急性肝衰竭大鼠载肝细胞生长因子纳米粒子肝细胞移植后有丝分裂指数和Ki-67表达变化及意义

目的 探讨急性肝衰竭(ALF)大鼠载肝细胞生长因子(HGF)的聚乳酸-氧-羧甲基壳聚糖(PLA-O-CMC)纳米粒子肝细胞移植后有丝分裂指数和Ki-67抗原的表达变化及意义.方法 D-氨基半乳糖腹腔内注射制作大鼠ALF模型,48 h后分别将Ⅰ型胶原(Ⅰ组)、PLA-O-CMC纳米粒子(Ⅱ、Ⅳ组)、载HGF的PLA-O-CMC纳米粒子(Ⅲ组)培养的大鼠肝细胞(均为5×107个,5 ml)移植到ALF大鼠腹腔内.以每日静脉注射HGF 10μg/kg×7 d(Ⅳ组)、5 Ml RPMI 1640腹腔内注射(Ⅴ组)作为对照.观察其14 d存活率、血清及肝组织HGF浓度、肝组织病理及有丝分裂指数(MI)、Ki-67变化.结果移植后14 d Ⅰ～Ⅴ组ALF大鼠的存活率分别为50.00％、68.75％、81.25％、75.00％、18.75％.各纳米移植组高于V组.Ⅲ组3 d时肝组织HGF浓度最高,平均为5882.91 μG／L.Ⅲ组肝组织结构恢复更快,5 d时平均MI 10.20％0、7 d时平均MI 10.20‰、7 d时Ki-67平均标记指数16.8‰,均高于Ⅴ组.结论 应用载HGF的PLA-O-CMC纳米粒子培养的大鼠肝细胞腹腔内移植治疗ALF大鼠能促进肝再生相关抗原表达.

Abstract：

Objective To evaluate the change and significance of Ki-67 antigen expression follow ing hepatocyte transplantation using hepatocyte growth factor (HGF) loaded polylactic acid-O-carboxymethylchitosan (PLA-O-CMC) nanoparticles in rats with acute liver failure (ALF). Methods ALF models of rats were established by D-galactosamine intraperitoneal injection. Rat hepatocytes type Ⅰ collagen suspension (group Ⅰ ),rat hepatocytes co-cultured with PLA-O-CMC nanoparticles ( groups Ⅱ ,Ⅳ ) and rat hepatocytes co-cultured with HGF loaded PLA-O-CMC nanoparticles ( group Ⅱ ) (5 × 107 cells each group,5 ml) were transplanted into the abdominal cavity of SD rats at 48 h after D-Gal injection. Intravenous injection of HGF ( 10 μg/kg for 7 days) ( group Ⅳ ) and RPMI 1640 injection (group Ⅴ ) were used as the negative groups. The 14th-day survival rate of rats,pathological change and mitotic index of liver,Ki-67 antigen labeling index of ALF rat livers were observed. Results The 14th-day survival rate in groups Ⅰ -Ⅴ was 50.00％,68. 75％,81.25％,75.00％,18.75％,and that in nano-transplanted groups was higher than in group Ⅴ. At the 3rd day,the concentration of HGF in liver tissue of group Ⅲ,average 5882. 91 μg/L was the highest. The hepatic lobules structure in group Ⅲ recovered faster. The average mitotic index in group Ⅱ at the 5th day was 10. 20‰ and the average Ki-67 labeling index at the 7th day was 16. 8‰,which were all higher than in group Ⅴ. Conclusion Intraperitoneal transplantation of HGF loaded PLA-O-CMC nanoparticle-attached hepatocytes for treatment of ALF can promote the liver regenerationassociated antigen expression.     

聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子培养的猪肝细胞移植对急性肝衰竭大鼠肝再生的影响

我们将聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖（PLA-O-CMC）纳米粒子培养的猪肝细胞移植到急性肝衰竭（ALF）大鼠腹腔内，观察移植后血浆中肝细胞生长因子（HGF）、血管内皮生长因子（VEGF）的变化及受体肝脏病理改变，探讨其对ALF大鼠肝再生的影响。     

微囊化猪肝细胞移植治疗大鼠急性肝衰竭

目的探讨微囊化猪肝细胞移植(HTx)治疗大鼠急性肝衰竭(ALF)的效果。方法采用原位胶原酶循环肝灌注法分离中国实验用小型猪肝细胞,海藻酸钠-氯化钡法微囊化。应用 D-氨基半乳糖(D-gal)1．2 g／kg体重腹腔内注射制作SD大鼠ALF模型。ALF大鼠随机分为3组。注药24 h后分别将PRMI 1640培养液2 ml腹腔注射为对照(I组)、2 ml游离猪肝细胞(2×107个／ml)腹腔内移植(Ⅱ组),以2 ml微囊化猪肝细胞腹腔内移植(2×107个／ml,Ⅲ组)。观察移植后大鼠14 d存活率、谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TB)、血氨(NH3)的改变和肝脏的病理变化。结果肝细胞移植后大鼠14 d存活率:I组为20．0％(5／25),Ⅱ组为66．7％(16／24),Ⅲ组为76．0％(19／ 25),3组间差异有统计学意义(P<0．05)。移植后第1天I组ALT、TB和移植前相比差异无统计学意义,Ⅱ、Ⅲ组ALT、TB下降。第4天3组ALT、TB均继续下降,Ⅱ、Ⅲ组低于I组(P<0．05), Ⅱ、Ⅲ两组间差异无统计学意义(P>0．05)。移植后第7天,ALT进一步下降,3组间差异有统计学意义(P<0．05);TBⅢ组显著低于Ⅱ组和I组(P<0．05),Ⅱ组低于I组但差异无统计学意义 (P>0．05)。移植后第14天,肝功能均明显恢复,ALT、TBⅡ、Ⅲ组均低于I组(P<0．05),Ⅱ、Ⅲ两组间差异无统计学意义(P>0．05)。各组治疗前后NH3有所改善,但各时间段及各组之间差异无统计学意义(P>0．05)。微囊组和游离肝细胞组移植后肝脏病理损害修复较快,而阴性对照组肝脏再生修复较差。结论微囊化猪肝细胞腹腔内移植可以提高药物诱导急性肝衰竭大鼠的存活率,改善急性肝衰竭大鼠的肝功能,有利于受体受损肝脏的再生修复,但对降低血氮的效果不明显。     

骨髓细胞移植改善宿主肝细胞功能研究

目的 观察骨髓问充质细胞(BMCs)移植能否提高严重肝功能损害合并再生障碍的同种先天性无白蛋白大鼠(F344alb)肝再生和修复能力.方法 F344大鼠为供体,F344alb受体鼠接受Retrorsine(RS)1次/2周腹腔注射2次后4周行2/3肝切除(PH).正常F344alb为组Ⅰ(n=5);BMCs移植为组Ⅱ(n=8);RS/PH预处理为组Ⅲ(n=8);RS/PH预处理后BMCs移植为组Ⅳ(n=8);RS/PH预处理后肝实质细胞移植为组V(n=8).4周后行各组大鼠肝脏形态学和组化染色研究,检测肝功能,及肝组织和骨髓基因检测.结果 (1)生存率:组Ⅳ75%,组Ⅴ 50%,组Ⅲ37.5%,组Ⅰ和组Ⅱ 100%.(2)4周后组肝再生率(67.38±8.66)%显著高于组Ⅳ、Ⅲ[(55.31±8.69)%,(44.27±6.51)%].(3)PH后1 d,组Ⅲ、Ⅳ、V血清TB、ALT显著升高;PH后2 d,组Ⅳ血清,rB、ALT显著下降.(4)组Ⅳ、Ⅴ肝组织切片白蛋白免疫组织化学染色显示白蛋白染色阳性肝细胞呈簇状分布.(5)F344来源白蛋白基因片段出现在组Ⅳ、Ⅴ大鼠肝组织内.(6)PH后2、4周,组Ⅳ、Ⅴ血清白蛋白显著升高.结论 BMCs移植可提高严重肝损合并再生障碍受体鼠肝再生能力,保护肝功能,促进肝修复.     

PLA O CMC纳米粒子培养的猪肝细胞大鼠腹腔内移植后凋亡相关蛋白的变化

目的:探讨聚乳酸 O 羧甲基壳聚糖（PLA O CMC）纳米粒子培养的猪肝细胞大鼠腹腔内移植后移植肝细胞凋亡相关蛋白Bcl 2，Bax和Fas表达的变化。方法:原位胶原酶循环肝灌注法分离猪肝细胞。D 氨基半乳糖腹腔内注射制作大鼠急性肝衰竭模型。随机分为2组，48 h后分别将5 mLⅠ型胶原凝胶包埋的PLA O CMC纳米粒子黏附培养24 h的猪肝细胞（A组），5 mLⅠ型胶原凝胶固定培养24 h的猪肝细胞（B组）移植至急性肝衰竭大鼠腹腔内。移植量均为5.0×107个肝细胞。采用免疫组化法检测移植后3 d内移植肝细胞Bcl 2，Bax和Fas的表达情况。结果:移植后1，2，3 d，A组Bcl 2阳性细胞百分数明显高于B组（P＜0.05），Bax和Fas阳性细胞百分数明显低于B组（P＜0.05）。结论:PLA O CMC纳米粒子能上调移植猪肝细胞的抗凋亡蛋白的水平和下调凋亡蛋白的水平，具有良好的抗凋亡作用。     

载肝细胞生长因子纳米粒子对肝硬化门静脉高压症犬断流术围手术期的肝功能保护作用

我们通过改良四氯化碳皮下注射法制备犬肝硬化门静脉高压症模型,观察模型犬断流术围手术期使用载肝细胞生长因子(HGF)聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖(PLA-O-CMC)纳米粒子对肝功能的保护作用. 一、材料与方法 1.动物:Beagle犬(n=15),雌雄不限,体质量10 ～15 kg.     

免疫隔离技术在异种肝细胞移植中的应用

目的探讨微囊化猪肝细胞腹腔内移植对药物性肝衰大鼠的治疗作用，观察移植大鼠存活率、肝功能的变化。方法以海藻酸钠体外包裹经胶原酶灌注法分离的乳猪肝细胞，以SD大鼠为受体，D-氨基半乳糖腹腔内注射诱导大鼠急性肝衰竭，48h后将微囊化的猪肝细胞移植于大鼠腹腔内，观察移植大鼠存活率、绘制生存曲线，并测定肝功能的变化。结果腹腔内肝细胞移植可显著改善大鼠肝功能，转氨酶及胆红素均较对照组明显下降（P〈0．05）。与裸肝细胞移植组相比．微囊化肝细胞移植组1周存活率（78．6％ vs 66．7％）及2周存活率（42．9％ vs 25．0％）均显著提高（P〈0．01）。结论对异种肝细胞经微囊化处理后移植治疗急性肝衰大鼠，可给予肝功能代谢支持，提高移植治疗效果。     

肝再生增强因子对大鼠腹腔移植的肝细胞的影响

目的 探讨肝再生增强因子(ALR)对急性肝功能衰竭大鼠腹腔移植的肝细胞的影响.方法 采用D-氨基半乳糖诱导SD大鼠急性肝功能衰竭(AHF),然后将其随机分为空白对照组(仅接受生理盐水腹腔注射)、移植对照组(腹腔移植SD大鼠的肝细胞2×107个)、环孢素A组(CsA组,接受肝细胞移植后腹腔注射CsA 6 d)、ALR组(接受肝细胞移植后腹腔注射ALR 6 d)和ALR对照组(仅腹腔注射ALR 6 d).实验期为14 d,观察受者的存活情况及移植肝细胞存活情况,检测腹腔内细胞CD4、CD8及CD68的表达情况,测定血清及腹腔冲洗液中自细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子a(TNF-a)的水平.结果 空白对照组、移植对照组、CsA组、ALR组及ALR对照组的受者2周存活率分别为0、46.7%、20%、66.7%和14.3%,ALR组显著高于空白对照组(P=0.001).移植后1～2 d,ALR组血清TNF-a和IL-1β明显低于空白对照组和移植对照组(P<0.01);移植对照组腹腔冲洗液中TNF-a和IL-1β水平明显高于其它各组(P<0.05,P<0.01).至移植后14 d,各组存活大鼠的血清TNF-a和IL-1β水平接近正常水平.移植后1～2 d,ALR组移植物内CD68表达水平为(0.5±0.3)%,明显低于移植对照组和CsA组(P<0.01);ALR组腹腔内细胞CD68、CD4及CD8表达水平分别为(1.3±1.2)%、(0.1±0.3)%和(0.2±0.1)%,均明显低于移植对照组(P<0.01,P<0.01,P<0.05).移植后1～3 d,接受肝细胞移植的大鼠腹腔内可见聚集成团的肝细胞结节,ALR组存活的肝细胞数明显多于移植对照组和CsA组,且炎症细胞浸润较少,至移植后14 d,仅ALR组可见少量形态正常的肝细胞.结论 腹腔内肝细胞移植联合ALR腹腔注射能提高AHF大鼠的存活率;ALR能短期改善移植肝细胞的存活状况.     

冷冻肝细胞移植治疗大鼠肝硬化和急性肝衰竭效果的比较

目的探讨冷冻肝细胞移植治疗大鼠肝硬化和急性肝衰竭的可行性,并比较其对该两种疾病的治疗效果。方法通过原位两步灌流法分离大鼠肝细胞,采用程序冷冻法冷冻肝细胞。利用四氯化碳(CCl4)及D-氨基半乳糖分别建立大鼠肝硬化及急性肝衰竭模型。实验分组:Ⅰ组为正常对照组;Ⅱa为肝硬化门静脉注射生理盐水组;Ⅱb组为肝硬化肝细胞移植组。Ⅲa组为肝衰竭门静脉注射生理盐水组,Ⅲb组为肝衰竭肝细胞移植组。检测各组门静脉压力、肝功能及病理学变化,并行统计学分析。结果冷冻的肝细胞复苏率为50%～70%。Ⅱb组,移植7 d与未移植0 d比较,肝功能、病理检查、门静脉压力等无显著变化。Ⅲb组,移植7 d与未移植0 d比较,ALT下降,总蛋白及清蛋白升高(P0.05)。结论冷冻肝细胞移植有助于急性肝衰竭大鼠肝功能的恢复,对肝硬化大鼠未发现明显疗效。     

无白蛋白受体鼠中源于移植肝非实质细胞的肝细胞功能研究

目的研究F344大鼠来源的肝非实质细胞(LNPCs)能否驻存于γ射线全身照射的先天性无白蛋白大鼠(F344alb)的骨髓,进而转化为产白蛋白肝细胞。方法研究分为5组：无细胞移植和γ射线全身照射组(组I,n=5)；接受γ射线全身照射,无细胞移植(组Ⅱ,n=5)；移植1×10~7 LNPCs,无γ射线全身照射(组Ⅲ,n=5)；γ射线全身照射后移植1×10~7 LNPCs(组Ⅳ,n=5)；γ射线全身照射后移植1×10~7骨髓细胞(BMCs,组Ⅴ,n=5),8周后,处死大鼠。肝脏切片行白蛋白免疫染色,检测呈多于6个白蛋白阳性簇状分布的肝细胞群中提取的DNA和血清中自蛋白的水平。结果(1)生存率：接受LNPCs移植的γ射线全身照射F344alb(组Ⅳ)平均存活率83．3%,而仅γ射线全身照射的F344alb存活率为20．0%(组Ⅱ),同时接受BMCs移植的γ射线全身照射F344alb平均存活率的的达100．0%(组Ⅴ)。(2)白蛋白阳性肝细胞呈多于6个的簇状分布仅发现于γ射线全身照射后接受LNPCs或BMCs移植的肝切片中(组Ⅳ和组Ⅴ)。(3)从F344alb受体(组Ⅳ和组Ⅴ)骨髓细胞及肝脏切片中微切的呈多于6个白蛋白阳性簇状分布的肝细胞群中提取的DNA中可检测到正常的白蛋白基因序列。(4)组Ⅳ和组Ⅴ血清中白蛋白水平显著升高。结论F344来源的肝非实质细胞能驻存于γ射线全身照射的F344alb的骨髓,进而在肝内转化为产白蛋白肝细胞。     

自体脾内移植的肝细胞凋亡及与其功能的关系

目的探讨肝细胞脾内移植后发生非免疫排斥性细胞凋亡及其对总体功能发挥的影响。方法应用TUNEL法原位观察80例大鼠肝细胞脾内移植后移植肝细胞的凋亡;分析移植肝细胞凋亡指数与肝化脾ALT含量及同位素99mTC-HIDA摄取量的相关性。结果应用了肝细胞生长因子的大鼠肝细胞脾内移植后移植肝细胞的凋亡指数为（2．76±1．08）,而未应用者则为（5．26±2．14）,两者差异有显著性（P＜0.01）。两组中移植肝细胞凋亡指数与肝化脾ALT含量和99mTc-HIDA摄取量均呈负相关。结论肝细胞脾内移植后较易发生非免疫排斥性细胞凋亡,其凋亡指数与肝细胞生存量及总体功能呈负相关,肝细胞生长因子可抑制移植肝细胞凋亡,从而提高其长期存活量。     

Review of hepatocyte transplantation

Background  Hepatocyte transplantation is a promising treatment for several liver diseases and can also be used as a “bridge” to liver transplantation in cases of liver failure. Although the first animal experiments with this technique began in 1967, it was first applied in humans only in 1992. Unfortunately, unequivocal evidence of transplanted human hepatocyte function has been obtained in only one patient with Crigler–Najjar syndrome type I and, even then, the amount of bilirubin–UDP-glucuronosyltransferase enzyme activity derived from the transplanted cells was not sufficient to eliminate the patient’s eventual need for organ transplantation. Methods  A literature review was carried out using MEDLINE and library searches. Results  This review considers the following: (1) alternatives or bridges to orthotopic liver transplantation (OLT); (2) solutions to the shortage of organs—the shortage of organ donors has impeded the development of human hepatocyte transplantation, and immortalized hepatocytes in particular could provide an unlimited supply of transplantable cells in a nearly future; (3) future directions. We review these efforts along with hepatocyte transplantation over the last 13 years.     

转染HGF基因对肝细胞的生物学效应

目的探讨肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)基因对肝细胞生长增殖能力的影响。方法通过脂质体介导法，将HGF基因导入肝细胞中。用荧光显微镜以及原位杂交观察到HGF基因表达。采用检测细胞生长曲线、Ki-67蛋白和嗜银蛋白免疫组化观察肝细胞生长增殖能力及DNA合成能力的变化。结果荧光显微镜观察可见到绿色荧光蛋白的表达，用原位杂交方法进一步证实了HGF蛋白在细胞中的表达。细胞生长曲线显示，转染HGF基因的肝细胞增殖速度明显增快，Ki-67蛋白和嗜银蛋白表达明显增多，提示转导HGF基因使肝细胞增殖活性增加。结论本实验显示转染的HGF可表达并有促细胞分裂活性。为进一步了解HGF分子生物学特性及治疗应用提供了理论基础。     

转肝细胞生长因子基因肝细胞模型的建立

目的：利用脂质体介导法在体外建立转肝细胞生长因子（HGF）基因的人肝细胞模型。方法：建立HGF真核细胞表达载体，利用脂质体介导法在体外将HGF基因转染入人肝细胞，利用荧光显微镜观察、免疫组织化学、原位杂交方法检测HGF真核细胞表达载体的转录和表达情况。结果：以阳离子脂质体LipofectAMINE为载体将HGF基因转染人肝细胞后，经400mg/L的G418筛选后可形成抗性克隆；Neo基因原位杂交结果显示转染基因的细胞有阳性表达；荧光显微镜下观察到有绿色荧光；免疫组织化学证实转染HGF基因的肝细胞有HGF蛋白的表达。结论：HGF基因可被成功转染入人肝细胞并能有效表达，这可能为肝病的基因治疗提供一种新途径。     

表达丙肝病毒核心蛋白基因的人肝细胞模型的建立

目的 构建表达丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-C)基因的人肝细胞模型。方法用聚合酶链反应(PCR)方法从pHCV-MA质粒中钩出HCV-C基因，酶切纯化后克隆于质粒pTRE中，建立重组质粒pTRE-C。pTRE-C经酶切、纯化后目的片段与质粒PcDNA3连接，通过限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确重组质粒PcDNA3-tRe-C，由脂质体介导转染Chang-liver人肝细胞，建立表达HCV-C基因的人肝细胞模型，PCR方法鉴定Chang-1iver人肝细胞内HCV-C基因。反转录聚合酶链反应(RT—PCR)方法检测HCV—C基因在Chang—liver人肝细胞内的表达，抗生物索蛋白-生物素-过氧化物酶复合体法(ABC法)方法分析HCV核心蛋白在人肝细胞内的表达及定位。结果 构建了表达HCV-C基因的重组真核表达载体，并在Chang-1iver人肝细胞中表达出HCV-C蛋白。结论 成功地建立了表达HCV—C基因的人肝细胞模型，该模型为进一步研究HCV-C的生物学特性及HCV感染所致肝硬化、肝癌的致病机制提供基础材料。     

DiI荧光示踪剂在大鼠脾内肝细胞移植中的研究

目的 探讨大鼠肝细胞在脾内移植后的生存、迁移及其并发症情况。方法 先用ＤｉＩ荧光示踪剂标记肝细胞再行脾内肝细胞移植。在不同时间段取肝、脾、肺、心、肾 、胸腺组织冷冻切片,在荧光显微镜下用荧光和普通光示踪观察。结果 ＤｉＩ荧光示踪剂能很好地标记肝细胞,６０ｄ实验期内,移植细胞能在所取各器官中生存并保持良好形态,未发现有区域梗塞灶、同时还反映了其在肝实质中的分布。结论 ＤｉＩ是一种新颖、使用简便的荧光     

肝细胞移植的新进展

肝细胞移植是继肝移植之后的针对肝功能衰竭的又一有效治疗手段,同时也可以作为急性肝功能衰竭患者等待行肝移植之前的一种桥接治疗手段.与肝移植相比,肝细胞移植具有创伤小、排异反应低等优点,但肝细胞移植同样受到供体短缺的制约.肝细胞移植能否作为一种临床广泛应用的治疗手段主要取决于肝细胞的数量和质量以及合适的移植部位,这方面研究在我国尚未受到充分的重视,因此,本文对肝细胞移植的基础研究与临床应用的新进展作一综述.     

Modulation of hepatocyte function in an immortalized human hepatocyte cell line following exposure to liver-failure plasma

For hepatocytes to function effectively in a bioartificial liver device, maintained function in the milieu of plasma from patients with liver failure will be required. We have investigated the effect of plasma obtained at plasmapheresis from patients with acute liver failure on the performance of the human hepatocyte cell line HHY41 in liver-failure plasma, normal plasma, and culture medium. Cytotoxicity of plasma, DNA synthesis by thymidine incorporation, oxidative status, and cytochrome P450 functions were assayed after a 16 h culture with normal plasma, liver-failure plasma, or culture medium. Some, but not all, samples of liver-failure plasma were deleterious to the performance of the cell line, inducing cytotoxicity and oxidative stress, with diminished DNA synthesis, protein synthesis, and cytochrome P4501A activity. Strategies to minimize the toxic effects of liver-failure plasma may improve the performance of liver cells in extracorporeal liver-support devices.     

肝细胞海藻酸钡微囊生物性能的研究

目的　研究肝细胞海藻酸钡微囊的生物学性能。方法　大鼠肝细胞微囊化后移植于腹腔内 ,1个月后取出行组织学检查。结果　不含肝细胞的空囊移植组微囊大多保持良好的形状 ,囊壁光滑、完整 ,囊外无纤维化反应 ,回收率为 ( 89± 2 3) %。肝细胞微囊大部分呈游离状态 ,部分囊外有一薄层纤维层附着 ,回收率为 ( 78± 2 1) % ;囊内细胞存活率由移植前的 ( 91± 16 ) %降至 ( 79±13) %。结论　肝细胞海藻酸钡微囊的生物相容性及机械稳定性较好 ,但免疫源性有待进一步提高。