锌指蛋白A20在内毒素所致人脐静脉内皮细胞损伤中的作用

目的　探讨外源性锌指蛋白A2 0对内毒素 (LPS)诱导的内皮细胞同型半胱氨酸蛋白酶caspase 3表达和凋亡的影响。　方法　RT PCR检测A2 0基因在内毒素诱导内皮细胞中的表达。DOTAP脂质体转染pCDNA3 1EHA2 0于脐静脉内皮细胞 ,经G4 18筛选 ,A2 0表达经免疫荧光鉴定。Tunnel原位末端标记法、原位杂交检测转染前后内毒素诱导内皮细胞凋亡情况及caspase 3的表达情况。　结果　A2 0基因在内毒素诱导的内皮细胞中能表达。正常对照组及转染A2 0基因组人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)凋亡为 (5± 1) %、(6± 1) % ,LPS作用后对照组与转染A2 0基因组凋亡分别为 (36± 3) %、(10± 1) % ,两者相差显著 (P <0 0 5 )。A2 0基因能显著抑制内毒素诱导的内皮细胞caspase 3的表达。　结论　A2 0基因在创伤的治疗中可能有一定作用。     

骨关节炎与免疫关联性初探

为了探讨免疫因素是否介导骨关节炎的发病 ,应用直接免疫荧光法检测了 6例晚期骨关节炎患者滑膜液中浸润淋巴细胞分化抗原的表达 ,同时用微量酶联免疫技术测定了这些患者滑膜液中IL 10、IL 12和sFasL的含量。结果显示关节滑膜液中的淋巴细胞以CD8+ 细胞为主 (6 7 0 %± 14 6 %) ,远远高于CD4+ 细胞 (15 0 %± 12 8%) ,两者相差显著 (P <0 0 1)。CD4+ /CD8+ 比值 <1。进一步分析表明其T细胞受体主要为αβ型TCR (6 4 0 %± 12 6 %)。滑膜液中IL 12含量 (2 0 3 84±49 2 )pg/ml高于IL 10 (37 8± 14 5 )pg/ml,有明显统计学差异 (P <0 0 1)。外周血中IL 10和IL 12的含量分别为 (4 3 37±14 2 )pg/ml和 (4 5 5 8± 10 6 )pg/ml。血清中sFasL含量较高 (15 3 90± 5 6 )pg/ml,而滑膜液中则很低 (<5pg/ml,P <0 0 1)。提示在骨关节炎的晚期CD8+ 淋巴细胞和IL 12增高可能参与了关节的免疫损伤。     

血管内皮生长因子,微血管密度与乳腺癌淋巴结转移及预后？…

目的　探讨血管内皮生长因子 (VEGF)、微血管密度 (MVD)与乳腺癌淋巴结转移和预后的关系。方法　应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)与免疫组织化学SP法 ,检测 92例乳腺癌、12例癌旁组织V组织VEGF表达、MVD以及 2 1例乳腺癌、12例癌旁组织VEGFmRNA的表达。结果　乳腺癌组织 ,VEGF12 1(1.16 %± 0 1% )和VEGF165(1.0 1%± 0 .1% )表达高于癌旁组织 (0 .96 %± 0 .14% )、(0 .88%± 0 .1% ) ,P <0 .0 5～ 0 .0 1。此外 ,MVD与VEGF表达具有显著的正相关关系 (r =0 .70 2 ,P <0 .0 1)。VEGF表达和MVD与乳腺癌淋巴结转移、肿瘤复发关系密切 (P <0 .0 5～ 0 .0 1)。VEGF高表达组和高MVD组的无复发存活时间低于VEGF低表达组和低MVD组 ,差异具有非常显著性 (P <0 0 1)。结论　VEGF与乳腺癌血管生成密切相关 ;VEGF和MVD表达的增高对乳腺癌淋巴结转移、肿瘤复发有促进作用 ;VEGF和MVD对乳腺癌患者的无复发存活时间能起到预测作用     

急性髓系白血病血管内皮生长因子表达与预后的研究

目的 :观察人白血病细胞系血管内皮生长因子 (VEGF)表达水平 ,研究急性髓系白血病 (AML)患者血清VEGF表达水平与预后的关系。方法 :采用酶联免疫吸附法 (ELISA)对 4 9例初治、10例复发AML患者血清及人白血病细胞系U937、K5 6 2、HL - 6 0、TF - 1和NB4培养上清液 (4 8小时 )VEGF表达水平进行检测。结果 :五种人白血病细胞系培养上清液中均测到VEGF高表达。 4 9例初治、10例复发AML患者的血清VEGF表达水平分别为 2 0 1 17± 110 93pg ml和 2 32 5 9± 118 6 2pg ml,均明显高于正常对照组 (12 5 6 2± 4 5 4 3pg ml;p <0 0 5 )。初治AML患者中VEGF高表达组 (>2 0 1 17pg ml)完全缓解 (CR)率为 4 8% ,低表达组 (<2 0 1 17pg ml)CR率为 77% ,两者比较差异显著 (p<0 0 5 )。结论 :血管内皮生长因子在刺激白血病细胞增殖、迁移中发挥重要作用。AML患者血清VEGF水平与预后具相关性     

类风关滑膜浸润T细胞特性与致病机制研究

为研究类风湿关节炎时关节滑膜浸润性T细胞生物学特性与致病机制 ,对 10例RA患者滑膜液中淋巴细胞的免疫表型、细胞因子分泌格局与趋化因子受体表达进行了分析。用双色荧光标记法分别测定滑膜液中和外周血淋巴细胞表型与趋化因子受体表达。用ELISA方法检测滑膜液与外周血中IFN γ、IL 10、IL 4与IL 12的含量。结果是滑膜液中的CD4 + T淋巴细胞为 4 0 0 %± 11% ,CD8+ T细胞为 34 0 %± 6 % ,CD4 + 与CD8+ T细胞的比值为 1 2 ,显著低于外周血中CD4 /CD8的比值。滑膜液中CD3和CD2 5双阳性的活化T细胞占 16 %± 6 0 %。趋化因子受体CCR5表达较低 ,与外周血无明显差异。但CX CR3表达水平较高 ,为 16 %± 4 0 % ,远远高于外周血 (仅为 0 5 %± 0 3% )。IFN γ在滑膜液中含量很高 ,达 (36 6 7± 4 3 2 )pg/ml,而外周血中含量仅为 (2 0 1± 3 2 )pg/ml。IL 4含量未能测得 (<15pg/ml ) ,与外周血相似。IL 12含量为 (4 19 9±89 2 )pg/ml,远高于外周血中的含量 (6 5 32± 34 2 )pg/ml。IL 10含量为 (187 7± 34 5 )pg/ml,高于外周血中的含量 (85±12 7)pg/ml。在所测细胞因子中 ,关节滑膜液中IFN γ和IL 12的含量与外周血相比具有显著的统计学差异。表明RA关节滑膜液中有相当数量的T细胞浸润。这些T细胞     

重组色素上皮衍生因子对人视网膜微血管内皮细胞迁移及凋亡的影响

目的: 构建rAAV2-PEDF腺相关病毒,研究色素上皮衍生因子(PEDF)基因高表达对人视网膜微血管内皮细胞的作用。方法: 将PEDF基因克隆、重组到腺相关病毒载体pSNAV,得到的pSNAV-PEDF后转染BHK细胞,用含G418的培养基进行筛选,得到稳定转染pSNAV-PEDF的生产细胞系,用重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/△UL2感染细胞进行病毒包装,纯化后得到高滴度rAAV2-PEDF 病毒颗粒。按照10⁵v.g./cell的剂量进行rAAV2-PEDF病毒转染,分别设空白和阴性对照,激光共聚焦显微镜下观察GFP阳性细胞,Western blotting检测PEDF蛋白表达。Boyden小室法观察细胞迁移情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果: 通过PCR、酶切及基因测序的方法,证实rAAV2-PEDF构建成功。转染病毒48 h后,激光共聚焦显微镜下观察可见GFP阳性细胞,Western blotting检测,实验组PEDF表达明显强于其它组。rAAV2-PEDF干预正常氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,正常对照组凋亡细胞比例为2.10%±0.53%,rAAV2-GFP组为3.40%±0.62%,rAAV2-PEDF组为1.60%±0.47%,各组间无显著差异(P＞0.05)。rAAV2-PEDF干预低氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,单纯CoCl₂组凋亡细胞比例为4.00%±0.55%,CoCl₂+rAAV2-GFP组为6.10%±0.71%,CoCl₂+rAAV2-PEDF组为40.00%±2.10%。rAAV2-PEDF组与其它2组相比,有显著差异(P<0.05)。细胞迁移计数显示,正常对照组为33.0±2.7,rAAV2-GFP组为35.0±3.6,rAAV2-PEDF组为12.0±2.1,rAAV2-PEDF组与其它2组相比,有显著差异(P<0.05)。结论: 成功构建了rAAV2-PEDF,转染人视网膜血管内皮细胞后PEDF可稳定表达。PEDF高表达可显著抑制人视网膜微血管内皮细胞迁移并可在低氧条件下诱导其凋亡。     

细胞色素P450花生四烯酸表氧化酶抑制TNF-α诱导的内皮细胞凋亡

目的： 以TNF-α/act D诱导的细胞凋亡作为一种内皮细胞损伤的模型，通过转染细胞色素P450表氧化酶基因BM₃·F87V、2C11OR以及2J2产生内源性EDHF（EETs），探讨EDHF是否具有抗内皮细胞损伤的作用及其机制。方法: 以CYP450表氧化酶BM₃·F87V、2C11OR及2J2基因转染3-4代培养的牛主动脉血管内皮细胞。通过MTT方法检测细胞活性。基因转染24 h后，用TNF-α/act D作用一定时间诱导内皮细胞凋亡，以细胞形态学观察，DNA ladder分析，流式细胞仪分析（Annexin-V-FITC和propidium iodide双染法）作为检测细胞凋亡的指标。结果: MTT分析显示，转染CYP450 BM₃·F87V、2C11OR以及CYP2J2基因的内皮细胞活性（分别为189.0%±18.0%，166.0%±22.6%或131.0%±22.8%）强于对照组（100.0%±21.3%）。经TNF-α/act D诱导，转染pCB₆的对照组内皮细胞大量脱落，未脱落细胞中许多细胞核呈碎裂颗粒状（约20.1%±0.9%）；而转染CYPBM₃·F87V、CYP2C11OR或CYP2J2基因的内皮细胞仅见少数核呈碎颗粒状（分别约1.2%±0.2%,1.0%±0.2%或3.1%±0.2% ）。DNA ladder 分析显示TNF-α/act D诱导后，转染表氧化酶基因的内皮细胞所形成的梯形条带弱于对照组。进一步用流式细胞仪定量检测表明，转染细胞色素表氧化酶基因CYP BM₃F87V或2C11OR内皮细胞中凋亡细胞所占比例（分别为12.35%±4.55%,10.92%±3.57%）明显低于对照组（29.57%±2.84%），而转染CYP2J2的细胞凋亡率也明显低于对照组。结论: 转染CYP450基因能够增加内皮细胞活性，抑制TNF-α诱导的内皮细胞凋亡，具有内皮细胞保护效应。     

碱性成纤维细胞生长因子荧光真核表达载体构建及对过氧化氢诱导血管内皮细胞凋亡的影响

背景：已证实外源性碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor , bFGF)可抑制血管内皮细胞凋亡。 目的：构建表达bFGF的荧光真核表达载体,探讨其对过氧化氢(H₂O₂)诱导的血管内皮细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响。 方法：通过基因亚克隆构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,利用脂质体介导将bFGF 基因导入人脐静脉内皮细胞内,通过荧光观察和RT-PCR检测基因的表达。实验分为3组,对照组(转染pcDNA3.1)、过氧化氢组(转染pcDNA3.1+ H₂O₂)和bFGF转染+过氧化氢组(转染pcDNA3.1-bFGF-GFP+H₂O₂),流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot检测caspase-3 P17活性亚单位和Bax蛋白表达。 结果与结论：成功构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,该载体转染人脐静脉内皮细胞后,bFGF mRNA显著增加,并可观察到绿色荧光。与对照组相比,过氧化氢组细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量都明显增加(P < 0.01),而bFGF 转染+过氧化氢组的细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量则比过氧化氢组显著降低(P < 0.01)。证实bFGF基因转染能抑制过氧化氢诱导的血管内皮细胞凋亡,其作用机制可能与调控Bax蛋白表达和caspase-3活性有关。     

HOXD10 基因抑制结直肠癌细胞生长的机制研究

目的:探讨上调HOXD10基因表达对结直肠癌细胞增殖凋亡及免疫抑制因子VEGF和TGF-β1表达的影响。方法:Western blot检测结直肠癌HCT116、HT29、CaCO_2细胞中HOXD10的蛋白表达;将过表达HOXD10的质粒(pcDNA3. 1-HOXD10组)转染HT29细胞,同时转染阴性对照组(pcDNA3. 1组)及设置空白对照组,收集转染48 h的细胞,MTT及流式细胞仪分别检测细胞活力及凋亡率;Western blot检测免疫抑制因子VEGF和TGF-β1及Notch信号通路受体Notch1、配体Jagged1及下游靶基因Hes1的蛋白表达。结果:结直肠癌HCT116、HT29、CaCO_2细胞中HOXD10的表达均显著低于在NCM460细胞表达(P0. 05);转染pcDNA3. 1-HOXD10的HT29细胞HOXD10的蛋白表达显著高于pcDNA3. 1组(P0. 05);与pcDNA3. 1组比较,pcDNA3. 1-HOXD10组细胞活力明显降低,细胞凋亡率显著升高,TGF-β1、VEGF、Notch1、Jagged1和Hes1的蛋白表达均显著降低(P0. 05)。结论:上调结直肠癌细胞HOXD10基因表达可抑制癌细胞活力,诱导细胞凋亡,下调免疫抑制因子VEGF和TGF-β1表达,机制可能与下调Notch信号通路有关。     

转基因内皮细胞的构建及其在复合血管上种植的初步研究

目的:为了解决小口径(直径7mm以下)人造血管术后通畅率低下的问题,利用生物-人工复合血管,结合分子生物学手段,将转入血管内皮生长因子(VEGF165)基因的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)种植于复合血管内腔面,为解决此临床难题提供新的思路和手段。材料方法:构建VEGF165真核表达质粒pCI-neo-VEGF165,获得正确的质粒用于转染HUVEC。从中科院购买HUVEC(代号:ECV-304),用脂质体介导法将pCI-neo-VEGF165转入细胞,经G418筛选后,计数阳性克隆,以比较脂质体和质粒在不同比例情况下转染效率的高低。实验组按质粒和脂质体比例的不同分为4组:1μg/3μl;2μg/6μl;2μg/8μl;3μg/12μl。ELISA检测瞬时转染后HUVEC培养上清中VEGF的表达。再将VEGF165基因瞬时转入HUVEC,利用自己设计的旋转培养装置,将细胞均匀地粘附、种植于复合血管内腔面。复合血管是人工材料(聚酯)和生物材料(成纤维细胞长入,胶原形成)有机结合而成,是将包有聚酯网的硅胶棒埋入绵羊背部皮下组织,3个月后取出,抽去硅胶棒而得到的。结果:脂质体转染效率以2μg/8μl组阳性克隆数最多;ELISA测定瞬时转染后HUVEC培养上清中VEGF的表达量为532·5±43·1pg/ml。使用旋转培养装置的细胞均匀地粘附于复合血管,未使用者细胞积聚于血管腔面下部;转入和未转入VEGF165基因的HUVEC在复合血管内腔面覆盖面积百分比分别为69·9%±3·5%、43·7%±2·5%,有明显改善。结论:转入VEGF后可促进HUVEC在复合血管上生长,旋转培养装置有利于细胞的均匀粘附。     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。 目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。 方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA 进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。 结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165 cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。     

VEGF对大鼠海马回神经干细胞体外增殖和分化的影响

目的： 观察血管内皮细胞生长因子(VEGF)对大鼠海马回神经干细胞（NSCs）增殖和分化的影响。方法: 自生后第3 d的SD大鼠脑海马区分离NSCs，进行体外培养并传代，分为2组：（1）VEGF组加入150 μg/L VEGF的培养液培养；（2）对照组未加VEGF。培养7 d后，撤除VEGF，分别在第7 d及第11 d通过相差显微镜观察细胞形态，并用免疫荧光方法检测nestin和NF的表达，计算各组免疫染色阳性细胞率。结果: 在VEGF作用下第7 d，VEGF组nestin阳性细胞率为52.19%±7.95%，多于对照组的29.26%±4.12%（P<0.01），NF阳性细胞率为22.33%±4.13%，对照组仅有38.62%±5.31%（P<0.01）；在实验第11 d，VEGF组NF阳性细胞率为43.10%±3.70%，对照组仅30.56%±4.16%，P<0.01。结论: 本实验提示VEGF能促进NSCs的增殖,并抑制其分化。     

重组人CD40配体对卵巢癌SKOV3细胞生长特性的影响

目的： 观察重组人CD40配体（rhCD40L）对卵巢癌细胞株SKOV3增殖、表面抗原变化、细胞周期、凋亡相关基因及肿瘤坏死因子受体相关因子( TRAFs)的影响。 方法： 在体外将SKOV3细胞与不同浓度的rhCD40L作用72 h后MTT法测定细胞增殖；直接免疫荧光标记流式细胞术测定细胞表面抗原及TRAFs变化，RT-PCR法测定凋亡相关基因c-myc、bcl-2、bcl-xl的表达程度，并用Annexin V和PI双标记测定细胞凋亡水平。 结果： rhCD40L在100 μg/L的低剂量时即可抑制SKOV3细胞增殖（0.65±0.10 vs 0.81±0.05），其作用随着rhCD40L浓度的增加而加强，10 mg/L时抑制率达（0.13±0.12 vs 0.83±0.15，P＜0.01），呈明显的浓度相关性，并使细胞分裂阻滞于G1期；rhCD40L可上调SKOV3细胞CD95的表达（42.4% vs 59.2%, P＜0.05），下调抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl的表达，促进其凋亡；SKOV3细胞高表达TRAF2（81.3%±9.2%）、TRAF5（47.2%±7.2%）和TRAF6（44.5%±6.3%），rhCD40L可显着下调TRAF2（50.4%±5.3%，P＜0.05）、TRAF5（7.2%±2.1%，P＜0.01）和TRAF6（5.1%±1.1%，P＜0.01）表达，而上调TRAF3（25.2%±6.2% vs 68.8%±5.3%，P＜0.01）表达，对TRAF1（4.3%±1.2% vs 5.1%±1.4%）和4（7.4%±1.2% vs 8.1%±1.4%）的表达则无作用。 结论： rhCD40L通过下调bcl-2和bcl-xl基因表达，并改变细胞内TRAFs表达，使SKOV3细胞的增殖受阻滞于G1期，并促进其凋亡。     

DDAH2抑制低氧诱导大鼠心肌细胞H9c2(2-1)凋亡

 目的 探讨过表达二甲基精氨酸二甲胺水解酶-Ⅱ（DDAH2）对低氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用和是否通过内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活化来保护心肌细胞。方法 低氧诱导大鼠心肌细胞H9c2(2-1)36h从而诱导凋亡,同时转染DDAH2真核细胞表达质粒,用WST-1细胞毒试验和流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测eNOS磷酸化。结果 低氧组心肌细胞存活率显著性降低;过表达DDAH2基因使低氧下心肌细胞存活率明显地上升。DDAH2过表达组心肌细胞凋亡率为17.38%±1.52%,显著性低于低氧组（27.34%±1.33%）（P<0.05）。转染DDAH2基因可以显著上调低氧组心肌细胞的eNOS磷酸化水平;过表达DDAH2基因的低氧组用eNOS抑制剂L-NAME干预后,凋亡水平明显上升。结论 过表达DDAH2基因上调eNOS磷酸化抑制低氧所致的大鼠心肌细胞H9c2（2-1）凋亡。     

血管内皮细胞生长因子基因转染骨髓基质细胞的瞬时表达与稳定表达

目的探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因修饰的大鼠骨髓基质细胞（BMCS）的表达能力及表达活性。方法取6周龄SD大鼠BMCS传代培养后以3μl阳离子脂质体（Lipofectamine）：1μg pc DNA3．1-VEGF165的比例转染，通过RT—PCR技术、免疫组织化学S—P法检测转染细胞中外源性VEGF165基因的转录及瞬时表达和稳定表达，用血管内皮细胞（VEC）增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果VEGF基因转染的大鼠骨髓基质细胞可有效转录VEGF165，其分泌培养上清液中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖，具有很强的生物活性。结论采用基因转染技术可将VEGF转染至BMCS中，并可有效表达具有生物活性的VEGF。     

RNA干扰survivin基因提高淋巴瘤细胞对阿霉素的敏感性

目的：探讨RNA 干扰下调Burkitt淋巴瘤Daudi细胞系凋亡抑制基因survivin的表达对阿霉素敏感性的影响。方法：构建survivin发夹RNA（shRNA）真核表达载体, 脂质体介导转染Daudi细胞。多重RT-PCR 检测 survivin mRNA 表达；Western blotting 检测Survivin蛋白表达；流式细胞仪（FCM）检测干扰前后细胞凋亡率；MTT 法检测干扰前后细胞对化疗药物阿霉素（adriamycin,ADR）敏感性变化。结果：与无功能control-shRNA处理组和PBS处理组比较，转染survivin-shRNA 细胞的survivin mRNA和蛋白表达率显著降低，抑制率分别为62.32% 和61.88% (P<0.05)；FCM结果示转染组细胞凋亡指数（apoptosis index, AI) 显著高于两对照组(P<0.05)； MTT结果显示，转染组细胞的阿霉素半数抑制浓度(IC50)为（0.25±0.43） μmol/L，显著低于无功能control-shRNA处理组（0.87±0.21） μmol/L和PBS处理组(0.91±0.36) μmol/L,P<0.05；相同剂量ADR对转染细胞的生长抑制率明显高于PBS组和control组。结论： 发夹RNA干扰survivin基因可显著提高Daudi细胞凋亡率和对化疗药物阿霉素的敏感性。     

pEGFP—VEGF165重组质粒的构建及在血管内皮细胞中的表达

采用PCR技术,从原核表达质粒PUC19-VEGF165中获得上下游含有HindⅢ和BamH I酶切位点的目的基因VEGF165,与真核载体pEGFP-C1构建重组质粒pEGFP-VEGF165,观察其在内皮细胞中的表达。结果表明,带有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-VEGF165构建成功,并在PEI的介导下成功转染脐静脉内皮细胞（HUVEC）,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白表达,ELISA检测证明VEGF在细胞上清中有效表达,RT—PCR证明了VEGF165mRNA水平上的有效表达。此研究结果将为再狭窄的基因治疗提供实验基础。     

人VEGF165基因真核表达质粒的构建及其对血管内皮细胞增殖的影响

目的 :构建人VEGF16 5基因的真核表达质粒pBudCE4 .1/VEGF16 5 ,观察其在血管内皮细胞 (VEC)中的表达和表达产物对VEC增殖的影响。方法 :用RT PCR法从引产胎儿心脏组织中克隆VEGF16 5基因 ,并将其克隆至真核表达质粒pBud CE4 .1中 ,对重组真核表达质粒pBudCE4 .1/VEGF16 5进行酶切鉴定和测序。以脂质体转染法将pBudCE4 .1/VEGF16 5导入VEC中 ,用Northernblot和免疫细胞化学染色法 ,分别从mR NA水平和蛋白质水平检测它们在转染的VEC中的表达 ,并检测表达产物对VEC增殖的影响。结果 :人VEGF16 5基因的RT PCR产物为 5 76bp。测序结果显示 ,扩增的VEGF16 5基因的序列与基因文库中登录的序列完全一致。经HindⅢ和BamHI酶切鉴定证实 ,VEGF16 5基因已成功地克隆至真核表达质粒pBudCE4 .1中。以其转染血管内皮细胞 (VEC)后 ,经Northernblot杂交和免疫细胞化学染色法检测均证实VEGF16 5基因表达。表达产物对VEC增殖有明显的促进作用。结论 :所构建的pBudCE4 .1/VEGF16 5真核表达质粒可在VEC中表达 ,表达产物可明显促进VEC增殖 ,为通过VEGF16 5基因转染防治移植器官内血管的狭窄奠定了基础     

血管内皮生长因子在哺乳动物细胞中的表达

目的 :建立血管内皮生长因子 (VEGF)的真核表达系统 ,获得具有生物活性的VEGF蛋白质。方法 :采用RT PCR方法 ,从人胎肝组织中克隆VEGF全长cDNA ,构建重组真核表达质粒pcDNA3 VEGF16 5 ,用Lipofectin介导转染入Hela细胞 ,收集转染的Hela细胞培养上清 ,用RT PCR和Westernblot法检测外源基因的转录和表达 ,Miles及人脐静脉内皮细胞增殖实验检测上清中VEGF16 5的生物学活性。结果 :转染的Hela细胞有VEGF16 5的转录和表达 ,且证实所表达的VEGF16 5具有增加血管通透性和内皮细胞增殖活性。结论 :构建的VEGF16 5真核表达系统能够表达具有生物活性的VEGF16 5蛋白质。     

阿托伐他汀影响自发性高血压大鼠血压的机制探讨

目的：探讨阿托伐他汀控制自发性高血压大鼠（SHR）高血压的机制，研究阿托伐他汀对SHR血浆内皮素-1（ET-1）和主动脉一氧化氮合酶（NOS）的影响，以及对SHR的主动脉平滑肌细胞（ASMC）凋亡和P27蛋白表达的影响。 方法： 选用8周龄SHR 12只，随机分为阿托伐他汀治疗组（ATV组, n=6）和SHR组（n=6），并以同周龄WKY（n=6）作为对照。ATV组给以阿托伐他汀（50 mg·kg-1·d-1）灌胃。10周后观察3组大鼠血压、血清总胆固醇（TC）、总甘油三酯（TG）含量变化，血浆ET-1和主动脉NOS活性的改变，以及TUNEL法检测ASMC凋亡率，测定动脉ASMC P27蛋白表达。 结果： 阿托伐他汀给药10周后，ATV组动脉收缩压显著低于SHR组［（134.17±3.60）mmHg vs （173.33±3.78）mmHg, P<0.01］；ATV组血清TC和TG浓度均显著低于SHR组（P<0.01, P<0.01）。同时，阿托伐他汀显著降低SHR血浆ET-1水平［（130.04±40.07）ng/L vs （196.74±59.69）ng/L，P<0.05］和增加SHR主动脉NOS活性［(0.189±0.040）kU/g protein vs （0.124±0.057）kU/g protein，P<0.01］；ATV组ASMC凋亡率显著高于SHR组（16.94%±3.08% vs 9.01%±2.36%, P<0.01）；ATV组ASMC P27蛋白表达阳性率显著高于WKY大鼠（33.02%±5.01% vs 24.25%±4.41%, P<0.05），而SHR组该指标明显低于WKY大鼠（16.08%±7.09% vs 24.25%±4.41%, P<0.05）。 结论： 阿托伐他汀控制SHR血压增高，其机制可能与降低SHR的血浆ET-1水平和增高主动脉NOS活性，以及增高ASMC凋亡率和P27蛋白表达阳性率有关。