奥沙利铂对不同p53状态肝癌细胞中DNA损伤修复基因GADD45β的诱导差异及调控机制

目的 探索奥沙利铂对不同p53状态肝癌细胞的DNA损伤修复基因(GADD45β)诱导差异及可能调控机制.方法 转染p53全序列建立Hep3B+p53.体外合成GADD45β近端启动子序列群(-618至-314),构建荧光素表达质粒,转染肝癌细胞株HepG2、Hep3B和Hep3B+p53.以实时荧光定量PCR比较奥沙利铂对GADD45β表达诱导及其近端启动子活性影响差异;比较对DNA合成和细胞克隆形成能力抑制差异;通过Caspase-3的表达变化测定凋亡的发生和发展.结果 奥沙利铂对Hep3B中GADD45β诱导并不明显.转染p53全基因序列后,Hep3B+p53对奥沙利铂的敏感性明显增加,并呈现出剂量-效应的正相关关系.荧光素分析提示奥沙利铂作用Hep3B+p53后的启动子NF-κB(-618/+6)和E2F-1(-470/+6)活性较Hep3B明显增强约1.5倍和0.8倍.奥沙利铂能够更加明显地抑制Hep3B+p53的DNA合成能力和细胞克隆形成能力,100 μmol/L奥沙利铂作用后Hep3B+p53DNA合成率为30.41％,对细胞克隆形成能力的抑制率则达到75.60％,与Hep3B相比差异显著.奥沙利铂作用后Hep3B+p53的Caspase-3能够迅速地启动凋亡的发生和发展.结论 p53对铂类化疗药物对肝癌细胞的GADD45β诱导具有重要作用,增强转录调节因子的表达水平是其可能的作用机制.     

Triapine对肝癌细胞株HepG2中GADD45β表达影响及其可能机制

目的:DNA损伤修复相关基因GADD45β的特异性表达缺失与肝癌的恶性程度密切相关,本研究初步明确肝癌细胞中GADD45β近端启动子序列,探索3-氨基吡啶-2-甲醛硫代缩氨基脲(Triapine)对人肝癌细胞株HepG2的GADD45β表达影响及其可能机制。方法:体外合成GADD45β近端启动子序列(-618至-314),构建荧光素表达质粒,转染HepG2,根据启动子活性强度结合数据库分析存在的转录调节因子结合位点;以实时荧光定量PCR比较Triapine作用前后HepG2细胞GADD45β表达;进一步比较Triapine对GADD45β启动子活性的调控作用,分析Triapine对HepG2的抑制效应;并通过Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的表达变化测定凋亡的发生和发展。结果:GADD45β近端启动子中含有3个NF-κB(-602/-593、-581/-572、-537/-528)和1个E2F-1(-470/-436)转录调节因子与启动子结合位点;2.5μmol/L和5μmol/L的Triapine作用后,GADD45β/GAPDH分别为0.029 3和0.073 9,呈现剂量-诱导效应正相关,同时NF-κB和E2F-1启动子活性分别增强了1.5和0.8倍;高剂量Triapine对HepG2的DNA合成能力和细胞克隆形成能力的抑制率分别为75.25%和60.54%,呈现剂量-抑制效应正相关;Triapine作用后6 h即出现HepG2凋亡高峰。结论:Triapine能通过增强转录调节因子的活性,诱导肝癌细胞中特异性缺失的GADD45β基因表达;进而抑制肝癌细胞的增殖并启动凋亡途径。     

GADD45β基因表达诱导对不同p53状态的肝癌细胞作用

目的：体外合成GADD45β基因全序列表达质粒后，研究GADD45β基因表达诱导对呈不同p53状态的肝癌细胞的作用及可能机制。方法：采用RT-PCR法获得GADD45β基因全序列，插入pDrive穿梭克隆载体和pIRES2-EGFP荧光表达载体后大量扩增获得DNA，结合p53全基因表达质粒pp53-EGFP转染HepG2、Hep3B细胞后，以[^3H]胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法(^3H—Tdr)和细胞克隆形成法分析DNA合成变化及细胞生长能力；以双抗体夹心ELISA法测定TGF-β1表达变化。结果：成功合成GADD45β基因全序列和表达质粒，通过流式细胞仪收集转染阳性的荧光表达细胞能显著提高转染效率；转染GADD45β后．具有野生型p53基因的HepG2细胞的细胞克隆形成能力和DNA合成能力明显受到抑制，细胞凋亡明显增加，TGF-β1的表达亦明显受抑。与之相反，缺失p53基因的Hep3B需要同时共转染p53基因后，方出现抑制效应。结论：GADD45β基因能够有效抑制肝癌细胞的生长．其功能需要完整p53基因的辅助和(或)调控。GADD45表达和（或)功能异常，导致p53介导的DNA损伤修复途径异常或阻断，是肝脏细胞恶性转化及形成肿瘤的可能机制。     

羟基脲对不同p53状态肝癌细胞中GADD45β的诱导差异及调控机制

目的 探讨羟基脲对不同p53状态肝癌细胞的GADD45β诱导差异及可能调控机制.方法 转染p53全序列建立Hep3B+p53;体外合成GADD45β近端启动子序列群(-618～-314),构建荧光素表达质粒,转染肝癌细胞株HepG2、Hep3B和Hep3B+p53;以实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)比较羟基脲对GADD45β表达诱导及其近端启动子活性影响差异;比较对DNA合成和细胞克隆形成能力抑制差异;通过Caspase-3的表达变化测定凋亡的发生和发展.结果 羟基脲对Hep3B中GADD45诱导并不明显,转染p53全基因序列后,Hep3B+p53对羟基脲的敏感性明显增加,并呈现出剂量-效应的正相关.荧光素分析提示羟基脲作用Hep3B+p53后的启动子核转录因子( NF)-κB( -618/+6)和E2F-1(-470/+6)活性较Hep3B明显增强约1.1倍和0.8倍.羟基脲能够更加明显地抑制Hep3B+p53的DNA合成能力和细胞克隆形成能力,10 mmol/L羟基脲对Hep3B+p53DNA合成抑制率达到37.15％,对细胞克隆形成能力的抑制率达85.29％,与Hep3B比较差异有统计学意义(P＜0.05).羟基脲作用后Hep3B+p53的Caspase-3能够迅速地启动凋亡的发生和发展.结论 p53对核糖核苷酸还原酶抑制性化疗药物对肝癌细胞的GADD45诱导起重要作用,增强转录调节因子的表达水平是其可能的作用机制.