大鼠PEDF基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建针对大鼠PEDF 基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定,探讨PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响.方法 构建PEDF基因过表达质粒,测序鉴定.针对PEDF基因不同干扰靶点构建4种RNAi 病毒载体质粒pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA,测序鉴定.过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western blot方法进行外源筛靶确定PEDF基因RNAi 有效靶序列.有效RNAi 病毒质粒和其他3种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后, 收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度.结果 过表达质粒及4种RNAi质粒构建成功.Western blot外源筛靶显示2个靶点能有效敲减目的基因的表达.PEDF shRNA慢病毒表达载体Serpinf1-RNAi-LV经293T细胞包装成功,收集293T细胞分泌的病毒上清测定浓缩病毒悬液的滴度为2×1012Tu/L.结论 成功构建了PEDF基因的RNAi慢病毒载体,为研究PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响打下基础.     

人支架蛋白IQGAP1-shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的 制备携带人支架蛋白IQGAP1基因小分子干扰RNA的重组慢病毒.方法 分别设计合成针对IQGAP1的4个shRNA慢病毒干扰载体;分别转染293T细胞,利用Western blot验证shRNA的沉默效果,选择其中一个沉默效果较好的shRNA慢病毒干扰载体同源重组产生Lentivirus- IQGAP1-shRNA并测定病毒滴度.结果 测序证实,构建携带IQGAP1-shRNA的慢病毒载体具有较好的沉默靶基因的效果,包装慢病毒,病毒滴度为2.0×l010TU/ml.结论 成功制备携带IQGAP1-shRNA的重组慢病毒载体并包装出具高效感染力的慢病毒颗粒.     

CD47-shRNA慢病毒载体构建及其介导Hep-2细胞CD47基因沉默效应鉴定

目的构建CD47靶向shRNA慢病毒干扰载体,并观察其对Hep-2细胞CD47基因的抑制效应。方法设计CD47靶点特异性的寡核苷酸序列,利用酶切反应合成含特异性系列线性化的pGCSIL-GFP载体,包装293T细胞产生慢病毒并行滴度测定,再转染人喉癌Hep-2细胞,通过实时荧光定量PCR及Western Blotting检测重组慢病毒对CD47靶基因在mRNA和蛋白水平上的沉默抑制情况。结果阳性克隆PCR及测序证实针对CD47基因shRNA慢病毒干扰载体构建成功,RT-PCR及Western Blotting检测载体在mRNA和蛋白水平上可抑制喉癌Hep-2细胞的CD47表达。结论成功构建针对CD47基因的慢病毒干扰载体,为进一步行喉癌CD47基因功能研究提供了较好的实验工具。     

人β-COP-shRNA慢病毒载体构建及干扰效应检测

目的采用常规转染试剂难以将人β-COP-shRNA转染至THP-1细胞。构建人β-COP特异性的shRNA慢病毒载体,并测定其对靶基因β-COP的抑制效应。方法设计合成针对人β-COP基因靶点特异的4对shRNA寡聚单链DNA,插入p GMLV-SC1载体中,构建慢病毒重组载体。将重组载体和包装质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒并测定滴度。用慢病毒感染THP-1细胞,定量PCR和Western blot检测干扰载体对β-COP基因的干扰效果。结果测序证实,β-COP基因的shRNA寡聚核苷酸序列已插入慢病毒载体,转染HEK 293T细胞,经包装得到4种慢病毒,病毒滴度为1×109TU/m L。定量PCR分析显示,4种β-COP-shRNA慢病毒感染的THP-1细胞中β-COP基因mRNA表达量分别为0.831±0.065、0.675±0.079、0.260±0.050、0.497±0.067,较对照(1.000±0.000)明显升高(P<0.01);其抑制率分别为16.9%、32.5%、74.0%和50.3%。Western blot结果表明,4种干扰载体均可抑制β-COP蛋白表达,其中β-COP-shRNA 3的沉默效率为76.4%。结论成功构建了人β-COP-shRNA干扰载体,证实了干扰载体对靶基因有较好的沉默效果。     

ABCE1特异性siRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定ABCE1基因短发夹状干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,以便进一步研究ABCE1的功能。方法针对已经筛选确定的ABCE1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/GFP载体连接、转化,产生pLV-sh-ABCE1慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pLV-sh-ABCE1、pHelper 1.0和pHelper 2.0 3种质粒共转染包装细胞人胚肾293T细胞,包装产生重组慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR和测序证实,成功构建ABCE1shRNA的慢病毒载体pLV-sh-ABCE1。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×108TU/ML。结论成功构建ABCE1基因shRNA慢病毒载体,为应用RNAi研究ABCE1功能奠定基础。     

人NOB1基因shRNA慢病毒载体构建与RNAi效率的鉴定

目的：构建人NOB1基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体并在卵巢癌SKOV3和HEY细胞上定其沉默效率。 方法：针对NOB1基因设计特异性siRNA靶点,构建于慢病毒pLVTHM载体,筛选获得的有效shRNA慢病毒载体在293T细胞包装成病毒颗粒,随后将其感染卵巢癌SKOV3和HEY细胞,采用Real-time PCR方法检测靶基因在mRNA水平的沉默效率。 结果：构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度达到8×10⁸ PU/L。shRNA慢病毒颗粒感染SKOV3和HEY细胞后NOB1基因的 mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组分别下降了73.5%和82.2%。 结论：成功构建NOB1基因的shRNA慢病毒表达载体,该慢病毒表达载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

靶向 RECQL4基因的 shRNA 慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：构建介导 RECQL4 RNA 干扰的 shRNA 慢病毒表达载体。方法将人工合成的 RECQL4 siR－NA 经 PCR 扩增后与线化的 pLKO．1慢病毒表达载体连接,经测序鉴定后,将 pLKO．1－RECQL4－shRNA 与慢病毒包装质粒共转染入 HEK －293T 细胞,产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度。体外感染人结肠癌细胞 RKO 后,实时定量 PCR 和 Western blot 检测 RECQL4 mRNA 和蛋白的沉默效果。设置未加入任何慢病毒表达载体的 RKO 细胞为未感染组,感染 pLKO．1－scramble －shRNA 慢病毒载体为阴性对照组。结果基因测序结果证实成功构建 pL－KO．1－RECQL4－shRNA 慢病毒表达载体。测定包装后的慢病毒颗粒滴度为6.70×107 IU／mL。感染 RKO 细胞后,RECQL4的 mRNA 和蛋白表达量均低于阴性组和未感染组。结论成功构建靶向 RECQL4基因的 shRNA 慢病毒表达载体,可有效抑制人结肠癌 RKO 细胞 RECQL4 mRNA 和蛋白的表达。     

小鼠P2X_7受体基因短发夹RNA慢病毒载体构建与鉴定

目的应用RNA干扰技术构建小鼠P2X_7受体(P2X_7R)基因重组慢病毒载体并鉴定。方法对小鼠P2X_7R mRNA分析,设计合成单链引物,经退火后形成双链寡核苷酸序列,放入经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切线性化的pLVX-shRNA-Puro慢病毒质粒载体中,连接构建慢病毒干扰载体pLVX-shRNA-P2X_7R。筛选出阳性克隆,进行基因测序鉴定。测序验证正确后,与慢病毒包装辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞,收集病毒上清。经浓缩后感染小鼠RAW264.7细胞,采用流式细胞术评价病毒滴度及感染效率;利用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法鉴定P2X_7R shRNA慢病毒的干扰效率。结果测序证实,成功地构建了重组质粒pLVX-shRNA-P2X_7R及小鼠P2X_7R基因shRNA慢病毒载体。重组慢病毒的滴度为2×1010TU·L~(-1),感染效率约为95%。干扰效率约为70%。结论应用RNA干扰技术可成功构建小鼠P2X_7R基因shRNA慢病毒载体。     

靶向TIPE2基因的shRNA慢病毒载体构建及病毒包装

目的包装表达TIPE2-shRNA的慢病毒颗粒。方法查询并合成7对针对TIPE2的shRNA序列,将其克隆入pLK0.1载体,经酶切及测序正确后,将构建好的7种pLKO.1-TIPE2-shRNA质粒分别与pCDNA3.1/3×FLAG-TIPE2共转染293T细胞,Western blot鉴定干扰效率并进行后续的病毒包装。结果 4号质粒沉默效果最好,将其与Non-target-shRNA质粒分别进行病毒包装,Western blot和免疫荧光证实病毒具有良好的感染效率和沉默效果。结论 TIPE2-shRNA的慢病毒载体构建及病毒包装成功。     

大鼠线粒体膜蛋白Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建线粒体膜蛋白Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体.方法 PCR扩增获得Nix基因序列,与经BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切的pHBLV-CMVIE-IRES-Puro载体连接获得Nix过表达重组慢病毒载体;以Nix为靶基因,合成寡核苷酸,退火形成双链DNA,与经BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切的pHBLV-U6-Scramble-Puro载体连接获得Nix shRNA重组慢病毒载体;将病毒包装辅助质粒与上述重组慢病毒载体共转染293T细胞,收集上清液并浓缩获得慢病毒浓缩液,3倍梯度稀释法测定病毒滴度;用病毒颗粒感染PC12细胞,经嘌呤酶素筛后得到稳定感染细胞株;荧光显微镜检测Nix荧光水平,Western blot检测Nix蛋白的表达.结果 成功构建Nix基因过表达和shRNA慢病毒载体,并在293T细胞中包装获得病毒.重组病毒感染PC12细胞后,荧光显微镜检测Nix基因过表达细胞荧光水平增加,shRNA感染细胞荧光水平降低;Western blot检测显示Nix基因过表达PC12细胞中Nix蛋白表达显著升高,shRNA慢病毒感染细胞中Nix蛋白表达明显降低,而Nix shRNA1干扰效果最好.结论 成功构建Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体,并获得Nix过表达与干扰细胞模型.     

CHADS_2/CHA_2 DS_2-VAS_C评分的应用

临床上CHADS2评分和CHA2DS2-VASC评分主要用来对非瓣膜性心房颤动(房颤)血栓栓塞的风险进行评估。由于CHA2DS2-VASC评分系统更为全面,并能筛选出不需要抗凝治疗的"真正的低危患者",因此现多应用此评分系统。然而,两种评分系统所包含的危险因素同样适用于其他心血管疾病,两者也可以被用来对房颤风险、左心房功能进行评估,同时也可对非房颤患者进行预后评估。     

过氧化氢对人肝癌细胞株HepG2增殖的促进作用

目的:探讨低剂量过氧化氢(H2O2)对人肝癌细胞株HepG2的促增殖作用及该作用与NF-κB和细胞周期的关系. 方法: 不同剂量H2O2直接作用于培养的HepG2细胞;20 μmol/L NF-κB抑制剂(PDTC)预处理细胞2 h, 50 μmol/L的H2O2作用HepG2细胞;50 μmol/L H2O2分别作用于G1, G2/M, S期细胞,MTT法测定细胞增殖活性. 结果: 50 μmol/L的H2O2具有明显的促进HepG2细胞生长的作用,此作用可以被PDTC抑制;50 μmol/L的H2O2可以明显的促进G1期HepG2细胞生长. 结论: 低剂量H2O2可诱导HepG2细胞增殖,该过程可能包含依赖NF-κB的信号途径的参与;H2O2诱导HepG2细胞增殖在细胞周期的不同时相效应敏感性不同,主要诱导G1期细胞增殖.     

评价房颤CHADS2评分及其衍生评分对冠心病及其严重程度的预测价值

目的：探讨房颤评分系统CHADS2(欧洲)评分及其衍生评分对冠心病及其严重程度的预测价值。方法纳入2013年1月1日-2013年12月1日就诊于本院心血管内科怀疑冠心病并行冠状动脉造影检查的连续病例429例,根据其造影结果分为对照组(n=51)及冠心病组(n=378)。根据患者的临床资料计算其CHADS2、CHA2DS2-VASc和CHA2DS2-VASc-HSF评分,根据其冠状动脉造影结果计算Gensini积分评价其病变严重程度,并对3种评分的冠心病预测能力进行评价。结果 CHADS2、CHA2DS2-VASc和CHA2DS2-VASc-HSF评分与病变支数(r=0.317,P＜0.01;r=0.332,P＜0.01;r=0.330,P＜0.01)及Gensini积分均有一定相关性(r=0.240,P＜0.01;r=0.274,P＜0.01;r=0.295,P＜0.01)。截断点分析显示, CHA2DS2-VASc-HSF评分≥3对冠心病的预测价值最高,其灵敏度、特异度、曲线下面积分别为0.860、0.804、0.832(95%CI：0.766~0.898)。结论 CHADS2及其衍生评分对冠心病有一定的预测价值,尤其是CHA2DS2-VASc-HSF评分≥3对冠心病有较高的预测价值。     

2－（2－甲氧基苯氧）乙胺的合成

２－（２－甲氧基苯氧）乙胺Ⅰ是合成某些抗高血压药物的重要中间体，本研究探索二种途径制备。一是以２－甲氧基苯酚为起始原料，经相应的苯氧乙酸、苯氧乙酰胺，再用ＺｎＣｌ２－ＫＢＨ４－ＴＨＦ－Ｃ６Ｈ５－ＣＨ３体系还原，得目的物，并将Ⅰ转变成盐酸盐Ⅱ。二是通过Ｇａｂｒｉｅｌ反应制备目的物。结果表明第一种途径总收率（５８．１％）高于其他路线，并有原料易得、操作简便的优点     

抗人胸腺细胞单克隆抗体2G_2B_2和2G_2C_2的制备及特性鉴定

用杂交瘤技术制备２株单克隆抗体（单抗）２Ｇ２Ｂ２、２Ｇ２Ｃ２。经研究发现,它们主要与胸腺细胞、脐血及ＰＨＡ激活的外周血单个核细胞等反应;免疫组化显示其主要作用于皮质胸腺细胞;与造血系统中分化早期的瘤细胞、骨髓瘤细胞等反应阳性率较高。生物学特性鉴定结果提示,单抗均属免疫球蛋白ＩｇＧ１亚类,腹水效价达１：１２８０００,所识别抗原分子量为４５／４６ＫＤａ,无抗原调变作用。故２Ｇ２Ｂ２、２Ｇ２Ｃ２是类似ＯＫＴ１０的抗ＣＤ３８单抗,但竞争抑制结果表明三者分别作用于不同的抗原决定簇,即２Ｇ２Ｂ２、２Ｇ２Ｃ２是两个抗ＣＤ３８新单抗。     

KIR2DS2基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建携带KIR2DS2基因短发夹状干扰RNA(short hairin RNA,shRNA)的RNAi慢病毒载体.方法针对已经筛选确定的KIR2DS2基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shKIR2DS2慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV-shKIR2DS2及Packaging system质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果PCR和测序证实,成功构建KIR2DS2shRNA的慢病毒载体LV-shKIR2DS2.293T细胞测定病毒滴度为6×108TU/ml.结论成功构建携带KIR2DS2基因短发夹状干扰RNA的RNAi慢病毒载体.     

pD_2和pA_2的测定

本文采用大鼠肛尾肌分别介绍测定苯肾上腺素ｐＤ＿２和其拮抗剂哌唑嗪ｐＡ＿２的方法。同时讨论了ｐＤ＿２和ｐＡ＿２的意义和推导过程。     

Dab2/DOC-2基因的研究进展

Dab2/DOC-2是具有信号转导功能的磷蛋白,在丝裂原信号转导途径中起作用,通过蛋白质的相互作用和蛋白磷酸化发挥作用,参与控制细胞生长的信号通路而发挥生长抑制效应,Dab2/DOC-2又作为胞质衔接蛋白,参与细胞内蛋白运输。在肿瘤中纯合子基因缺失时被激活,是抑癌基因的候选成员。其在多种肿瘤中低或失表达,如卵巢癌,乳腺癌,绒毛膜癌和前列腺癌等,重新表达能抑制肿瘤的生长。Dab2也在胚胎的发生过程中发挥重要的作用。     

MMP-2和TIMP-2在人脑星形细胞瘤中的表达

目的：研究基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)在人脑星形细胞瘤中的表达及其与病理分级的关系。方法：采用免疫组织化学方法检测47例星形细胞瘤组织中MMP-2和TIMP-2的表达情况。结果：MMP-2在高级别星形细胞瘤组(Ⅲ、Ⅳ级)和低级别星形细胞瘤组(Ⅰ、Ⅱ级)中的阳性率分别为76．0％和27．3％(P＜0.01)；TIMP-2为52．0％和50．0％(P＞0．05)。结论：MMP-2的过度表达及MMP-2／TIMP-2比例失衡可能是导致肿瘤侵袭的重要原因。MMP—2的表达与星形细胞瘤的病理分级密切相关，可作为星形细胞瘤分级与鉴别侵袭力大小的参考指标。     

2型糖尿病患者血浆TXA2和PGI2失衡及PLA2活性变化

目的：探讨2型糖尿病（DM）患者血栓素A2（TXA2）和前列环素（PGI2）失衡及PLA2活性变化。方法：以放免法测定血栓素B2和6－酮－前列腺素含量,以改良Zieve法测定血浆PLA2活性,同时观察空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）、甘油三酯（TG）等的变化。结果：①2型DM患者存在TXA2和PGI2合成异常,且Ⅱ组（有微血管病变组）较I组（无微血管病变组）更为严重;②2型DM患者组血浆PLA2显著低于正常对照组,但I组与Ⅱ组之间无显著差异;③2型DM患者组TXB2与FBG、TG显著正相关,6－K－PGF1a与FINS显著负相关,TXB2与6－K－PGF1a均与血浆PLA2无显著相关性。结论：①TXA2和PGI2失衡在2型糖尿病及微血管病变的发生发展中起重要作用;②血浆分泌型PLA2活性变化与2型糖尿病密切相关,但在糖尿病患者TXA2和PGI2失衡及微血管病变中可能不起直接作用;③糖脂代谢紊乱以及高胰岛素血症在TXA2和PGI2失衡及DM微血管病变中起重要作用。