大鼠IL-6基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其与C/EBP β结合位点的鉴定

目的:构建大鼠IL-6基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒并予鉴定,观察人胚肾细胞(HEK293)中过表达CCAAT/增强子结合蛋白 β(CCAAT/enhancer binding protein β,C/EBP β)对该质粒基因启动子活性的影响?同时,筛选C/EBP β与IL-6基因启动子区的结合位点?方法:采用PCR技术,扩增出大鼠IL-6基因启动子全长序列(-1 791~ +30 nt),将IL-6基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中?将IL-6基因启动子全长荧光素酶报告质粒(pGL3-IL-6-1)和大鼠野生型C/EBP β表达质粒(pIRES2-EGFP-C/EBP β)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定C/EBP β对IL-6基因的启动作用?另用生物信息学软件预测IL-6基因启动子上C/EBP β潜在的结合位点,并构建IL-6基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即pGL3-IL-6-2~5)?将上述IL-6基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和C/EBP β过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选出C/EBP β的结合位点?结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功?将pGL3-IL-6-1和pIRES2-EGFP-C/EBP β共转染HEK293细胞发现,IL-6基因启动子活性显著增加?另将pGL3-IL-6-1?pGL3-IL-6-2~5和pIRES2-EGFP-C/EBP β共转染HEK293细胞后发现,pGL3-IL-6-5的启动活性显著低于其他组?提示C/EBP β可能结合在IL-6基因启动子的-618 bp~ -126 bp区域?结论:成功构建了大鼠IL-6基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,并初步筛查出了C/EBP β在IL-6基因启动子上的结合部位?     

IDO启动序列GAS和ISRE荧光素酶报告基因载体构建及其活性检测

目的构建pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS两个荧光素酶报告基因载体,并对其进行生物活性鉴定。方法通过人工合成调控吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）表达的启动序列ISRE4（4个串联的ISRE序列）和GAS7（7个串联的GAS序列）,与pGL3-Enhancer连接成重组体pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7,通过转化扩增,筛选出阳性克隆,并通过酶切、测序及生物学活性检测鉴定构建好的荧光素酶报告基因载体。结果成功地构建了pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7两个荧光素酶报告基因载体,在IFN-γ的诱导下,能启动细胞内荧光素酶的表达。结论 pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7的荧光素酶报告基因载体的成功构建为研究IDO蛋白的表达调控机制和以IDO为靶标的抗肿瘤免疫耐受药物快速高通量的筛选提供了重要的研究工具。     

白细胞介素-23基因的克隆及真核双表达载体的构建

[目的]通过分别克隆白细胞介素-23（IL-23）基因的双亚基p19和p40,构建pcDNA3-IL-23真核双表达载体,为通过IL-23基因转染树突状细胞（dendritic cell,DC）增强其介导的免疫抗肿瘤作用提供基础。[方法]一步法从小鼠脾脏及胸腺中提取p19和p40总RNA,RT—PCR法扩增p19和p40的cDNA,扩增产物与pMD18-Tvector连接并热转化至大肠杆菌JM109,PCR法筛选阳性克隆,提取质粒并进行DNA的测序鉴定,将pMD18-p19和DMD18-p40分别限制性酶切,在对pcDNA3表达载体限制性酶切后将切胶回收的p19和p40片段分别克隆至pcDNA3．0表达载体,对阳性质粒进行XhoI/KpnI双酶切检测,琼脂糖凝胶电泳分析。[结果]脾脏及胸腺中提取p19和p40总RNA电泳鉴定是完整的,克隆的p19和p40 cDNA经测序鉴定与Genebank中序列完全一致。构建的pcDNA3．0-p19和pcDNA3．0-p40质粒分别限制性酶切后得到了593bp和1028bp的基因片段;构建的pcD．NA3．0-IL-23表达载体限制性酶切后得到了1．62kbD的p19＋p40片段。[结论]成功克隆了小鼠IL-23基因,并分别构建了pcDNA3-p19、pcDNA3-p40和pcDNA3-IL-23真核表达载体,为IL-23基因转染DC来增强其免疫活性创造了条件。     

骨桥蛋白启动子区报告基因的构建

目的 克隆和构建带人骨桥蛋白(OPN)启动子区基因的载体pGL3-OPN.方法 一步法提取人脐静脉内皮细胞(HUVEC)总DNA,PCR扩增 OPN全长基因,克隆入T载体,测序,双酶切连入真核表达载体pGL3-vector,酶切鉴定.将构建好的pGL3-OPN瞬时转染到人乳腺癌细胞MDA-MB-435中,利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行检测,通过计算两种质粒荧光素酶活性的比值来筛选药物.结果 扩增出人OPN基因全长,测序结果和GenBank记载一致,成功克隆入真核表达载体.p47可一定程度激活OPN启动子活性.结论 成功构建带有人OPN基因的真核表达载体pGL3-OPN.     

带新霉素抗性的萤光素酶报告载体的构建

目的:构建带新霉素抗性的萤光素酶报告载体.方法:设计扩增新霉素抗性基闪neo,克隆人萤光素酶报告载体pGL3,得到pGL3-neo.分别比较pGL3、pGL3-CMV promoter瞬时转染组和经G418筛选的pGL3-neo、pGL3-neo-CMV promoter稳定转染组细胞萤光素酶活性.结果:PCR扩增出neo表达单元;酶切和DNA测序分析鉴定得到带新霉素抗性的萤光索酶报告质粒pGL3-neo.G418筛选可获得稳定转染pGL3-neO)细胞株和稳定转染pGL3-neo-CMV promoter的细胞株.荧光检测显示:瞬时转染pGL3组、pGL3-CMV promoter组及稳定转染pGL3-neo组、pGL3-neo-CMV promoter组萤光素酶活性值分别为1 047±86、1 504±107和34 819±l 479、456 109 4±15 791,稳定转染组萤光素酶活性均高于瞬时转染组,P<0.05.结论:成功构建了带新霉素抗性的萤光素酶报告基因载体,使报告基因检测数据的敏感性和可靠性显著提高.     

p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的 构建人p53RFP基因启动子序列不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,研究启动子的转录活性.方法 PCR扩增人p53RFP基因启动子区域不同长度的目的片段,克隆到pGL3-Basic中,构建启动子区域3个不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双酶切和基因测序鉴定正确后,转染HEK293细胞,双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性.结果 成功构建了p53RFP启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双荧光素酶报告基因检测分析,3个启动子片段均具有转录活性.结论 成功构建了人p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体,为研究p53RFP基因的转录调控机制提供了实验基础.     

人细胞表面黏附分子P选择素启动子报告基因的构建及鉴定

目的构建人细胞表面黏附分子P选择素（p-selectin）基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,检测其 转录活性,并应用于筛选药物对其转录活性的影响。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的p-selectin启动子序列并设 计两端引物,扩增人基因组DNA中的p-selectin启动子。用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic和p-selectin启 动子后,将p-selectin基因启动子插入到pGL3-basic报告基因载体上。重组质粒命名为pGL3-pselectin-promoter。将其与内参 质粒pRL-SV40瞬时共转染293F细胞,检测双荧光素酶活性。对不同启动子片段长度的p选择素报告基因进行双荧光素酶的 检测。以炎症因子和药物分组刺激转染了报告基因质粒的293F细胞并检测双荧光素酶活性。结果成功构建p-selectin基因启 动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,质粒酶切及测序结果完全正确。瞬时共转染pGL3-pselectin-promoter/ pRL-SV40 组荧光素酶活性为0.8573±0.4703,高于转染pGL3-Basic/pRL-SV40 组的荧光素酶活性值0.03955±0.05894。 pGL3-1826 bp相比较于pGL3-1092 bp组和pGL3-3738 bp组具有最强的转录活性。炎症因子LPS和TNF-α和药物As2O3均具 有上调pGL3-pselectin-promoter转录活性的作用。结论pGL3-pselectin-promoter在293F细胞中能被转录激活,并验证了炎症 因子对其转录表达的作用,并为药物筛选与评价提供解决方案。     

phP53-luc质粒的构建及其用于检测化学物质遗传毒性的初步分析

目的:构建2个分别由p53基因启动子和核心启动子驱动的荧光素酶报告基因表达质粒,并探讨其用于检测遗传毒性化学物质的可行性.方法:通过PCR扩增人p53基因启动子片段,然后采用重组DNA技术克隆入pGL3-BASIC的荧光素酶报告基因的上游而获得phP53-luc表达质粒.用脂质体转染法将phP53-luc转染入NIH 3T3细胞并分别用5-氟尿嘧啶(5-FU)处理,最后裂解细胞用Dual-Luciferase Reporter Assay System检测荧光素酶报告基因表达.结果:构建了2个分别由p53基因启动子和核心启动子驱动的荧光素酶报告基因表达质粒,位于这2个质粒上的荧光素酶报告基因在NIH 3T3细胞内的表达显著地受遗传毒性化学物质的诱导,其表达比对照的pGL3-BASIC载体上的荧光素酶报告基因高近240倍.结论:基于人p53基因启动子的荧光素酶报告基因分析系统可以用于快速检测环境毒物的遗传毒性.     

人PSMA基因启动子表达载体pGL3-PSMP的构建

目的：构建含人前列腺特异性膜抗原（prostate specific membrane antigen,PSMA）基因启动子表达载体pGL3-PSMP。方法：PCR扩增人PSMA上游1175bp启动子序列,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic,构建前列腺特异性表达载体pGL3-PSMP,重组子经双酶切、测序鉴定。将构建载体用脂质体转染体外培养的前列腺癌细胞株PC-3M,应用双荧光素酶测定系统检测荧光素酶的表达活性。结果：序列测定表明,克隆获得的1175bp的DNA序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确。含人PSMA基因启动子的报告基因荧光素酶的表达活性显著提高,比pGL3-Basic高10倍多。结论：成功构建了含人PSMA基因启动子的荧光素酶表达载体。     

GPC3启动子报告基因载体构建与转录活性分析

目的 构建磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)启动子荧光素酶报告基因载体,并验证其转录活性.方法 以人类基因组DNA为模板,PCR扩增GPC3启动子基因片段,克隆到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体上,通过转染HepG2细胞检测荧光素酶活性来验证GPC3启动子的转录活性.结果 GPC3基本启动子和全长启动子分别成功构建到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体中,GPC3基本启动子具有很强的转录活性,而全长启动子的转录活性比基本启动子高4倍以上.结论 成功构建了GPC3启动子荧光素酶报告基因载体,为研究GPC3转录调控提供了重要手段.     

IL-10?IL-4及其受体启动子在人类单纯疱疹病毒1型激活卡波济肉瘤相关疱疹病毒复制过程中的启动活性分析

目的:分离和鉴定人类IL-10、IL-10受体(IL-10Rα)、IL-4及其受体IL-4Rα启动子序列,并分析IL-10、IL-4以及其受体的启动子在人类单纯疱疹病毒1型(HSV-1)激活卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)过程中的启动活性.方法:以人类基因组DNA为模板,PCR扩增IL-10、IL-10Rα、IL-4Rα启动子区序列,并分别克隆载入pGL-3基本载体中虫荧光素酶(Luciferase)报告基因的上游.进一步将上述构建的重组质粒与本室保存的含IL-4启动子重组质粒分别转染HSV-1感染的BCBL-1细胞,并作Luciferase活性检测.结果:分离了IL-10、IL-10Rα和IL-4Rα的启动子区域序列,并成功克隆了含启动子序列重组报告质粒;HSV-1感染的BCBL-1细胞在进一步转染了IL-10、IL-10Rα、IL-4和IL-4Rα启动子重组报告质粒后,其Luciferase值与相应的对照比较显著升高(P＜0.05).结论:在BCBL-1细胞中,HSV-1可通过直接激活IL-10、IL-4以及相应受体的启动子来上调它们的表达;在HSV-1感染的BCBL-1细胞中,IL-10和IL-4可能对KSHV的裂解复制起到促进作用.     

膀胱癌组织中白细胞介素-12B基因启动子区甲基化的变化及其意义

目的研究膀胱癌组织中白细胞介素-12B基因(IL-12B)启动子区甲基化的变化及其临床意义.方法应用甲基化特异性聚合酶链反应、Western-blot检测膀胱癌及癌旁组织78例,比较IL-12B基因启动子区甲基化及其蛋白质与膀胱癌发生发展的关系.结果 (1)膀胱癌组织IL-12B启动子区甲基化产物明显多于癌旁组织,差异有统计学意义(χ2=14.8,P=0.001);(2)膀胱癌组织和癌旁组织IL-12B启动子区甲基化产物的PMR水平差异有统计学意义(t=3.42,P=0.001);(3)膀胱癌组织IL-12B蛋白的表达水平显著低于癌旁组织(t=2.832,P=0.012).结论 IL-12B基因启动子区甲基化及其编码蛋白质的失活与膀胱癌的发生相关.     

人端粒酶逆转录酶启动子介导的E1A和IL-24表达及其对肝癌细胞生长的抑制作用

目的构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子介导的E1A和IL-24双基因靶向腺病毒载体,获得Ad-h-E1A-IL-24靶向重组病毒子,并探索其体外抑瘤作用。方法运用PCR扩增MCF-7乳腺癌细胞的DNA,XbaⅠ和HindⅢ酶切获得280 bp hTERT启动子,插入空载体构建成pTrack-hTERT;运用PCR及HindⅢ和XhoⅠ酶切获得E1A,与pTrack-hTERT构成pAdTrack-hTERT-E1A;运用PCR及NotⅠ和SalⅠ酶切获得IL-24,插入pTrack-PP-IRES;XbaⅠ和XhoⅠ酶切获得hTERT-E1A,与pTrack-PP-IL-24-IRES形成pTrack-hTERT-E1A-PP-IL-24-IRES,同源重组、包装和扩增获得Ad-h-E1A-IL-24重组靶向病毒子。用25 MOI重组靶向腺病毒感染SMMC-7721肝癌细胞,MTT法测定Ad-h-E1A-IL-24的细胞生长抑制作用。结果成功构建pTrack-hTERT-E1A-PP-IL-24-IRES,并获得Ad-h-E1A-IL-24重组病毒子。与非靶向双基因比较,Ad-h-E1A-IL-24组可明显抑制肿瘤细胞生长（P〈0.05或0.01）。结论Ad-h-E1A-IL-24靶向腺病毒载体的体外抑瘤作用优于非靶向双基因载体。     

贵阳地区250例哮喘患儿IL-4基因-590C/T的多态性与血浆IgE水平的相关性

目的:探讨白细胞介素-4(IL-4)基因启动子区-590C/T位点与贵阳地区儿童支气管哮喘的相关性及不同基因型对患儿血浆总Ig E(TIg E)水平的影响。方法:用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCRRFLP)方法,检测贵阳地区250例哮喘患儿(哮喘组)及200例健康对照儿童(对照组)IL-4基因-590C/T位点的多态性,分析IL-4基因-590C/T位点基因型频率分布,以及与哮喘危险性的关系;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测两组血浆TIg E水平,比较l L-4-590C/T位点不同基因型间血浆TIg E水平。结果:IL-4基因-590C/T位点在哮喘组和对照组中存在CC、CT、TT 3种基因型,且基因型频率在组间的分布差异有统计学意义(χ2=13.395,P<0.01);哮喘组和对照组IL-4基因-590C/T位点C等位基因频率与T等位基因频率的差异有统计学意义(χ2=16.384,P<0.01),此位点变异基因型TT携带者患病危险性均高于CC纯合子或CT杂合子基因型携带者(OR=1.78,95%CI=1.22~2.60),且T变异等位基因携带者患病危险均高于非携带者(χ2=9.851,P<0.01;OR=1.82,95%CI=1.36~2.44);相同基因型血浆TIg E水平哮喘组高于对照组(P<0.05),哮喘组变异基因T携带者TIg E水平明显高于非携带者(t=1.978,P<0.05),对照组变异基因T携带者与非携带者TIg E水平比较,差异无统计学意义(t=0.249,P>0.05)。结论:IL-4基因-590C/T位点T等位基因与哮喘发病相关,且变异基因T与血浆TIg E水平升高相关。     

等位特异PCR方法检测IL-6基因启动子区-634C/G多态性

目的：应用等位特异PCR法检测IL-6启动子区-634位C／G变异，以探讨ASPCR应用的可行性．方法：应用ASPCR法和PCR-RFLP法同时检测101例研究对象IL-6启动子区-634位C／G变异的多态性．并对二者的结果进行比较研究．结果：（1）除一个CC基因型结果不一致外，其余的CG、GG和CC基因型两种方法的结果都一样；（2）ASPCR在单点突变多态性的检测中，具有省时、快速和成本低等优点．结论：APCR方法检测基因的已知突变，具有快速、准确、省时、价格低等优点，在满足引物模板间碱基错配能阻止引物延伸的条件下，可优先选用此法．     

PCR-RLFP方法检测IL-6基因启动子区-634C/G多态性的实验条件研究

目的探讨PCR-RFLP技术判断IL-6基因启动子区-634C/G多态性的最适实验条件.方法对影响PCR的部分因素和影响RFLP方法的一些因素进行研究.结果PCR扩增IL-6基因启动子区的最适条件为:引物浓度为0.2μmol/L;Taq酶量为1.5 U;dNTP浓度为120μmol/L;Mg2 浓度为2.0 mmol/L.最经济有效的酶切体系为20μL体系中加4μL产物用2.5 U的酶消化9 h以上.结论最佳实验条件的探索是进行大批量实验研究的关键.     

白细胞介素-28和白细胞介素-29的研究进展

白细胞介素-28(IL-28A、IL-28B)和白细胞介素-29(IL-29)是一组由病毒或双链RNA诱导的多种细胞产生的新型白细胞介素，它们能结合一种由IL-10RB和IL-28Rα组成的异二聚体型Ⅱ类细胞因子受体，通过Jak-STAT信号通路而发挥其抗病毒或其他防御功能。作者就IL-28与IL-29的分子结构、编码蛋白、受体与生物学活性等作一综述。     

IL-2,IL-7,IL-15和IL-21在艾滋病免疫疗法中的应用前景

高效抗反转录病毒疗法可以有效地减少HIV的复制,但却不能完全恢复CD4+T细胞的数量.即使病毒血清学指标得到良好控制的病人,CD4+T细胞数也很难达到正常水平.目前研究表明:γ链细胞因子在始动、维持及调节免疫稳态和炎症反应中发挥重要作用.γ链细胞因子具有多重功能,如在健康及疾病中作为调节和效应分子发挥作用,因此,该家族...     

人iNOS基因启动子克隆鉴定及功能分析

目的 克隆鉴定人iNOS基因启动子序列,并进行功能分析.方法 利用生物信息学方法寻找iNOS潜在启动子区域,PCR克隆至报告载体pGL3-basic,双荧光素酶法检测启动子活性.结果 克隆得到人iNOS基因转录起始点上游1000bp区域,经检测具有启动子活性,可开启报告基因表达.结论克隆构建人iNOS基因启动子成功,可用于后继研究.     

IL-12和IL-4在鼻息肉表达的意义

目的探讨鼻息肉组织中T辅助细胞1（Th1）和Th2细胞及细胞因子IL-12和IL-4的含量及意义。方法标本取自30例鼻息肉患者的息肉组织和20例行鼻中隔手术患者的正常中鼻甲黏膜（对照组）。新鲜鼻息肉手术标本和正常中鼻甲黏膜制备单细胞悬液,流式细胞术测定Th1和Th2细胞的百分率。用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测IL-12和IL-4在冰冻鼻息肉标本和正常中鼻甲黏膜的含量。结果鼻息肉组织以Th1细胞亚群为主,且其中Th1和Th2细胞亚群显著高于对照组（P〈0.05）;鼻息肉组织IL-12、IL-4的水平高于对照组（P〈0.05）;Th1细胞百分率与IL-12的水平正相关（P〈0.05）,Th2细胞百分率与IL-4的水平正相关（P〈0.05）,IL-12的水平与IL-4负相关（P〈0.05）。结论鼻息肉中Th细胞在IL-12和IL-4作用下分化为Th1和Th2,二者共同参与鼻息肉的发生发展和免疫应答。