d、末次灌胃后1h、20％不灭活的强骨宝方糖尿病模型鼠含药血清对成骨细胞增殖作用最明显。     

小柴胡汤含药血清对肝癌HepG-2细胞的影响

目的:探讨小柴胡汤含药血清抑制HepG-2肝癌细胞增殖的作用机制.方法:大鼠灌服小柴胡汤3.69 g·kg-1,空白组给予等量蒸馏水,1次/d,连续7d,末次给药1h后腹主动脉取血制备小柴胡汤含药血清.以HepG-2肝癌细胞为研究对象,实验分为10％空白血清组,5％,10％,20％含药血清组.采用倒置显微镜观察含药血清对HepG-2细胞作用后的形态改变,噻唑蓝(MTT)法测定其对生长抑制的影响,流式细胞术分析细胞凋亡的情况,罗丹明123(Rh123)荧光染色观察细胞线粒体膜电位的变化.结果:与空白血清组比较,小柴胡汤含药血清能够抑制HepG-2肝癌细胞增殖,10％含药血清抑制细胞增殖具有时间依赖的特点;流式检测结果表明,10％小柴胡汤含药血清作用HepG-2肝癌细胞8h后,凋亡率从6.78％上升至19.51％;Rh123荧光染色显示,细胞线粒体膜电位明显降低.结论:小柴胡汤含药血清能够抑制HepG-2肝癌细胞增殖,促进其凋亡,线粒体途径参与了该过程.     

中药复方血清药理研究方法学探讨-Ⅰ

以桂枝汤的体外抗病毒实验为手段，对家兔含药血清制备时不同的给药次数和采血时间进行了探讨。结果显示：家兔单次口饲给药后１ｈ、２ｈ、３ｈ所采集的含药血清无抑制副流感病毒致细胞病变的作用；每日１次口饲给药，连续３ｄ，末次给药后２ｈ的血清，有明显抑制副流感病毒致细胞病变的作用。     

金威消石颗粒镇痛作用的实验研究

目的:探索金威消石颗粒对乙酸致腹膜炎小鼠的镇痛作用及对小鼠热板法痛阈值的影响.方法:取ICR小鼠60只随机分为金威消石颗粒低、中、高剂量组、阳性对照组和阴性对照组,每组12只,分别经胃灌注不同剂量金威消石颗粒、双氯芬酸钠溶液和蒸馏水,日1次,连续7d.各小鼠于末次给药后1h由腹腔注射0.7％乙酸溶液0.2 mL,计数注射后20 min内各小鼠的扭体次数.另取ICR小鼠60只,随机分为上述5组,以上法经胃灌注上述液体,以平板法检测各小鼠给药前及给药后1h、2h、3h和5h的痛阅值.结果:金成消石颗粒各剂量组乙酸致腹膜炎小鼠的平均扭体次数均明显低于阴性对照组(P＜0.01);金威消石颗粒各剂量组在给药后2h、3h和5h时的痛阈值均明显高于阴性对照组(P＜0.01);各剂量组3h和5h痛阈值明显高于各组给药前基础痛阈值和1h痛阈值(P＜0.01).结论:金威消石颗粒可提高ICR小鼠热板法痛阈值,减少乙酸致腹膜炎小鼠的扭体次数,具有明显的镇痛作用.     

柴胡含药血清的体外抗肿瘤作用的实验研究

目的：研究柴胡含药血清对体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721和乳腺癌瘤细胞MCF-7生长的影响。用血清药理学的方法探讨柴胡的抗肿瘤作用。方法：小鼠腹腔给以柴胡提取物后1、2、3、4h取血,制备含药血清。SMMC-7721、MCF-7细胞经不同时间点及浓度的柴胡舍药血清处理48h,MTT法检测各实验组和对照组的细胞增殖,计算抑制率。结果：柴胡提取物给药后1、2h后采集的血清对SMMC-7721及MCF-7细胞均有明显的抑制作用,与相同血清浓度的细胞对照组相比均有显著性差异（P〈0．05）,其中尤以1h含药血清作用最强。此外。柴胡含药血清的这种抑制作用随着血清浓度的增加而显著增强,表现出明确的浓度依赖性。结论：柴胡含药血清体外显示了一定的细胞毒活性。     

泽漆水提物对LPS诱导的急性肺损伤的影响

目的 探讨泽漆水提物对LPS诱导的急性肺损伤(ALI)炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及蛋白JNK、p38、ERK1/2的影响.方法 采用血清药理学的方法,给予SD大鼠连续灌胃给药3 d,取血制备空白血清和含药血清.采用RAW264.7细胞进行细胞实验,用含药血清预给药1 h后,加入LPS刺激细胞,共孵育18 ...     

益气养阴解毒方联合5-FU对HepG2细胞Survivin和Caspase-3的影响

目的:现察益气养阴解毒方的含药血清与化疗药5-FU体外共同作用于肝癌HepG2细胞后,对细胞Survlvin的表达和Caspase-3活性的影响,从而探讨本益气养阴解毒方增强5-FU诱导HepG<,2>细胞凋亡的相关机制.方法:运用血清药理学方法制备大鼠的益气养阴解毒方的含药血清,分为中药含药血清组、化疗药物5-FU组和中药含药血清+5-FU组,并设不含药的空白大鼠血清为对照组,分别作用于HepG<,2>细胞,应用SP免疫细胞化学染色法及 western-blot检测各组细胞24h、48h、72h后Survivin蛋白的表达变化;应用DEVD-DNA降解法检测各组细胞2.4h、48h、72h后Cas-pase-3活性变化.鲒果:(1)各组作用24h、48h、72h后,中药含药血清组HepG<,2>细胞Survivin蛋白的表达量无明显变化(与对照组相比,P>0.05);5-FU组HepG<,2>细胞Survivin蛋白的表达量逐渐升高(与对照组相比,P<0.05),且具有时间依赖性;而中药含药血清+5-FU组细胞Survivin蛋白的升高水平与5-FU组相比明显降低(P<0.05).(2)作用24h、48h、72h后含药血清组HepG<,2>细胞Caspase-3的活性无明显变化(与对照组相比,P>0.05);作用48h、72h后,5-FU组HepG<,2>细胞Caspase-3的活性逐渐升高(与对照组相比,P<0.05);而中药含药血清+5-FU组细胞Caspase-3的活性升高更显著(与5-FU组相比,P<0.05).结论:益气养阴解毒方含药血清可能是通过降低5-FU诱导的凋亡抑制蛋白Survivin的表达,减弱Survivin对Caspase-3活性的抑制,从而促进细胞凋亡的,这可能是本方与化疗合用增效的重要机制之一.     

复方加味桃仁承气汤对小鼠胰岛β细胞作用的研究

目的：研究复方加味桃仁承气汤对小鼠胰岛β细胞（NIT-1）的作用，探讨其抗糖尿病机制。方法：利用^3H—TdR掺入、细胞计数、胰岛素测定等研究复方加味桃仁承气汤水提液及含药血清对小鼠胰岛卢细胞的增殖及胰岛素分泌量的影响。其中含药血清的制备方法为给随机分组的5只大鼠灌胃复方加味桃仁承气汤水提液，每天2次，连续3d，末次给药2h后腹主静脉取血，离心，分离血清。结果：复方加味桃仁承气汤水提液及其含药血清均能明显促进小鼠胰岛β细胞增殖（P〈0．05），同时能明显促进胰岛素分泌（P〈0．05）。结论：复方加味桃仁承气汤抗糖尿病的作用机制可能与其促进胰岛β细胞增殖及胰岛素分泌有关。     

多指标正交试验优选复方五仁醇胶囊含药血清的制备方法

目的 药效与化学指标相结合优选复方五仁醇胶囊含药血清制备方法.方法 建立CCl_4 诱导的大鼠肝细胞损伤模型,采用L_8(2~7)正交设计给药和取血方案,制备大鼠含药血清或血浆,考察含药血清或血浆对损伤肝细胞增值(MTT)和培养上清液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)的影响,高效液相法测定含药血清或血浆中五味子乙素含量,并对结果综合加权评分和方差分析.结果 给药方式及采血时间对结果有显著影响,且两者之间有交互作用,血浆优于血清,但综合加权评分无统计学意义,动物是否造模无明显影响.结论 复方五仁醇胶囊含药血清较优的制备方法为正常大鼠连续ig给药3 d,上、下午各1次,末次给药后2 h采血分离血浆.     

黄芩含药血浆与含药血清中黄芩苷对比研究

目的从大鼠灌胃黄芩煎液的给药剂量、天数及采血时间方面开展试验,比较含药血浆与含药血清中黄芩苷,初步探讨建立规范的黄芩中药血浆药理方法。方法大鼠灌胃黄芩煎液后,取其第1、3天给药后的1h,2h及第5天给药后1h、2h、6h、12h含药血浆和含药血清,采用HPLC-MS法,测定含药血浆和含药血清中黄芩苷含量。结果大鼠灌胃黄芩3~5天取药后1h含药血浆与血清黄芩苷浓度相对较高。结论为黄芩中药血浆药理方法学给药剂量、时间及采血时间提供了理论依据。     

益骨胶囊对成骨细胞增殖影响的时效及量效关系研究

目的 :运用中药血清药理学方法 ,观察益骨胶囊含药血清对新生大鼠颅骨成骨细胞 (OB)体外增殖的影响 ,并探讨用于OB药效观察的益骨胶囊含药血清制备条件。方法 :雌性 12月龄SD大鼠 80只 ,随机分为生理盐水组、益骨胶囊低剂量 (11 6g/kg)、中剂量 (34 8g/kg)、高剂量 (10 4 4g/kg)组 ,每日灌胃一次 ,连续 12天 ,分别在灌胃后的 0 5h、1h、1 5h、2h采血 ,分离血清 ,用含不同浓度益骨胶囊的血清培养SD新生大鼠颅骨OB ,MTT法检测细胞增殖情况。结果 :末次灌胃后 1 5h采血组的吸收度 (A)值明显高于各组其它时间 (P <0 0 5 ) ;不同剂量各浓度的益骨胶囊含药血清对体外培养的OB增殖均有显著的促进作用 ,其中以高剂量组的稀释比为 2 5 %的血清浓度最佳。结论 :益骨胶囊含药血清对OB增殖具有明显的促进作用 ;益骨胶囊用于OB药效观察的大鼠含药血清制备条件以人等效剂量 9倍连续 12天灌胃、末次灌胃后 1 5h采血 ,血清添加浓度以 2 5 %为宜。     

黄芩汤含药血清对TNF-α诱导的Caco-2细胞炎症模型的影响

目的：观察黄芩汤不同时间点的含药血清对TNF-α诱导的Caco-2细胞炎症模型的影响。方法：参照《伤寒论》组方及课题组的前期研究，煎煮、过滤、浓缩制成黄芩汤提取物，按照20 g/kg的剂量一次性给予大鼠黄芩汤，分别于给药后0、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h眼眶取血，分离血清，MTT法观察不同浓度的黄芩汤含药血清对Caco-2细胞增殖的影响；并用TNF-α诱导细胞炎症损伤模型，10%的含药血清给药18 h后，采用Griess法观察黄芩汤含药血清对其NO的影响，采用Elisa法测定IL-1β、PGE₂和TNF-α的变化。结果：与正常组相比，5%、10%、20%的黄芩汤含药血清作用Caco-2后，均有促进其增殖的作用，尤以10%黄芩汤含药血清的效果最佳；10 ng/mL的TNF-α致炎效果最佳；不同时间点的10%黄芩汤含药血清可降低炎症细胞内NO的含量，降低细胞内IL-1β、TNF-α和PGE₂的浓度。结论：黄芩汤不同时间点的含药血清对TNF-α诱导的Caco-2细胞炎症具有明显的抑制作用，其作用机制可能与抑制NO、IL-1β...     

中药复方血清药理方法学探讨-Ⅲ

将所采集的含药血清分为２份,其中１份经５６℃３０ｍｉｎ灭活,对比灭活前后血清对病毒致细胞病变作用的影响,结果：正常血清灭活后相对作用强度平均降低５０％左右,抑制病毒致细胞病变的作用基本消失;１次给药采集的含药血清灭活后相对作用强度平均降低５０％左右,２次给药采集的含药血清灭活后相对作用强度平均降低３５％左右,但两者灭活前所表现的有效时间点均仍然存在。     

赤芍水提物对肝星状细胞株HSC-T6促凋亡作用的实验研究

目的应用流式细胞法,研究灌服赤芍水提物后的犬血清对乙醛造模后的肝星状细胞株HSC-T6细胞的促凋亡作用。方法采用乙醛造模后的肝星状细胞株HSC-T6作为体外研究模型,以赤芍水提物给彼格犬一次性灌胃,取给药前的血清、给药后1h、2h、3h、5h血清作为实验药物血清。以流式细胞法(flow cytometry)分别检测以上采血时间点上2%浓度的药物血清对乙醛造模后的肝星状细胞株HSC-T6作用72h后的促凋亡作用。结果2h、3h两个时间点的含药血清能明显促进HSC-T6细胞的凋亡,其中2h2%含药血清的促凋亡率5.71%,3h2%含药血清的促凋亡率5.73%。和同样条件下用空白血清培养的HSC-T6细胞相比其凋亡比例显著性增加(均为P<0.05)。在药物血清的作用下两个时点组的HSC-T6细胞在G0/G1期细胞比例明显上升(P<0.05);而S期细胞显著减少(P<0.05);但G2/M期并没有一致性的变化。结论两个时点的药物血清对HSC-T6细胞都有显著的促凋亡作用,且能显著增加HSC-T6细胞在G0/G1期的比例及显著降低S期的比例,这可能是其抑制HSC-T6细胞增殖及促凋亡的原因之一。     

三叶青水提物及其含药血清对人胃腺癌细胞株的抑制作用

目的:考察三叶青水提物及其含药血清对人胃腺癌细胞AGS体外增殖的影响.方法:清洁级小鼠随机分为5组:三叶青水提物高、中、低(20,10,5 g ·kg-1)剂量组、环磷酰胺阳性对照( CTX,5 g·kg-1)组及阴性对照组(蒸馏水).各组均ig给药,每次20 mL· kg-1,每天2次,连续给药3d,最后1次给药后1h断头取血,4℃静置4h,3 000 r ·min-1离心20 min,分离血清,56℃灭活30 min后,用0.22 μm的滤膜过滤除菌,-20℃保存备用.对数生长期的AGS细胞经0.25％胰蛋白酶消化后,配成2.5×104/L的细胞悬液接种于96孔培养板,培养24 h后,加入不同浓度的三叶青水提物溶液及其含药血清,作用48 h后,采用MTT比色法在570 nm波长下测定A,观察不同浓度三叶青水提物及其含药血清对AGS细胞的抑制作用.结果:1 ～40 g·L-1三叶青水提物对AGS细胞有显著的抑制作用(P＜0.01),IC50为13.15 g·L-1;三叶青水提物含药血清高、中、低(20,10,5 g·kg-1)剂量组也可显著地抑制AGS肿瘤细胞的增殖(P＜0.01),IC50为70.06 g·L-1.二者均呈现出剂量依赖性.结论:三叶青水提物及其含药血清对AGS细胞均有较强抑制作用.