丙型肝炎患者HCV—RNA与肝损害的关系

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染后血清ＨＣＶ—ＲＮＡ、抗ＨＣＶ及肝功ＡＬＴ水平的检测对丙型肝炎（ＨＣ）的早期诊断、肝病的活动及病毒的复制判断都有一定意义。本文作者对临床上不同类型的６３例丙肝患者同时检测了ＨＣＶ—ＲＮＡ,抗ＨＣＶ及血清ＡＬＴ,对其相互间的关...     

核糖核酸阻抑家兔肝纤维化的作用机制探讨

通过电镜，生化，免疫学等方法观察了ＲＮＡ对感染尾蚴兔的作用，结果表明，ＲＮＡ能使感染尾蚴兔肝细胞核仁增大，粗面内质网及其颗粒增多，肝ＲＮＡ含量增加，血浆ＴＮＦα降低，分析结果提示ＲＮＡ是通过其模板作用和基因调控作用，免疫调节作用等阻换兔肝化进展加重的。     

核糖核酸抗肝纤维化疗效的临床观察

肝纤维化的发展与肝病的进展及预后有密切关系,将病变终止于肝纤维化阶段甚或逆转至正常是治疗慢性肝病的主要目的。核糖核酸(RNA)治疗慢性肝炎和肝硬变有改善症状和肝功能的疗效,且有提高患者血清白蛋白的作用[1]。作者采用RNA治疗慢性肝炎62例,以进一步探讨其抗肝纤维化的疗效作用。1　资料与方法1.1　病例选择与分组　选择1998年6月～1999年3月在本院住院的慢性乙肝患者62例,均为男性,年龄22～56岁(32.4±10.7岁),病程19～51月(34.7±11.3月),肝功ALT115～470IU/L(178.2±29.6IU/L),TBi(23.5～61.4μmol/L),其他肝功能及肝纤维化…     

噪声对小鼠肝脏RNA含量的影响

观察噪声暴露对小鼠肝脏ＲＮＡ含量的影响。结果表明，噪声作用３０＇、６０＇及９０＇的小鼠肝脏细胞质ＲＮＡ含量比对照明显降低。     

丙型肝炎患者HCV-RNA含量与其肝组织损害的关系

目的：观察慢性丙型肝炎患者肝损害与体内病毒含量之间的关系。方法：应用肝穿刺活检进行肝脏病理学检查，应用定量PCR检测患者体内的HCV－RNA，并进行对比研究。结果：在肝组织炎症活动度G3与G1，G4与G1、G2之间，纤维化程度S3与S1，S4与S1、S2之间，血清HCV－RNA含量有显著性差异（P＜0．05）。结论：丙型肝炎患者体内HCV－RNA含量与肝组织损害程度有关。     

RNA干扰survivin基因对人肝癌HepG2细胞增殖影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制survivin基因表达对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的影响.方法 构建针对人肝癌HepG2细胞 survivin基因3个不同靶序列的 shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-323/387/52,用Lipofectamine 2000脂质体介导转染法转染质粒, 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测survivin 基因mRNA表达水平.选择对survivin基因表达抑制作用最强的shRNA载体转染HepG2细胞后, 免疫细胞化学法(ICC)检测HepG2细胞survivin蛋白的表达情况,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞的增殖情况.结果 与对照组比较,构建的3个shRNA质粒中pshRNA-survivin-387转染组survivin mRNA水平下调,差异有显著性(F=18.64,q=4.293～4.925,P<0.05),而pshRNA-survivin-323/52质粒对survivin的表达及mRNA水平的影响差异无显著性(q=0.631～0.126,P>0.05).转染pshRNA-survivin-387质粒的HepG2细胞survivin蛋白表达较对照组明显下调(F=68.39,q=13.71、14.37,P<0.01),其增殖能力较对照组显著下降(F=20.06～47.65,q=11.186、 12.601,P<0.01).结论 构建的针对人survivin基因387位靶序列的shRNA表达载体pshRNA-survivin-387可显著抑制survivin的表达及HepG2细胞增殖.     

应用载体介导的RNA干扰技术抑制肝癌细胞H-rasVal12的表达

目的观察载体介导的RNA干扰(RNAi)技术对肝癌细胞突变的H-rasVal12表达的抑制作用。方法将针对突变H-ras的短发夹RNA(shRNA)质粒表达载体转染肝癌细胞株BEL7402和SMMC7721,用免疫印迹(Western blot)法检测H-ras蛋白的表达,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。计量资料比较采用t检验;计数资料比较采用χ2检验。结果 (1)转染前、后SMMC7721的H-ras蛋白表达量〔光密度值分别(1 752±21)和(1 736±28)〕比较,差异无统计学意义(t=0.474,P=0.646);而转染了H1-shRNA的BEL7402的H-ras蛋白表达量(920±11)与转染前(1 221±11)比较,差异有统计学意义(t=20.126,P<0.01);转染了H2-shRNA的BEL7402的H-ras蛋白表达量(872±10)与转染前(1 201±10)比较,差异有统计学意义(t=23.477,P<0.01)。H1-shRNA组和H2-shRNA组H-ras蛋白表达下调了62.8%和63.4%。(2)流式细胞仪检测表明,BEL7402转染H1-shRNA质粒后细胞凋亡率(47.7%)与转染H2-RNA质粒后细胞凋亡率(49.3%)比较,差异无统计学意义(χ2=0.005,P=0.94);但均高于BEL7402转染对照质粒后细胞凋亡率(30.2%),差异有统计学意义(χ2H1=6.810,P<0.01;χ2H2=6.103,P<0.01)。结论载体介导的RNAi技术可有效特异抑制肝癌细胞突变的H-rasVal12表达,对野生型的H-ras表达无影响。     

大鼠家兔蟾蜍肝组织核酸含量的检测及进化关系的研究

应用比色法对大鼠、家兔、蟾蜍三组动物肝组织核酸含量进行测定，发现肝组织核酸含量以蟾蜍最多，大鼠次之、家兔最少，ＲＮＡ／ＤＮＡ比值则以大鼠最大，家兔次之，蟾蜍最小。表明三组动物的进化程度与其肝组织核酸含量无相关性，与ＲＮＡ／ＤＮＡ比值有关。     

NogoB-shRNA表达质粒的构建及其在大鼠原代肝星状细胞收缩中的作用

目的 构建针对大鼠NogoB基因的shRNA表达质粒,并初步探究其在大鼠肝星状细胞（HSCs)收缩功能中的作用。 方法 设计并合成针对大鼠NogoB基因3个不同位点的shRNA,通过DNA重组技术,将shRNA插入pSuper质粒中,构建NogoB-shRNA重组质粒,转染至大鼠原代肝星状细胞(HSCs)中,并通过Real-time PCR技术检测基因的相对表达量,筛选出能沉默大鼠NogoB基因的重组质粒,再通过Western blot加以验证,同时观察NogoB基因被抑制后,HSCs中内皮素1（Endothelin-1,ET-1)受体A、受体B（ETA、ETB）表达水平的变化。 结果 构建的3对重组质粒中,NogoB-shRNA2对NogoB的基因的表达具有明显的抑制作用。NogoB基因被抑制后,大鼠HSCs中ETA的表达无明显变化,ETB的表达升高,ETA/ETB的水平降低。 结论 成功构建了有效、特异的抑制大鼠NogoB基因表达的shRNA表达质粒,并初步观察到NogoB在肝星状细胞的收缩中可能有一定作用。     

Smad2特异性siRNA转染肝星状细胞的效率检测

[目的]提高siRNA表达载体在肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)中的转染效率。[方法]pEGFP-C1-CR4转染原代HSCs、HSC-T6细胞株,实验根据质粒DNA和阳离子脂质体的不同比例分为4组:1μg/0μL、1μg/1μL、1μg/2μL、1μg/4μL,1μg/0μL为对照组,其余3组为实验组。转染48 h后,使用荧光显微镜观察转染情况,同时流式细胞仪计算转染效率。[结果]质粒DNA和阳离子脂质体的比例为1μg/2μL和1μg/4μL时,原代HSCs转染效率为(56.55±3.12)%和(58.62±2.03)%(P>0.05),HSC-T6细胞株转染效率为(24.52±3.55)%和(25.49±2.33)%(P>0.05)。同样比例条件下,原代HSCs的转染效率显著高于HSC-T6细胞株的转染效率(P<0.05)。在实验组质粒、脂质体比例为1μg/2μL和1μg/4μL时,同种细胞的转染效率均无显著差别(P>0.05)。[结论]采用质粒DNA和阳离子脂质体的比例为1μg/2μL、1μg/4μL的条件,均能够在HSCs和HSC-T6中获得最佳转染效率,但前者更为经济。     

微小RNA和肝星状细胞关系的研究进展

肝纤维化是各种慢性肝病进一步发展至肝硬化、肝细胞癌的必经阶段,肝星状细胞(HSCs)的激活是肝纤维化发生发展的核心环节,MiRNAs在HSCs静息型和活化表型之间的调控发挥着重要作用。重视MiRNA在调控HSCs中的作用,可为肝纤维的预防、诊断、治疗提供新的思路和策略。     

大鼠家兔蟾蜍肝组织核酸含量的检测及与进化关系的研究

应用比色法对大鼠、家兔、蟾蜍三组动物肝组织核酸含量进行测定，发现肝组织核酸含量以蟾蜍最多，大鼠次之，家兔最少，ＲＮＡ／ＤＮＡ比值则以大鼠最大，家兔次之，蟾蜍最小。表明三组动物的进化程度与其肝组织核酸含量无相关性，与ＲＮＡ／ＤＮＡ比值有关。     

RNA干扰survivin基因对HepG2细胞凋亡及化疗影响

目的 探讨RNA干扰survivin基因对HepG2细胞凋亡及化疗敏感性的影响.方法 构建针对HepG2细胞 survivin基因的 shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-387.将HepG2细胞接种于6孔板中,分为空白对照组(不加药物)、阴性对照组(每孔加pshRNA-survivin-NC为3.2 μg)、低浓度转染组(每孔加pshRNA-survivin-387为0.8 μg)、中浓度转染组(每孔加pshRNA-survivin-387为1.6 μg)、高浓度转染组(每孔加pshRNA-survivin-387为3.2 μg),作用48 h后收集细胞,流式细胞术检测各组细胞凋亡指数;将HepG2细胞接种于96孔板中,分为3组:空白对照组(不加药物)、阴性对照组(每孔加pshRNA-survivin-NC为0.2 μg)、实验组(每孔加 pshRNA-survivin-387为0.2 μg),四甲基偶氮唑蓝法检测各组细胞分别与顺铂(2.0 mg/L)作用24、36、48、60 h后的增殖水平.结果 各浓度转染组细胞的凋亡指数明显高于空白对照组和阴性对照组(F=228.87,q=10.45～38.21,P＜0.01),高浓度转染组细胞凋亡指数高于低浓度转染组(q=23.99,P＜0.01).顺铂对实验组细胞的细胞抑制率在24、36、48、60 h时明显高于空白对照组和阴性对照组(F=235.88～910.86,q=28.04～52.28,P＜0.01).结论 pshRNA-survivin-387转染能诱导肝癌细胞的凋亡,增强肝癌细胞对顺铂化疗的敏感性.     

胎肝特异性癌胚RNA——AK003710的筛选及功能研究

目的 筛选胎肝特异性癌胚RNA,探讨其对肝癌细胞增殖、侵袭能力的影响.方法 对小鼠肝发育和肝再生的长链非编码RNA(IncRNA)芯片数据进行生物信息学分析,筛选得到在胎肝和再生肝脏中均高表达的候选IncRNA,利用实时定量PCR在小鼠肝癌组织中对候选IncRNA进行表达水平检测,综合芯片分析及实时定量PCR结果,选择表达差异最明显的IncRNA行进一步研究.首先在胎肝和肝再生模型中验证该IncRNA的表达,然后利用siRNA技术干扰该IncRNA,再通过EdU标记技术和Transwell实验分别检测细胞的增殖能力和侵袭能力.结果 生物信息学分析筛选得到在胎肝和再生肝脏中均高表达的7条IncRNA,其中3条在小鼠肝癌组织中较正常肝组织高表达,3条表达无差异,1条无表达;高表达的3条IncRNA中,IncRNA-AK003710在小鼠肝发育和肝再生芯片中的差异表达倍数最高,可作为进一步研究对象.进一步验证显示IncRNA-AK003710在胎肝及多种肝损伤修复模型中表达上调;功能实验表明对IncRNA-AK003710靶向干扰后能降低小鼠肝癌细胞Hepa1-6的增殖和侵袭能力.结论 IncRNA-A003710在胎肝、再生肝组织及肝癌组织中均高表达,是胎肝特异性癌胚RNA,可调控肝癌细胞的增殖及侵袭过程,有望成为肝癌治疗的潜在靶点.     

环状RNA-42398在肝纤维化模型中的表达变化及功能

目的：明确环状RNA-42398（mmu_circ_42398）在肝纤维化动物模型肝组织和细胞模型中的表达变化,并初步探讨其生物学功能。方法：制备小鼠肝纤维化动物模型,复制小鼠肝星状细胞（JS1）活化模型、小鼠肝细胞（AML12）氧化应激损伤模型、小鼠巨噬细胞炎症（RAW264.7）模型,分别设立正常组,qPCR检测mmu_circ_42398在上述模型肝组织和细胞中的表达变化,进一步采用生物信息学方法预测其靶基因,分析其生物学功能,绘制其ceRNA信号通路网络图。为了验证其功能,构建mmu_circ_42398过表达载体,将其转染至JS1细胞,然后检测细胞内a-SMA、ColI蛋白的表达改变。结果：相比对照组,mmu_circ_42398在小鼠肝纤维化模型肝组织中表达显著降低（P ＜0.05）,在JS1活化、AML12氧化应激损伤、RAW264.7炎症损伤3种细胞模型中表达均显著降低（P ＜0.05）。生物信息学分析预测mmu_circ_42398可能通过结合靶基因miR-338-3p从而影响肝星状细胞的活化。在JS-1细胞中过表达mmu_circ_42398后,a-SMA、ColI蛋白表达显著降低（P ＜0.05）。结论:mmu_circ_42398表达在肝纤维化模型中发生了明显变化,其可能通过抑制肝星状细胞的活化,参与了肝纤维化的进展。     

RNA干扰技术在肝星状细胞活化信号通路的应用

肝纤维化是各种致病因子致肝细胞损伤后的修复过度。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活被认为是肝纤维化的核心环节,实验证实多条信号传导通路参与HSC的激活。RNA干扰(RNA interference,RNAi)能有效沉默目的基因,以HSC活化信号通路为切入点,设计小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)抑制相关信号通路的活化,从而达到抑制HSC,激活是目前研究肝纤维化机制的主要手段。该研究综述了RNAi技术在研究HSC活化信号途径中的作用,以求为治疗肝纤维化提供一种新思路。     

siRNA沉默结缔组织生长因子对鼠肝星状细胞生物学特性的影响

目的研究化学合成的小干扰RNA（483 siRNA）对大鼠原代肝星状细胞（HSCs）结缔组织生长因子（CTGF）蛋白表达及细胞生物学特性的影响。方法以胶原酶原位灌注消化、密度梯度离心分离大鼠原代HSCs,以脂质体Oligofectamine包裹483 siRNA转染培养72h的原代HSCs作为转染组,并设空白对照组。收集孵育96h的HSCs及培养上清液,采用Western blotting、免疫细胞化学染色、MTT和RT—PCR法分别检测细胞CTGF蛋白表达、α-SMA表达、细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达;放射免疫法检测培养上清液中透明质酸及Ⅲ型前胶原含量。结果与对照组比较,转染组HSCs的CTGF蛋白表达下调（92&#177;5）％,α—SMA染色阳性细胞减少（58&#177;6）％,细胞增殖活性下调（18&#177;5）％,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达分别下调（53&#177;6）％和（41&#177;7）％;培养上清中透明质酸和Ⅲ型前胶原含量分别降低（48&#177;5）％和（33&#177;8）％。结论483 siRNA能显著下调原代HSCs CTGF蛋白表达,并由此抑制细胞活化、增殖及细胞外基质的合成和分泌。提示针对CTGF靶位的siRNA可能具有防治肝纤维化的潜力。