淫羊藿、女贞子含药血清联合糖皮质激素影响雷帕霉素诱导ASMCs自噬激活的机制研究

目的 研究淫羊藿女贞子含药血清合用地塞米松对自噬激活剂雷帕霉素（Rap）诱导的气道平滑肌细胞（ASMCs）自噬、凋亡及增殖活性的影响。方法 培养大鼠原代ASMCs,随机分为5组,即正常组（正常大鼠血清）、Rap组（正常大鼠血清+Rap）、激素组（正常大鼠血清+地塞米松+Rap）、中药组（Rap+淫羊藿、女贞子含药血清）、合用组（Rap+淫羊藿、女贞子含药血清+地塞米松）。根据分组分别加入正常大鼠血清或含药大鼠血清;除正常组外,其余各组同时加入Rap刺激ASMCs,48 h后进行检测。电镜观察细胞超微结构;MTT法检测细胞活力;免疫细胞化学法检测增殖蛋白Ki-67蛋白表达并评价细胞增殖活性;Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡活性;Western blotting检测LC3蛋白相对表达;细胞免疫荧光法检测Bax、Bcl-2、Beclin-1、P53、Caspase-3、mTOR、p-mTOR蛋白表达。结果 激素可协同Rap诱导ASMCs自噬活性增加,使LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值进一步增加,下调p-mTOR表达,但对Beclin-1及m TOR表达无影响,抑制ASMCs细胞活力及增殖...     

月华胶囊对耐多药结核分支杆菌感染自噬的影响

目的:以月华胶囊含药血清对耐多药结核分支杆菌感染小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)进行干预,探讨其对耐多药结核分支杆菌感染巨噬细胞自噬的作用及其机制。方法:低温冷冻干燥法制备月华胶囊,大鼠按3.02 g·kg^-1灌胃给药7 d,制备月华胶囊含药血清。体外培养RAW264.7,耐多药结核分子杆菌。以细胞增殖毒性检测试剂盒(CCK-8)检测含药血清对RAW264.7的增殖能力并选定其有效浓度。细胞分为模型组(10%胎牛血清);月华胶囊含药血清组(10%月华胶囊);自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)+月华胶囊含药血清组(5 mg·L^-1的3-MA+10%月华胶囊含药血清);雷帕霉素(Rap)组(200 mg·L^-1的Rap+10%胎牛血清);正常组(10%胎牛血清)。除正常组外,各组细胞培养24 h后,按细胞-细菌1∶10感染4 h。透射电镜观察细胞自噬体的出现和形成;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中I型微管相关蛋白轻链3(LC-3Ⅰ),Ⅱ型微管相关蛋白轻链3/I型微管相关蛋白1轻链3(LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ),Beclin-1蛋白的表达;间接免疫荧光染色法观察细胞中LC3B荧光颗粒、斑点及亮度;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测细胞中LC3,Beclin-1 mRNA的表达。结果:与正常组比较,模型组细胞未见自噬体,细胞中LC-3Ⅱ,LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ,Beclin-1蛋白及LC3,Beclin-1 mRNA的相对表达量均无显著变化,细胞无荧光颗粒、斑点,无荧光亮度。与模型组比较,月华胶囊含药血清组及Rap组细胞,均可观察到自噬体的形成,细胞LC-3Ⅱ,LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ,Beclin-1蛋白及LC3,Beclin-1 mRNA的相对表达量值均明显升高(P<0.05),月华胶囊含药血清组细胞荧光颗粒和荧光斑点明显增多,Rap组细胞荧光颗粒和荧光斑点增多非常明显,荧光闪亮,可判定细胞荧光呈现为阳性;自噬抑制剂3-MA+月华胶囊含药血清组细胞未见自噬体,细胞中LC-3Ⅱ,LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ,Beclin-1蛋白及LC3,Beclin-1 mRNA的相对表达量值均无明显升高。结论:月华胶囊含药血清能使耐多药结核分支杆菌感染细胞产生自噬而发挥抗结核的免疫效应,其机制是通过调控自噬相关蛋白LC3,Beclin-1蛋白及其mRNA的表达水平,促使LC3-I趋向LC3-Ⅱ的转化加快而实现的。     

龙蛭汤含药血清联合3-MA、白藜芦醇对氧化应激环境下血管内皮细胞自噬及管腔形成的影响

目的观察龙蛭汤含药血清联合3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine, 3-MA)、白藜芦醇(Resveratrol, Res)对过氧化氢(H_2O_2)诱导的氧化应激环境下血管内皮细胞(HUVECs)自噬及管腔形成的影响。方法 SPF级SD大鼠分别予生理盐水、龙蛭汤水煎液灌胃7 d,取腹主动脉血制备含药血清,分装备用。通过建立H_2O_2诱导的HUVECs氧化应激自噬模型,分别加入正常对照组(Control组)、生理盐水含药血清组(空白血清组)、3-MA(3-MA组)、3-MA+10%龙蛭汤含药血清(3-MA+LZD组)、Res(Res组)、Res+10%龙蛭汤含药血清(Res+LZD组);CCK8、划痕实验、基质胶管型形成实验分别检测HUVECs增殖、迁移及管型形成能力,细胞免疫荧光检测自噬表达强度,Western Blot比较各组细胞Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、VEGF的蛋白表达水平。结果与空白血清组相比,Res组与Res+LZD组的细胞增殖数、迁移距离及管型形成数均明显增多,LC3荧光表达增强,Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、VEGF蛋白水平升高,3-MA组的自噬、VEGF蛋白水平均降低;与3-MA组、Res组相比,加入龙蛭汤含药血清后的细胞增殖、迁移、管型形成数增多,3-MA+LZD组自噬荧光表达增强,Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、VEGF蛋白水平升高;Res+LZD组下调Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平,与自噬荧光表达趋势一致,同时VEGF蛋白表达水平上调。结论龙蛭汤含药血清通过调节Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ自噬蛋白水平调控自噬通路,提高血管内皮细胞活力,促进内皮细胞迁移及管型形成,可能是血管内皮细胞氧化应激损伤后的血管新生的重要作用机制。     

淫羊藿女贞子影响激素干预哮喘大鼠淋巴细胞凋亡的作用

目的:研究大鼠哮喘模型激素局部及全身给药治疗的同时合用淫羊藿女贞子对淋巴细胞凋亡的影响。方法:建立大鼠哮喘模型,分别以布地奈德雾化4周(局部给药)及地塞米松腹腔注射治疗2周(全身给药)治疗,同时配合灌胃淫羊藿女贞子煎液,流式细胞术检测支气管肺泡灌洗液(BALF)与血淋巴细胞凋亡的表达。结果:与正常组相比,哮喘大鼠BALF中淋巴细胞凋亡显著降低(P0.05);激素局部干预及合用中药淫羊藿女贞子均可上调BALF中淋巴细胞凋亡水平(P0.01),且合用组上调作用较单用组显著升高(P0.01);而激素全身干预大鼠血及BALF中淋巴细胞凋亡表达均显著上调(P0.05),但合用淫羊藿女贞子后则下调血淋巴细胞凋亡水平接近于正常(P0.05)。结论:激素局部给药的同时合用平补阴阳药对淫羊藿女贞子,产生协同上调血及BALF淋巴细胞凋亡的作用;而激素全身给药的同时合用平补阴阳药对淫羊藿女贞子,则抑制激素全身应用后过度促进血淋巴细胞凋亡的影响。     

淫羊藿对良性前列腺增生模型大鼠的治疗作用及对自噬蛋白Beclin-1、LC3表达的影响

目的研究淫羊藿对良性前列腺增生模型大鼠的治疗作用及对自噬蛋白Beclin-1、LC3表达的影响。方法通过颈背部皮下注射丙酸睾丸酮注射液复制大鼠良性前列腺增生模型,确定造模成功后,空白组不变,其余大鼠随机分为模型对照组、非那雄胺组、淫羊藿低、中、高剂量组。完成给药后摘取前列腺组织分别比较前列腺湿重、体积变化,计算前列腺指数(PI)并观察前列腺组织变化,比较各组Beclin-1、LC3蛋白及mRNA的表达。结果与空白组相比,模型对照组前列腺体积、湿重和前列腺指数均显著增高(P0.01),自噬蛋白Beclin-1、LC-3表达上调,自噬活性增强。与模型对照组比较,淫羊藿高、中、低剂量对增生前列腺组织均有明显治疗作用(P0.01),下调Beclin-1、LC3蛋白及mRNA表达(P0.01或P0.05),尤以淫羊藿低剂量治疗效果更显著(P0.01)。结论淫羊藿对增生前列腺组织有明显治疗作用,且这种治疗作用可能与下调前列腺增生组织中相关蛋白(如LC-3和Beclin-1)、抑制过度自噬有关。     

淫羊藿苷通过自噬与凋亡途径保护去卵巢大鼠骨质疏松的机制探究

目的 探讨淫羊藿苷是否通过自噬与凋亡途径保护去卵巢大鼠骨质疏松及其机制。方法 将48只雌性SD大鼠随机分为假手术组、去卵巢组、阳性对照组(尼尔雌醇1 mg·kg^-1)和淫羊藿苷低、中、高剂量组(40、80、120 mg·kg^-1),每组各8只。除假手术组外,各组均进行去卵巢手术。术后灌胃给药12周后,采用双能X线吸收法检测骨密度,采用三点弯曲力学试验测量生物力学指标,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测血清骨代谢指标,采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测自噬相关蛋白P62、自噬效应蛋白(Beclin-1)、LC3-Ⅱ以及凋亡相关蛋白胱天蛋白酶3(Caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)和B淋巴细胞瘤基因-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)表达。结果 淫羊藿苷低、中、高剂量组大鼠骨密度、最大载荷、最大应力以及刚度均高于去卵巢组(P<0.05);淫羊藿苷低、中、高剂量组大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、Ⅰ型胶原交联氨基端肽(NTX-Ⅰ...     

月华丸(胶囊)对耐多药结核菌感染自噬相关蛋白LC3的影响

目的:观察月华丸(胶囊)对结核分枝杆菌感染巨噬细胞自噬的影响,探寻其抗结核分枝杆菌的药效药理作用及其机制。方法:以月华丸(胶囊)含药血清干预感染结核分枝杆菌小鼠的单核巨噬细胞(RAW264. 7),实验共分为5组:阴性对照组、10%月华丸(胶囊)含药血清组、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)+月华丸(胶囊)含药血清组、自噬诱导剂雷帕霉素(Rep)组,另设未被感染的细胞为正常组。采用免疫荧光染色法检测LC3。结果:阴性对照组细胞胞浆中未见LC3蛋白颗粒。与阴性对照组比较,3-MA+月华丸(胶囊)含药血清组细胞胞浆中可见少量LC3蛋白颗粒,10%月华丸(胶囊)含药血清组及Rep组细胞胞浆LC3蛋白颗粒均明显增多,3-MA+月华丸(胶囊)含药血清组多于10%月华丸(胶囊)含药血清组。结论:月华丸(胶囊)含药血清能诱导被耐多药结核菌感染巨噬细胞自噬。     

淫羊藿、女贞子对激素干预哮喘大鼠骨代谢的影响

目的:比较研究哮喘大鼠模型在地塞米松干预撤停不同阶段(撤停前、撤停中、撤停后)合用淫羊藿、女贞子对骨代谢的影响作用.方法:卵清白蛋白致敏、激发建立大鼠哮喘模型,腹腔注射地塞米松模拟激素干预过程,分别在激素干预不同阶段合用中药淫羊藿、女贞子,观察比较中药对激素干预各阶段哮喘模型血清Ca、碱性磷酸酶(AKP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)活性、骨钙素(BGP)含量.结果:激素干预组血BGP含量显著降低,AKP、StrACP活性显著增高;而淫羊藿、女贞子合激素干预组显著上调血清BGP含量,降低血清AKP、StrACP活性,从而保护骨代谢.结论:淫羊藿、女贞子合用糖皮质激素地塞米松可对骨代谢异常起到保护作用.     

栝楼薤白半夏汤对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌自噬及凋亡的影响

目的:观察栝楼薤白半夏汤对心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)大鼠心肌自噬及凋亡的影响。方法:将40只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、3-MA干预组及栝楼薤白半夏汤组,采用可逆性冠脉左前降支结扎缺血30 min、再灌注2 h复制MI/RI模型。利用全自动生化仪检测血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)含量,采用Western blot法测定心肌自噬基因Beclin-1、LC3II及促凋亡蛋白Bax表达水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠血清CK、LDH含量与心肌Beclin-1、LC3 II、Bax蛋白表达及LC3 II/LC3I水平均显著升高,与模型组比较,栝楼薤白半夏汤组及3-MA干预组能降低血清CK、LDH含量,下调心肌Beclin-1、LC3 II、Bax蛋白表达及LC3 II/LC3I水平,且栝楼薤白半夏汤抑制Beclin-1表达作用优于3-MA干预组。结论:心肌缺血再灌注可引起自噬反应增强,促进凋亡损伤,栝楼薤白半夏汤通过抑制自噬、改善心肌细胞凋亡而起到心肌保护作用。     

淫羊藿女贞子影响激素干预哮喘大鼠与炎性因子相关的pJAKs/pSTATs的研究

目的研究淫羊藿女贞子合地塞米松对哮喘大鼠肺组织中与炎性因子相关的JAKs及STATs蛋白磷酸化表达的影响。方法 SD雄性大鼠,随机分为7组,分别是正常对照组(正常组)、哮喘模型组(模型组)、地塞米松组(激素组)、淫羊藿女贞子煎剂组(煎剂组)、地塞米松合煎剂组(激素合煎剂组)、淫羊藿女贞子提取物组(提取物组)、地塞米松合提取物组(激素合提取物组)。卵蛋白(OVA)致敏,建立大鼠哮喘模型,腹腔注射地塞米松和/或灌胃淫羊藿女贞子煎剂或提取物,免疫荧光法检测肺组织JAKs(JAK3、TYK2)及STATs(STAT3、STAT5、STAT6)蛋白的磷酸化表达。结果与正常组相比,模型组大鼠肺组织p JAK3、p TYK2、p STAT3、p STAT5、p STAT6的蛋白表达均显著升高(均P0.01);与模型组比较,各给药组p JAK3、p TYK2、p STAT3、p STAT5、p STAT6的蛋白表达均显著降低(均P0.01);与单用激素比较,激素合煎剂或提取物组均能进一步显著降低p JAK3、p TYK2、p STAT3、p STAT6的蛋白表达。结论调节哮喘大鼠肺组织中与炎性因子相关的JAKs/STATs可能是淫羊藿女贞子煎剂及提取物协同激素治疗哮喘的作用机制之一。     

淫羊藿女贞子合用地塞米松抗哮喘大鼠的研究

目的:研究地塞米松合用淫羊藿女贞子治疗哮喘的协同抗炎作用及对激素不良反应的改善作用。方法:给予哮喘大鼠模型腹腔注射地塞米松2周,同时配合灌胃淫羊藿女贞子,观察支气管肺泡灌洗液(BALF)IL-4,INF-γ,IL-5含量;血清COR,血浆ACTH,下丘脑CRH含量;BALF中GCR蛋白表达。结果:淫羊藿女贞子合用地塞米松能显著下调哮喘模型大鼠BALF中IL-5,IL-4含量,上调IFN-γ表达,调节Th1/Th2失衡;降低血浆ACTH,CRH含量;上调BALF中GCR的蛋白含量及结合力。结论:淫羊藿合用地塞米松可以增强激素的抗炎作用,并对内源性糖皮质激素作用途径起到保护作用。     

基于病理学评价淫羊藿女贞子对激素干预哮喘大鼠的影响

目的基于病理学评价研究药对淫羊藿女贞子对激素干预哮喘大鼠的影响。方法卵蛋白致大鼠慢性哮喘模型后,腹腔注射地塞米松模拟激素干预过程,在激素应用同时及撤停时合用中药淫羊藿女贞子,观察对肺组织病理、血及肺泡灌洗液(BALF)涂片嗜酸性粒细胞(EOS)数量的影响。结果激素干预组、淫羊藿女贞子合激素Ⅰ、Ⅱ组显著改善肺组织支气管黏膜上皮脱落、管腔阻塞程度(分别为0.391±0.200,0.429±0.200,0.429±0.200,P均0.05),降低BALF中EOS数量(分别为8.30±2.06,9.70±2.45,10.60±2.32,P0.05或0.01)及肺组织总管壁厚度(分别为106.26±14.00,95.73±14.78,87.47±14.44,P均0.01);激素干预组、淫羊藿女贞子合激素干预Ⅰ组显著抑制血EOS数量(分别为5.30±2.31,5.50±1.51,P均0.01),改善肺组织EOS浸润(分别为0.420±0.200,0.348±0.200,P均0.05);淫羊藿女贞子合激素Ⅰ组可显著降低肺组织平滑肌厚度(16.46±4.17,P0.05)。结论激素应用同时配伍淫羊藿女贞子可增强协同抗炎作用及抑制哮喘气道重塑的作用。     

淫羊藿、女贞子配伍激素对哮喘大鼠ET/NO平衡的影响作用

目的研究淫羊藿、女贞子配伍糖皮质激素对哮喘大鼠ET/NO平衡的影响作用。方法在建立普通大鼠哮喘模型的基础上,给予腹腔注射地塞米松2周治疗,同时配合灌胃淫羊藿女贞子煎液,检测肺组织匀浆中ET-1、NO、NOS(分型)含量,并计算ET-1/NO、ET-1/NOS比值。结果哮喘模型组较正常对照组肺组织ET-1、NO、tNOS、iNOS含量均显著上升,但cNOS含量显著降低,ET/NO无显著改变,ET/cNOS显著升高。与哮喘模型组比较,激素干预组,淫羊藿女贞子组,淫羊藿女贞子合激素组ET-1、iNOS含量、ET/cNOS均显著降低;淫羊藿女贞子合激素组NO含量显著降低;淫羊藿女贞子合激素组、淫羊藿女贞子组的cNOS含量显著上升。结论淫羊藿女贞子配伍激素防治哮喘的作用与调节ET/NO(NOS)平衡作用有关。     

淫羊藿及女贞子协同布地奈德对哮喘大鼠糖皮质激素受体及抗炎作用的影响

目的研究淫羊藿、女贞子协同布地奈德对哮喘大鼠糖皮质激素受体(GR)及抗炎作用的影响。方法 SPF级健康雄性SD大鼠,随机分为正常对照组、哮喘模型组、布地奈德组(0.01%布地奈德雾化20 min)、煎剂组(淫羊藿、女贞子煎剂3.5 g/kg灌胃)、布地奈德合煎剂组(0.01%布地奈德雾化20 min+淫羊藿、女贞子煎剂3.5 g/kg灌胃)。采用酶免法检测血清皮质酮(CORT)、白介素-4(IL-4)、免疫球蛋白E(Ig E)含量,流式细胞术检测肺泡灌洗液(BALF)中GR蛋白表达及结合力。结果布地奈德组及布地奈德合煎剂组可显著降低血清IL-4、Ig E含量(P0.05,P0.01);煎剂组能显著降低血清Ig E含量(P0.05)、升高血清CORT、BALF GR蛋白含量(P0.05);布地奈德合煎剂组能显著升高血清CORT含量、BALF GR蛋白含量及蛋白结合力(P0.01,P0.05)。结论保护糖皮质激素(GC)发挥作用的环节及局部抗炎作用的敏感性可能是淫羊藿、女贞子协同布地奈德治疗哮喘的作用机制之一。     

五味温通除痹胶囊对佐剂性关节炎大鼠自噬蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ表达的影响

目的明确五味温通除痹胶囊(桂枝、茯苓、淫羊藿,等)对佐剂性关节炎大鼠自噬蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ表达的影响,探讨其防治类风湿关节炎的可能机制。方法雄性SD大鼠,随机分为正常组、模型组、五味温通除痹胶囊(0.80、1.60、3.20 g/kg)组、阳性药雷公藤多苷片(40 mg/kg)组,每组10只。除正常组外,采用弗氏完全佐剂诱导佐剂性关节炎大鼠模型。致炎后第12天灌胃给药,连续12 d。实验结束后,取非致炎侧踝关节,HE染色观察病理学改变,实时定量荧光PCR测定滑膜组织中Beclin-1、LC3-ⅡmRNA的表达,免疫荧光组织化学染色和Western blot法检测滑膜组织中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的表达。结果与模型组相比,五味温通除痹胶囊(1.60、3.20 g/kg)不仅可减轻佐剂性关节炎大鼠关节病理损伤程度,还可显著升高Beclin-1、LC3-ⅡmRNA和蛋白的表达水平。结论五味温通除痹胶囊对佐剂性关节炎大鼠具有一定的治疗作用,其机制可能与促进细胞自噬,减少滑膜细胞的过度增殖,从而减轻关节软骨损伤有关。     

活血消瘿方含药血清调控AMPK/mTOR通路对脂多糖诱导的甲状腺滤泡上皮细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨活血消瘿方含药血清对脂多糖(LPS)诱导的甲状腺滤泡上皮细胞(TFECs)自噬和凋亡的影响以及作用机制。方法 光学显微镜观察分离培养的SD大鼠TFECs细胞的形态;免疫荧光染色鉴定TFECs中特异抗原甲状腺球蛋白(Tg)。取对数生长期的TFECs,分为对照组、LPS组、含药血清组、含药血清+compound C(AMPK抑制剂)组、含药血清+MHY1485(mTOR激活剂)组,MTT法检测各组细胞活力;绿色荧光蛋白(GFP)标记质粒转染检测各组细胞自噬小体变化;流式细胞术检测各组细胞凋亡;western blot检测各组细胞中微管相关蛋白1轻链3(LC3)I、LC3II、Beclin1、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)及AMP活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白表达。结果 光学显微镜观察显示,TFECs形态为梭形、形态均一,且可成簇生长。免疫荧光结果显示,TFECs细胞质中可见较强的Tg荧光染色。与对照组比较,LPS组TFECs细胞活力、自噬小体数量、LC3II/LC3I、Beclin1、Bcl-2、p-AMPK/AMPK蛋白相对表达量显著降低,炎性因子IL-6 、TNF-α水平、细胞凋亡率、Bax、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量显著升高(P< 0.05);与LPS组比较,含药血清组TFECs细胞活力、自噬小体数量、LC3II/LC3I、Beclin1、Bcl-2、p-AMPK/AMPK蛋白相对表达量显著升高,炎性因子IL-6 、 TNF-α水平、细胞凋亡率、Bax、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量显著降低(P< 0.05);与含药血清组比较,含药血清+compound C组、含药血清+MHY1485组TFECs中相应指标与上述趋势相反。结论 活血消瘿方含药血清对LPS诱导的TFECs自噬的促进作用及细胞凋亡的抑制作用可能与激活AMPK/mTOR通路有关。     

左归降糖解郁方对自噬介导的糖尿病并发抑郁症大鼠海马神经血管单元中神经元损伤的保护作用及其机制

目的探讨左归降糖解郁方(ZGF)对自噬介导的糖尿病并发抑郁症(diabetes mellitus with depression,DD)大鼠海马神经血管单元(neurovascularunit,NVU)中神经元的保护作用及其机制。方法原代分离、纯化和培养SD大鼠海马神经元、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞,构建海马NVU体外共培养体系,并进行免疫细胞化学染色鉴定。采用高糖(150mmol/L)联合皮质酮(200μmol/L)干预制备海马NVU细胞模型,实验设对照组、模型组、空白血清对照组和ZGF含药血清组。采用Furo-3/AM染色法检测海马NVU神经元细胞内钙水平,高内涵细胞成像分析技术(high content analysis,HCA)检测海马NVU神经元细胞内自噬标志物自噬相关蛋白1(Beclin-1)、人微管相关蛋白轻链3II(LC3-II)及谷氨酸受体2(Glu R2)/Ca2+/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路关键蛋白的表达,TUNEL染色法观察各组海马神经元细胞凋亡。结果与对照组比较,模型组及空白血清对照组海马NVU神经元细胞内钙水平显著升高,自噬标志物Beclin-1、LC3-II蛋白表达水平显著升高,Glu R2、m TOR蛋白表达水平显著降低,AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)蛋白表达水平显著升高,且细胞凋亡明显增多;与模型组比较,ZGF含药血清组海马NVU神经元细胞内钙水平明显降低,自噬标志物Beclin-1、LC3-II蛋白表达水平降低,GluR2/Ca2+/mTOR信号通路中Glu R2、m TOR蛋白表达水平升高,AMPK蛋白表达水平降低,同时细胞凋亡显著减少。结论 ZGF对自噬介导的DD大鼠海马NVU神经元细胞损伤具有明显的保护作用,其作用机制与调控GluR2/Ca2+/mTOR信号通路及细胞凋亡有关。     

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路的三七总皂苷调控自噬抗H9c2细胞缺氧/复氧损伤机制研究

目的探讨三七总皂苷(PNS)能否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控自噬从而减轻H9c2细胞缺氧/复氧损伤机制。方法将H9c2细胞分为正常组、缺氧/复氧(A/R)组、A/R+PNS组、A/R+PNS+雷帕霉素(Rapa)组、A/R+Rapa组、A/R+羟氯喹(HCQ)组、A/R+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组。通过缺氧6 h、复氧2 h建立H9c2细胞A/R模型。CCK-8法检测细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测细胞损伤,Western blot检测自噬相关蛋白Atg5、p62、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、Akt、m TOR的表达,荧光法观察细胞自噬流。结果与正常组比较,A/R组H9c2细胞存活率明显下降,细胞损伤率明显升高(P0.05),自噬相关蛋白Atg5、Beclin-1表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高(P0.05),自噬体和自噬溶酶体数量显著增加,自噬流显著增强(P0.05);与A/R组比较,用PNS预处理后,H9c2细胞存活率明显上升,细胞损伤率明显降低(P0.05),自噬相关蛋白Atg5、Beclin-1表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显降低(P0.05),p62蛋白表达明显升高,与自噬抑制剂HCQ、3-MA作用相似,荧光结果显示,PNS对自噬流有明显抑制作用(P0.05);PNS预处理后p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达明显升高(P0.05)。结论 PNS能有效减轻H9c2细胞A/R损伤,其机制与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路从而抑制自噬流相关。     

从AMPK介导的自噬研究淫羊藿总黄酮对自然衰老大鼠小肠屏障功能的调节作用

目的:从AMPK介导的自噬探讨淫羊藿总黄酮对自然衰老大鼠小肠屏障功能的调节作用。方法:SD大鼠按其不同发育阶段分为6月龄成年对照组,24月龄衰老组及淫羊藿总黄酮低、中、高剂量(10、20、60 mg/kg)组。用D-乳酸试剂盒检测各组血清D-乳酸含量;采用免疫组化检测各组小肠Claudin-1、Occludin、p-AMPK表达情况;Western blot检测小肠自噬相关蛋白Lc3Ⅱ、Beclin1表达情况。结果:与成年组比较,衰老组血清D-乳酸含量显著升高,小肠Claudin-1、Occludin、p-AMPK、Lc3Ⅱ、Beclin1表达显著降低(P0.01);与衰老组比较,淫羊藿总黄酮中、高剂量组血清D-乳酸水平显著降低,小肠紧密连接蛋白与自噬相关蛋白的表达显著升高(P0.01)。结论:淫羊藿总黄酮可能通过上调AMPK介导的自噬,增加肠上皮细胞间紧密连接蛋白的表达,从而改善衰老大鼠肠道黏膜屏障功能障碍。     

针刺激活Ⅲ型PI3K/Beclin-1通路调控脑缺血再灌注损伤大鼠缺血侧海马区细胞自噬

目的:观察针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠缺血侧海马组织Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)及Beclin-1等自噬相关指标的影响，探讨针刺调控Ⅲ型PI3K/Beclin-1通路适度激活脑缺血再灌注损伤大鼠缺血侧海马神经细胞自噬的作用机制。方法:SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组、针刺组、模型+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、针刺+3-MA组，每组11只。使用改良线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型。模型+3-MA组、针刺+3-MA组于再灌注前30 min予侧脑室注射3-MA 5䥺SymbolmApL(400 nmol/5䥺SymbolmApL)。针刺组、针刺+3-MA组针刺“大椎”“水沟”“百会”,每15 min捻转1次，留针30 min,每12 h治疗1次，共7次。于再灌注后2 h、干预后进行Garcia神经功能评分，干预后通过TTC染色法观察大鼠脑组织缺血面积百分比，Western blot法检测缺血侧海马组织Ⅲ型PI3K、Beclin-1、自噬标志物微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、溶酶体相关膜蛋白2(Lamp2)、P62的蛋白表达水平，透射电镜法观察缺血侧海马组织神经...