人成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的建立不同组织来源成纤维细胞的培养方法并比较其培养差异。方法用消化法和贴壁法分离人胚胸主动脉成纤维细胞与人胚肺成纤维细胞,利用差速培养法纯化成纤维细胞,并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养的细胞行波形蛋白免疫染色鉴定。结果接种24 h后人胚胸主动脉成纤维细胞全部贴壁,48 h后细胞体积增大并伸出伪足,形状以梭形或不规则形为主;而消化的人胚肺组织中细胞形态不一,经继续培养4～5代后,培养物完全由成纤维细胞构成。结论用胶原酶Ⅰ消化人胚胸主动脉成纤维细胞效果好,而用胰蛋白酶液消化人胚肺成纤维细胞效果较好,用差速生长纯化的成纤维细胞可用于实验研究。     

雷帕霉素对培养的人Tenon’s囊成纤维细胞的作用

目的：观察雷帕霉素（rapamycin）对培养的人Tenon’s囊成纤维细胞的增殖及细胞周期的作用。方法：将培养的人Tenon’s囊成纤维细胞用含不同雷帕霉素浓度的培养液培养24h后，用MTT法测定细胞的增殖情况，用流式细胞仪测定细胞周期的变化情况。结果：用含10、20、40、80和160ng／ml雷帕霉素的培养液培养细胞时，细胞增殖抑制率分别为9．32％，22．55％，41．42％，42．25％，43．57％。细胞周期分析显示，雷帕霉素（40ng／ml）作用后，G0／G1期细胞较对照组增多（41．76％vs44、19％，P〈0.05），S期细胞较对照组减少（45．42％vs40．18％，P〈0．05）。结论：雷帕霉素具有抑制人Tenon’s囊成纤维细胞增殖的效果，且随浓度增加抑制作用增强，并将细胞抑制在G1期的限制点内。     

人工真皮成纤维细胞的分离培养与鉴定

目的:建立人工真皮成纤维细胞分离培养及鉴定方法.方法:取出生24 h内的Wistar大白鼠背部皮肤,分别用组织块法及酶消化法分离纯化、传代培养,用免疫组织化学方法进行鉴定.结果:用组织块法和酶消化法培养的成纤维细胞呈梭形,属纤维型细胞,免疫组织化学染色95%以上细胞中间丝波形蛋白呈棕色颗粒或棕色着染(阳性);结蛋白抗体和第Ⅷ因子相关抗原均无棕色颗粒或棕色着染(阴性),表明所培养的细胞为比较纯净的成纤维细胞.结论:该培养方法可提供较纯净的足够量的成纤维细胞.     

人Tenon’s囊成纤维细胞的离体培养及生长特性观察

目的离体培养人Tenon’s囊成纤维细胞,观察其生长特性。方法将人Tenon’s囊成纤维细胞进行离体培养及生长抑制实验,采用含10％胎牛血清的DMEM培养基,细胞计数法及MTT法描述细胞生长曲线。并通过免疫组织化学法对细胞进行鉴定。站果人Tenon’s囊成纤维细胞离体培养48h至7d处于对数生长期。细胞角蛋白染色阴性,波蛋白染色阳性。结论人Tenon’s囊成纤维细胞在体外易于生长,是细胞离体实验研究的良好材料。     

人肾间质成纤维细胞的培养与鉴定

探讨体外培养人肾间质成纤维细胞的方法。方法：取人肾乳头组织培养，通过细胞形态、免疫细胞化学色和右旋缬氨酰选择性培养基培养等手段进行细胞鉴定。结果：培养细胞呈梭形，单个核、表达波形蛋白，在选择在培养基内逐渐死亡。结论：该培养方法能获得高纯ｈＲＩＦｓ。     

兔眼角膜成纤维细胞原代培养

目的:建立眼角膜成纤维细胞体外培养的方法。方法:采用全角膜组织培养法培养兔角膜成纤维细胞。结果:在培养皿中培养1天后细胞开始贴壁,6天有新生细胞分出,形成梭形的成纤维细胞。传代细胞经4-6天可形成密集的成纤维细胞,细胞呈纤维状,呈漩涡形排列,排列整齐,局部细胞相互平行,第4、5代生长情况良好,细胞生长旺盛,细胞呈密集漩涡形排列。结论:眼角膜成纤维细胞全角膜组织培养法是可行的。     

犬皮肤成纤维细胞的分离、培养及鉴定

目的 探索和建立适用于犬皮肤成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的技术方法.方法 采用组织贴块培养法和胰蛋白酶、胶原酶I联合消化法对犬皮肤成纤维细胞进行体外培养、传代.并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养细胞行波形蛋白免疫荧光染色.结果 倒置相差显微镜下可见长梭形细胞生长,苏木素-伊红染色可见细胞呈漩涡状、平行排列,第5代细胞免疫荧光检测波形蛋白(vimentin)表达阳性.结论 建立了高效快速分离和稳定培养成纤维细胞的方法,为诱导犬心房纤维化提供了充足的种子细胞.     

雷帕霉素对培养的人Tenon′s囊成纤维细胞的作用

目的：观察雷帕霉素(rapamycin)对培养的人Tenon′s囊成纤维细胞的增殖及细胞周期的作用。方法：将培养的人Tenon′s囊成纤维细胞用含不同雷帕霉素浓度的培养液培养24h后, 用MTT法测定细胞的增殖情况，用流式细胞仪测定细胞周期的变化情况。结果：用含10、20、40、80和160ng/ml雷帕霉素的培养液培养细胞时，细胞增殖抑制率分别为9.32%，22.55%，41.42%，42.25%，43.57%。细胞周期分析显示，雷帕霉素(40ng/ml)作用后，G0/G1期细胞较对照组增多(41.76% vs 44.19%，P＜0.05)，S期细胞较对照组减少(45.42%　vs　40.18%，P＜0.05)。结论：雷帕霉素具有抑制人Tenon′s囊成纤维细胞增殖的效果，且随浓度增加抑制作用增强，并将细胞抑制在G1期的限制点内。     

人牙龈成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的：分离培养人牙龈成纤维细胞,为进一步研究细胞因子对牙龈成纤维细胞的调控作用提供实验条件。方法：用组织块法培养人牙龈成纤维细胞,并进行形态学和免疫学鉴定。结果：牙龈成纤维细胞原代培养成功并稳定传代,细胞呈长梭形或星形,免疫学鉴定抗波形丝蛋白抗体阳性,抗角蛋白抗体阴性,为中胚层来源的成纤维细胞。结论：组织块法培养的细胞符合牙龈成纤维细胞的形态学和免疫学特征,可作为体外细胞模型,为研究细胞因子对其功能的调控作用奠定基础。     

雷帕霉素对培养的人Tenon′s囊成纤维细胞的作用

目的:观察雷帕霉素(rapamycin)对培养的人Tenon′s囊成纤维细胞的增殖及细胞周期的作用。方法:将培养的人Tenon′s囊成纤维细胞用含不同雷帕霉素浓度的培养液培养24 h后,用MTT法测定细胞的增殖情况,用流式细胞仪测定细胞周期的变化情况。结果:用含10、20、40、80和160 ng/ml雷帕霉素的培养液培养细胞时,细胞增殖抑制率分别为9.32%,22.55%,41.42%,42.25%,43.57%。细胞周期分析显示,雷帕霉素(40 ng/ml)作用后,G0/G1期细胞较对照组增多(41.76%vs 44.19%,P<0.05),S期细胞较对照组减少(45.42%vs 40.18%,P<0.05)。结论:雷帕霉素具有抑制人Tenon′s囊成纤维细胞增殖的效果,且随浓度增加抑制作用增强,并将细胞抑制在G1期的限制点内。     

苯扎氯铵对人Tenon囊成纤维细胞增殖的影响

目的观察苯扎氯铵对体外培养的人Tenon囊成纤维细胞的增殖的影响。方法体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞。配制苯扎氯铵溶液,使其浓度依次为20、2～(2×10-7)μg/mL,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度的苯扎氯铵作用下细胞的增殖,并在光学显微镜下观察细胞的形态变化。结果较高浓度组(浓度≥0.2μg/mL)的苯扎氯铵对人Tenon囊成纤维细胞存在明显的杀伤作用,20μg/mL时细胞几乎全部死亡,A值与阴性对照相比明显减少(P<0.01),浓度为2和0.2μg/mL时细胞形态变化明显。较低浓度组(浓度<0.2μg/mL),A值和细胞形态较阴性对照均没有明显变化(P>0.05)。比较不同时间下的剂量效应曲线,4和24h没有显著差异(P>0.05)。结论苯扎氯铵0.2μg/mL及以上浓度对体外培养的成纤维细胞具有细胞毒性,低浓度时则对细胞增殖没有明显的影响。     

三种培养原代滑膜成纤维细胞方法的比较

［摘要］目的　比较3种体外分离培养原代类风湿关节炎滑膜成纤维样细胞（RASFs）的方法,寻求获得快速有效的培养途径．方法　将来自关节镜RA滑膜切除术的滑膜组织分别采用胶原酶消化法、改良组织块法、双酶消化法进行培养．采用倒置相差显微镜观察细胞形态及生长特性,以Vimentin组织化学法进行鉴定．台盼兰计数培养14d后所得活细胞数目．结果　3种原代分离培养方法均可成功培养出RASFs,符合RASFs的形态特征,Vimentin阳性细胞＞95%,其中:胶原酶消化培养法分离的RASFs16-20d细胞汇合度可达70%,约４周汇合度95%;改良组织块法分离的RASFs10～14 d细胞汇合度可达70%以上;双酶消化法分离的RASFs约４周细胞汇合度达85%．处理相同数量滑膜组织获得活细胞数目比较,改良组织块法组为（1.60±0.08）×106个,胶原酶消化法组（1.41±0.08）×106个,双酶消化法组（1.19±0.05）×106个,差异有统计学意义（P＜0.05）．培育原代RASFs细胞所需时间比较,胶原酶消化法需（267.50±16.58）min,双酶消化法需（183.75±11.08）min,改良组织块法需（149.10±13.71）min,差异有统计学意义（P＜0.05）．结论　改良组织块培养法能最大限度地利用滑膜组织,获得最多数量原代RASFs细胞,是建立体外RA细胞模型最高效、快捷的方法．     

白黎芦醇对人皮肤成纤维细胞及兔耳增生性瘢痕的影响

目的了解白黎芦醇对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖及兔耳增生性瘢痕的影响。方法用FCM法检测及建立兔耳增生性瘢痕动物模型，用不同浓度的白黎芦醇作用不同时间后，成纤维细胞的增殖指数及兔耳瘢痕增生指数进行了研究。结果①随着白黎芦醇浓度增大和作用时间延长而人皮肤瘢痕组织成纤维细胞增殖指数呈下降趋势。②白黎芦醇在150μmol/L、300μmol/L、400μmol/L时能明显降低瘢痕增生指数，分别为对照组的78．8％、61．2％、47．0％。结论①白黎芦醇降低成纤维细胞增殖指数是其抑制瘢痕增生的途径之一，且呈剂量时间依赖性。②随着白黎芦醇浓度增大，兔耳瘢痕增生指数下降，与瘢痕的体外实验相吻合。     

钙调蛋白拮抗剂W-7对人Tenon囊成纤维细胞的抑制实验

目的观察钙调蛋白拮抗剂W-7对培养的人Tenon囊成纤维细胞的抑制作用。方法1)人Tenon囊成纤维细胞离体培养及生长抑制实验:取对数生长期的Tenon囊成纤维细胞接种于96孔培养板中,分别加入不同浓度的W-7及丝裂霉素C(MMC),培养不同时间,用MTT法检测细胞增生抑制情况。2)药物对人Tenon囊成纤维细胞形态及线粒体代谢的影响:将人Tenon囊成纤维细胞接种在96孔培养板中,同时加入不同浓度的W-7及MMC,分别培养不同时间,观察细胞形态变化;同时加入MTT,观察细胞线粒体代谢变化。结果1)W-7依剂量及时间依赖方式明显抑制离体培养的人Tenon囊成纤维细胞增生。2)MTT显示W-7作用的细胞线粒体代谢存在,而MMC作用后细胞死亡,线粒体代谢消失。结论W-7可抑制人Tenon囊成纤维细胞增生。其对细胞线粒体代谢的影响较MMC小,不引起细胞膜完整性的破坏,可减轻炎症反应,是具有良好应用前景的抗斑痕药物。     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

目的探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础。方法用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养,用光镜及免疫组织化学检测进行鉴定。结果分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养5～7d左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈"铺路石样"排列,第Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学测定阳性。结论该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞。     

表皮生长因子对角膜成纤维细胞生长的影响

目的　研究表皮生长因子 (EpidermalGrowthFactor,EGF)对角膜成纤维细胞生长的影响。方法　通过含不同浓度EGF的培养基培养角膜成纤维细胞 ,分别于 2 4、48和 72h用 0 .5 %台盼蓝法对每组进行细胞活力的测定。结果　 0 .1、1.0mg/L的EGF在细胞培养 48、72h后对细胞生长有一定的促进作用 (P <0 .0 5 ) ,但在 2 4h时对细胞生长无明显影响 (P >0 .0 5 )。浓度为 0 .0 1mg/L的EGF对角膜成纤维细胞生长无明显影响 (P >0 .0 5 )。结论　一定浓度的EGF对角膜成纤维细胞的生长具有促进作用     

兔肾微血管内皮细胞的体外培养及鉴定方法

目的 探索肾微血管内皮细胞的体外培养方法，为骨组织工程再血管化提供理想的种子细胞；方法 采用三步梯度筛网法，先获得较高纯度的肾血管球，再应用肾血管球外植法体外培养肾微血管内皮细胞；并对肾微血管内皮细胞进行Ⅶ因子相关抗原免疫组化鉴定和透射电镜观察。结果 体外培养出纯度很高的血管内皮细胞并培养了10代；Ⅷ因子相关抗原免疫组化阳性，透射电镜检测出W-P小体。结论 该法可成功培养出肾微血管内皮细胞。     

人皮肤成纤维细胞原代培养及生物学特性

目的 探索和建立人皮肤成纤维细胞原代培养的方法,为皮肤成纤维细胞在临床医学中的应用提供可靠的科学依据.方法 胰蛋白酶消化法分离培养人皮肤成纤维细胞;细胞生长曲线及MTT法测定细胞增殖能力;流式细胞仪测定细胞生长周期及细胞增殖指数;倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状态;HE染色观察细胞爬片下的形态及着色;免疫组织化学染色观察成纤维细胞中间丝波形蛋白;电子显微镜下观察成纤维细胞超微结构,结果体外用胰蛋白酶消化法建立了人皮肤成纤维细胞;传5代内细胞及传5代内冻存复苏后人皮肤成纤维细胞增殖能力均很强;倒置镜下观察、HE染色、波形蛋白免疫组化染色及电镜下观察鉴定培养细胞的形态及生物学特性符合成纤维细胞.结论 本研究确立了体外人皮肤成纤维细胞原代培养.     

电穿孔介导外源基因转染兔成体成纤维细胞的初步研究

目的采用电穿孔方法,介导质粒载体pEGFP-cl转入兔成体成纤维细胞,探讨建立电穿孔介导外源基因转染兔成体成纤维细胞的基本条件。方法电穿孔介导质粒载体pEGFP—cl转入7．10代兔耳成体成纤维细胞系GG,研究不同电压、电容、DNA剂量,孵育温度的条件下,观察细胞存活数,流式细胞仪测试GFP的含量。结果以PBS作为电击基础液、细胞浓度2×10^6个／ml,电压250V、电容700μF,DNA用量30μg时,兔耳成纤维细胞的转染率和存活率最佳。且电击前冰浴10min,电转染后37℃孵育10min有利于提高细胞的转染率和存活率。结论在合适电压、电容、DNA剂量条件下,电转染提供了外源基因转染兔耳成体成纤维细胞适用性;电转染前的一定时间冰浴和电转染后一定温度孵育可使电转染效率得到改善。     

原代人牙周膜成纤维细胞的培养及培养方法的改进

目的：探讨如何提高人牙周膜成纤维细胞原代培养的成功率。方法：组织来源于11～15岁青少年因正畸而拔除的前磨牙，刮取牙根中1／3的牙周膜组织，组织贴壁培养法进行培养采用冠根分离控制取材中的污染，首次传代前进行细胞分散的方法来提高传代的成功率，并对培养细胞的形态及超微结构进行了观察。结果：经免疫组化染色证实所培养的细胞为牙周膜成纤维细胞，通过冠根分离法可有效的控制组织污染，首次传代前进行细胞分散可提高细胞传代成功率，从而使细胞培养成功率提高。结论：获得人牙周膜成纤维细胞，培养成功率在15％～20％。