胎儿海马神经干细胞的体外培养及神经元前体细胞的纯化

目的　从人胎儿海马分离培养具有自我更新和多向分化能力的神经干细胞 ,并从中纯化神经元前体细胞。　方法　利用无血清培养从胚胎 4个月的胎儿海马区分离细胞 ,并在体外连续传代培养 ;采用免疫荧光细胞化学技术检测神经上皮干细胞蛋白 (nestin)的表达、经BrdU孵育后的BrdU表达 ;比较两种诱导分化方法所获得的神经元和胶质细胞的比例差异 ;利用单细胞克隆技术纯化神经元前体细胞。　结果　分离的细胞具有连续克隆能力 ,在体外培养了 16个月 ,传了 4 3代 ;细胞冻存、复苏后仍保持干细胞特性 ;培养的细胞呈Nestin阳性 ,在BrdU孵育后呈BrdU阳性 ,诱导分化后的细胞能够表达Tubulin、NeuN或GFAP ;利用无血清诱导所得到的分化细胞中神经元的比例约占 80 % ,而血清诱导的分化细胞中胶质细胞的比例则大于 90 %。利用单细胞克隆技术可从神经球中纯化的细胞表达Nestin ,并且全部分化成神经元。　结论　从胎儿海马区分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能 ,属于神经干细胞 ,从中可纯化出神经元前体细胞     

人胚胎脑海马神经前体细胞的分离培养及形态学研究

目的 :从人胚胎脑海马区分离、培养并鉴定神经前体细胞 ,观察其形态学变化。方法 :取胎龄 8～ 12周人胚胎脑海马区细胞 ,用含人表皮生长因子 (h -EGF)、人碱性成纤维细胞生长因子 (h -bFGF)以及人白细胞抑制因子 (h -LIF)的DMEM F12培养液离体培养 ,以 1%胎牛血清 (FBS)和多聚赖氨酸诱导分化 ,倒置显微镜下测量形态指标 ,免疫细胞化学反应分析其神经化学性质。结果 :原代培养中 ,可见许多悬浮生长并渐增大的细胞球 ,以及很少数贴壁生长的成簇或单个细胞。将球吹打传代后 ,又有许多新的细胞球生成。取细胞球诱导分化 ,则见细胞从球迁出、伸出突起并渐分支 ,细胞分别 β -Ⅲtubulin、NF - 2 0 0、GFAP、Galc等免疫细胞化学反应阳性。 结论 :人胚胎脑海马区有神经前体细胞存在 ,离体培养时能分裂增殖和自我更新 ,并能被诱导分化为神经元前体细胞、神经细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞     

免疫磁珠体外纯化人胎脑中CD133阳性干细胞的实验研究

为了探讨免疫磁珠体外纯化人胎儿脑内 CD13 3阳性细胞的可行性 ,本研究取人胎儿脑室下区并制备单细胞悬液 ,采用磁珠分选法选择 CD13 3阳性细胞群 ,台盼蓝染色观察活力并采用流式细胞仪鉴定纯化前后 CD13 3的阳性表达率。结果显示 ,分选后所得细胞纯度为 ( 85 .5 7± 1.66) % ,回收率为 ( 62 .3± 18) % ,纯化前后细胞活力无显著性差异 ( P>0 .0 5 )。结论 :联合应用CD13 3表面标志及免疫磁珠分选系统可有效地从人胎儿脑组织中直接分离得到高纯度的 CD13 3阳性干细胞 ,细胞活力不受影响     

大鼠大脑皮质神经前体细胞的分离培养及其增殖分化鉴定

目的:体外分离和培养大鼠大脑皮质神经前体细胞并进行增殖和分化鉴定。方法:分离2周龄大鼠皮质神经前体细胞,在含EGF、bFGF和GDNF的NSC培养基中进行体外培养,使用免疫细胞荧光染色技术对细胞的分化特性进行鉴定。结果:EGF、bFGF和GDNF可促进神经前体细胞的增殖及神经球的克隆形成,并获得了Nestin阳性的神经前体细胞,其可分化为分别表达β-Ⅲtubulin、GFAP和GalC的阳性细胞。结论:体外分离和培养的大脑皮质神经前体细胞,在含EGF、bFGF和GDNF的NSC培养基中培养,具有增殖分化的能力,有望应用于神经系统疾病的细胞移植治疗。     

人视网膜前体细胞的体外培养、纯化和诱导分化

目的体外培养和纯化人视网膜前体细胞,研究其分化的诱导因素。方法培养3~5个月人胚胎视网膜前体细胞,鉴定其神经干细胞特性。流式细胞术比较其传代前后的含量。观察不同培养条件对其分化的诱导。结果人视网膜前体细胞能分裂增殖,形成原代和子代神经球,表达Nestin,分化后表达神经烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、蛋白激酶C和神经突触素。传代后Nestin表达量[(39.3±18.9)%]显著高于原代[(28.7±17.7)%](P<0.05)。视网膜组织片上清液诱导后神经烯醇化酶表达量[(69.3±6.5)%]高于自发分化者[(59.5±7.6)%](P<0.05)。视紫红质表达量[(7.5±2.9)%]则低于自发分化者[(13.2±3.2)%](P<0.05)。组织共培养后,同一区域内细胞集中向特定细胞分化。结论体外培养的人视网膜前体细胞能自我纯化,不同诱导形式使其分化发生偏差。     

免疫磁珠分离脐血CD133阳性细胞的方法研究

目的探讨免疫磁珠分离脐血CD133阳性细胞的方法。方法6%羟乙基淀粉(HES)和Ficoll-Paque联合应用分离出脐血中单个核细胞,再用MACSCD133磁珠分离试剂盒分选其中的CD133+细胞。结果经MACS分离的脐血中CD133+细胞数平均为(6.3±2.9)×105/ml,占单个核细胞的(1.41±1.14)%,经流式细胞仪检测CD133+细胞纯度为75%￣85%。结论免疫磁珠法是分离脐血CD133阳性细胞的较好的方法。     

体外培养获取高纯度神经前体细胞

目的　获取较高纯度的神经前体细胞 (NPC)。方法　加入 30ng/mlbFGF培养E12天大鼠皮质、海马和隔区的NPC ,用免疫组化与免疫荧光组化方法将其显示。结果　加bFGF组的NPC不断分裂 ,形成大量的分裂球并维持到第 4代 ;绝大部分细胞 (约 98%以上 )表达Nestin ,约有 6 0 %为BrdU和Nestin免疫荧光双标阳性细胞。对照组的分裂球维持时间较短 ,随培养时间延长细胞向外迁移生长 ;第 2代约有 6 0 %细胞表达Nestin ,40 %为BrdU和Nestin免疫荧光双标阳性细胞。结论　bFGF对E12天大鼠脑组织的NPC有明显的促分裂作用 ,选用胎龄较小的胚脑组织加入适量的bFGF培养可获取较高纯度的NPC。     

人骨髓基质细胞培养、纯化和鉴定

目的:介绍一种为临床细胞学治疗提供自体骨髓基质细胞(BMSCs)的分离纯化方法.方法:采用红细胞沉降和密度梯度离心相结合的分离纯化方法从骨髓血中分离BMSCs.台盼蓝染色实验测定BMSCs活力;对BMSCs进行CD44、CD34抗体免疫荧光显色,激光共聚焦显微镜观察.结果:BMSCs活性大于95%,纯度大于85%,细胞的纯度和均一性均符合中国卫生部第三类医疗技术的要求,已达到临床应用标准.结论:本细胞制备方法简单易行,可批量获得BMSCs,满足临床治疗的需要.     

大鼠毛囊神经嵴干细胞分离培养及鉴定

目的:采用显微分离+组织块贴壁法培养大鼠毛囊神经嵴干细胞(hf NCSC)。方法:显微分离SD大鼠触须部毛囊膨凸部(bugle),采用组织块贴壁法培养毛囊神经嵴干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态。采用免疫荧光多重标记法检测Nestin和神经营养素受体p75(p75NTR)的表达。结果:用显微分离+组织块贴壁法可成功获得毛囊神经嵴干细胞,倒置显微镜下观察细胞活性好,形态多样,以梭形为主,也可见三角形、椭圆形细胞,核大而明显,多居于胞质一侧。免疫荧光鉴定显示细胞Nestin和p75NTR双阳性。结论:从SD大鼠触须部毛囊bugle区成功分离到毛囊神经嵴干细胞。     

人胎儿血红蛋白的纯化及免疫活性鉴定

目的研究胎儿血红蛋白纯化的最佳方法,并对其进行免疫活性鉴定。方法采用生理盐水洗涤、四氯化碳萃取得到粗提胎儿血红蛋白,再经sephadexG50凝胶层析柱纯化。纯化后的胎儿血红蛋白利用SDS—PAGE电泳、蛋白质印迹鉴定其性质。结果获得了具有生物活性的胎儿血红蛋白．经SDS-PAGE电泳鉴定纯化蛋白杂带消失,蛋白单体相对分子质量为16000Mr,纯度为95％,蛋白质印迹结果显示纯化后的蛋白具有良好的抗原性。结论该方法成功获得了纯度较高的胎儿血红蛋白,且操作简便,纯化效果好。     

胎儿脑组织体外保存获取神经干细胞的时限

目的　探讨人胎儿脑海马组织体外保存不同时限后培养获取神经干细胞的可行性。　方法　利用无血清培养 ,从死亡后孵育在 4℃Hank液 0h、4h、2 4h、4 8h、72h及 96h的胎儿海马分离细胞 ,在体外连续传代培养 ;采用免疫荧光细胞化学方法检测培养细胞的神经上皮干细胞蛋白 (nestin)表达、经BrdU孵育后的BrdU表达以及诱导分化后的神经元标记 (tubulin)或星型胶质细胞抗原 (GFAP)表达 ;比较不同时限的细胞在Nestin的表达、增殖能力和诱导分化后神经元及胶质细胞比例的差异。　结果　从保存在 4℃Hank液 72h以内的各组胎儿海马中均可获得具有连续增殖能力的神经球 ,培养出的细胞Nestin表达为阳性 ,通过BrdU的摄取表明细胞处于活跃的有丝分裂状态 ,在此期限内各组之间无明显差异 ;诱导分化后的神经元和胶质细胞比例在各组之间亦相似 ;但随着在Hank液中孵育时间的延长 ,所获得的神经球数量呈减少趋势 ;在 96h组则未能获得神经球。　结论　人胎儿海马组织在 4℃Hank液中孵育 72h内可培养出呈神经球样生长的神经干细胞 ,但神经球数量与孵育时间呈负相关     

人胚脑神经干细胞的分离培养、克隆和分化

探讨从人胚脑分离培养的神经干细胞在增殖和分化方面的生物学特点。用无血清培养技术从 4月龄人胎中脑组织中分离培养出神经干细胞 ,用有限稀释法获得单细胞克隆球 ,消化后用含 Brd U的培养液培养 ,待形成神经干细胞球后 ,进行 Brd U和nestin免疫荧光检测。取第 4代神经干细胞球用含 10 % FBS的培养液诱导分化 ,3周后分别进行神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性标记物 MAP-2、GFAP和 CNP免疫荧光检测。结果显示 ,单细胞悬液培养 2周后可形成神经干细胞球 ;神经球 Br-d U和 nestin免疫荧光检测均呈阳性 ;神经干细胞分化后呈 MAP-2、GFAP和 CNP阳性的三种类型细胞 ,但分化的神经元数量较少、胞体较小、突起较少。提示从人胚中脑组织中分离得到的神经干细胞具有增殖和自我更新能力 ,并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多分化潜能 ;与啮齿类动物相比 ,人神经干细胞增殖速度较慢 ,分化的神经元较少且稍欠成熟     

大鼠脑源性神经干细胞的分离培养

目的 探讨大鼠不同年龄组来源的神经干细胞体外培养和诱导分化的最佳条件。方法 分离12～15d大鼠胚胎、1～2d新生鼠的脑组织和成年大鼠脑的海马区和嗅球，在条件培养基(包含生长因子)中增殖培养，用神经干细胞的特异性单克隆抗体巢蛋白(nestin)鉴定克隆细胞；去除生长因子，降低血清浓度到2％后，诱导细胞分化，用神经细胞的特异性单克隆抗体鉴定分化细胞。结果 获得了大量可自我增殖并分化为3种神经细胞(神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞)的神经前体细胞。结论 在适当的分离培养条件下，可以获得大量的神经前体细胞，为神经干细胞的基础和临床研究提供细胞基础。     

人胚胎大脑皮层神经干细胞的分离培养

目的　为人神经干细胞的基础研究及临床应用提供细胞模型。　方法　采用无血清培养技术 ,分离培养了 10～ 14周人胚大脑皮层细胞 ,并用神经上皮干细胞蛋白 (Nestin)免疫组化鉴定培养细胞 ;5 %胎牛血清诱导其分化 ,神经丝 2 0 0 (NF 2 0 0 )和胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)免疫组化鉴定分化细胞。　结果　获得了大量未分化、呈簇状悬浮生长的神经干细胞团 ,且能被诱导分化成神经元和神经胶质细胞。经传 12代后仍具干细胞特性。　结论　本实验成功地分离培养了人胚胎大脑皮层神经干细胞 ,为神经干细胞的基础研究和临床应用奠定了基础。     

人循环纤维细胞的分离和鉴定

目的 建立分离、培养人循环纤维细胞的方法,并探讨其细胞生物学特征.方法 取成人外周血白细胞,经淋巴细胞分离液分离,接种于含20%胎牛血清的DMEM培养液中进行培养.对贴壁生长的成纤维样细胞进行免疫组织化学鉴定,流式细胞仪分析和电镜观察,并通过测定培养液中羟脯氨酸含量,研究其胶原合成能力.结果 细胞培养9d后CD34、CD45、Ⅰ型胶原分子阳性,其中Ⅰ型胶原分子阳性细胞含量为83.5%;电镜下观察具有典型的成纤维细胞特征;培养液中羟脯氨酸含量为11.17mg/L,明显高于空白对照组8.07mg/L (P＜0.01),表明培养细胞具有胶原合成能力.结论 成人外周血中存在成纤维细胞的前体细胞,经体外分离、培养可分化为循环纤维细胞.     

人胚全脑组织小分子提取物改善大鼠空间学习记忆

为检测胚胎组织小分子提取物的生物效应,本实验将或年SD大鼠随机分为两组:实验组腹腔内注射人胚全脑组织小分子提取液.对照组以生理盐水替代.1个月后用Morris水迷宫检测两组大鼠空间学习记忆能力.结果显示:实验组寻找平台潜伏期为12.18±4.92秒,显著短于对照组20.92±8.72秒;平台象限游泳距离占总距离百分比为40.51±6.53%,稍高于对照组37.69±5.04%.本结果提示人胚脑组织小分子提取物能作用于中枢神经系统,改善成年鼠的空间学习能力.     

人胎儿雪旺氏细胞的体外培养及其纯化研究

本实验用酶消化法从孕１４～１９周人胎儿周围神经中分离培养雪旺氏细胞，结合差速贴壁和阿糖胞苷处理进行纯化，根据Ｓ－１００蛋白免疫细胞化学染色和形态学特征，分析不同时期雪旺氏细胞的纯化程度。实验结果显示：培养４ｄ，倒置相差显微镜下观察，雪旺氏细胞呈典型的双极或三极形，端对端或旋涡状排列，Ｓ－１００蛋白免疫细胞化学染色呈阳性反应，其比例约占９８％；在２～３周内，雪旺氏细胞的纯度维持在８５％～９０％；培养３５ｄ，雪旺氏细胞约占８０％；单纯采用阿糖胞苷或差速贴壁处理，培养３５ｄ，雪旺氏细胞约占７０％；原代培养９２ｄ，传代１１代细胞生长良好。实验结果表明，多种方法联合使用较单一方法所得的纯度高。本方法快速、简便，能为雪旺氏细胞作为移植材料提供足够的来源。     

大鼠睾丸支持细胞的分离、纯化和鉴定

目的 培养高纯度的大鼠睾丸支持细胞,并应用检测ABP mRNA原位杂交方法加以鉴定.方法 选用18～22d龄SD雄性大鼠睾丸,采用0.25%胰蛋白酶、0.1%透明质酸酶、 0.1%胶原酶三酶依次消化法分离支持细胞,置于32℃ 5% CO2的培养箱培养,48h后用20mmol/L Tris-HCl低渗处理培养细胞.培养1周后应用伊红染色、吖啶橙荧光染色、Feulgen染色对所培养的支持细胞进行鉴定,同时应用原位杂交检测ABP mRNA方法鉴定分离培养的支持细胞.结果 培养1周后所获培养的支持细胞纯度达95%以上.分离培养的支持细胞ABP mRNA表达阳性,其形态结构特征与用其他方法鉴定为支持细胞的形态结构特征一致.结论 采用三酶连续消化及低渗处理法分离培养的支持细胞纯度高,而且应用原位杂交方法检测ABP mRNA是一种新的、特异、有效的鉴定支持细胞及其功能的方法.