人脊索瘤细胞系CM-319的建立及其生物学特性的观察

目的建立人脊索瘤细胞系,为脊索瘤研究提供实验模型。方法取经病理证实的新鲜脊索瘤手术标本(取自于1例42岁男患者行手术切除后的肿瘤),进行体外原代组织块培养。对存活细胞进行形态学观察、组织化学染色、细胞周期检查、染色体分析、电镜观察、异种移植和体外侵袭实验等。结果建成细胞系CM-319,经近两年的体外培养,已连续传代百余次。其形态学表现、组织化学染色、电镜观察和异种移植等均符合脊索瘤细胞特征。细胞倍增时间为33h,细胞周期测定显示:G1期为55.6%,G2期为21.9%,S期为22.5%,G2/G1为1.90。染色体具有亚三倍体核型。异种移植成瘤率100%,具有侵袭性。结论CM-319是一株人脊索瘤细胞系,可用于对脊索瘤的研究。     

脊索瘤17例临床病理分析

目的 :探讨不同组织学分型的脊索瘤的临床病理特征。方法 :分析临床资料 ,运用HE ,糖原染色(PAS) ,alcianblue染色 ,免疫组织化学染色和电镜技术观察 17例脊索瘤的病理切片。其中经典型脊索瘤 11例 ,软骨样脊索瘤 6例。结果 :所有脊索瘤都发生在中轴骨骼 ,均含有空泡细胞。瘤细胞胞浆和细胞外基质PAS ,alcianblue着色。免疫组织化学染色 ,肿瘤联合表达上皮性标记和S 10 0蛋白。超微结构见瘤细胞胞浆空泡、线粒体—粗面内质网复合体和细胞间桥粒样连接。结论 :根据组织学、免疫组织化学染色和超微结构特征 ,结合临床和放射影像学资料 ,可以确诊脊索瘤。     

人恶性胰岛细胞瘤SCID鼠原位移植瘤免疫组织化学和超微结构的研究

目的　为探讨人恶性胰岛细胞瘤转移机制和抗转移治疗提供实验工具。方法　将人恶性胰岛细胞瘤组织植入SCID胰腺被膜下 ,观察移植瘤的侵袭转移及形态学特征 (光镜、免疫组织化学、电镜 )。结果　在SCID鼠体内成功地建立了一株人恶性胰岛素瘤原位移植模型HMI HMN 1,已传 2 1代 ,和一株人恶性胰多肽瘤原位移植模型HPPT HMN 2 ,已传2 5代 ,共移植SCID鼠共 14 7只 ,其移植生长率和自发转移率达 10 0 %。表现为肿瘤广泛侵袭胃十二指肠并有淋巴结和肝转移。病理组织学、免疫组织化学和电镜观察结果证明移植瘤细胞与瘤源人胰岛细胞瘤细胞完全一致。结论　人恶性胰岛细胞瘤SCID鼠原位移植模型的建立为研究人恶性胰岛细胞瘤转移机制和抗转移治疗提供了理想的动物模型。     

异甘草素对结直肠癌细胞的体内外抑制作用研究

目的探讨异甘草素(ISL)对结直肠癌细胞的体外增殖、细胞凋亡、细胞周期进程和细胞迁移能力的影响,以及对小鼠结直肠癌移植瘤生长的抑制作用。方法采用溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)法、流式细胞术、划痕实验分别检测ISL作用后,结直肠癌HCT-116细胞及SW480细胞的增殖率、凋亡率、细胞周期分布及细胞迁移的变化。复制小鼠结直肠癌移植瘤模型,观察肿瘤生长,同时通过HE染色分析ISL干预移植瘤后的病理改变情况。结果ISL干预后HCT-116细胞及SW480细胞增殖率明显下降(P<0.01),G0/G1期细胞的比例降低(P<0.01),S期细胞的比例升高(P<0.05),细胞凋亡增多(P<0.05),同时细胞划痕的间隙增大,细胞迁移的距离较短。经ISL处理后,小鼠移植瘤的生长也受到显著抑制(P<0.05)。结论ISL可促使结直肠癌细胞发生凋亡,细胞周期于S期阻滞及细胞迁移力下降,同时可抑制结直肠癌细胞的体外增殖及体内移植瘤生长。     

血管基膜衍生多功能肽抗人结肠癌作用研究

目的 研究重组血管基膜衍生多功能肽（vascular basementme mbranederived muldfunction pepude，VBMDMP）的抗人结肠癌作用。方法 体外培养人结肠癌细胞系（SW480）细胞和中国仓鼠卵巢细胞系（CHO-K1）细胞。采用MTT比色法检测重组VBMDMP对SW480细胞选择性抑制增殖作用；胎盼蓝染色细胞计数法检测重组VBMDMP对SW480细胞和CHO-K1细胞生长曲线的影响；人结肠癌（SW480）细胞裸鼠异种移植瘤模型治疗实验观测重组VBMDMP体内抗人结肠癌作用。结果 重组血管基膜衍生多功能肽具有选择性抑制体外培养人结肠癌细胞系SW480细胞增殖和生长作用，呈剂量依赖性。而对CHO-K1细胞的增殖活性影响小。重组血管基膜衍生多功能肽对SW480细胞裸鼠异种移植瘤生长具有显著抑制作用．呈剂量依赖性。1、5、10mg／kg重组VBMDMP的肿瘤生长抑制率分别为：63％，79％和83％；瘤重抑制率分别为：62％、66％和75％。10mg/4kg重组VBMDMP的肿瘤生长抑制率和瘤重抑制率均接近100mg／kg环磷酰胺（CTX），高于20ms／kg 血管生成抑制剂烟曲霉素衍生物TNP-470。结论 重组血管基膜衍生多功能肽对人结肠癌细胞增殖和生长具有显著抑制作用。     

细胞周期素G1反义硫代脱氧寡核苷酸抑制HL-60细胞在裸鼠体内生长的实验研究

目的：探讨细胞周期素G1(cyclin G1)反义硫代脱氧寡核苷酸对HL-60细胞在裸鼠体内生长的抑制作用。方法：将裸鼠随机分成对照组、正义寡核苷酸(SON)组、反义寡核苷酸(ASON)组，其中SON组和ASON组接种转染的HL-60细胞(HL-60／S和HL-60／AS)前接受3Gy的^60Co照射；将各组HL-60细胞接种于裸鼠皮下连续观察裸鼠的出瘤时间、瘤体大小，计算抑瘤率；病理切片用苏木精．伊红染色，电镜观察移植瘤组织的结构和细胞形态变化；用流式细胞仪(FCM)和RT-PCR分别检测cyclin G1蛋白和mRNA水平的表达；电镜和FCM检测细胞凋亡。结果:①cyclin G1 ASON组与SON组和对照组比较，对HL-60细胞在裸鼠体内生长有明显抑制作用，抑瘤率为69．4％。成瘤率、瘤重、瘤体积明显小于SON组和对照组。②镜下见cyclin G1 ASON组的HL-60细胞部分细胞形态发生改变，核分裂象少见，细胞的异型性较小，并且有凋亡细胞出现。结论:cychn G1 ASON能明显抑制HL-60细胞在裸鼠体内的生长，并且促使部分细胞发生凋亡。     

成体表皮干细胞的分离培养与鉴定

目的 探讨成体表皮干细胞体外分离、培养和鉴定的技术方法。为组织工程皮肤的构建提供种子细胞。方法 通过中性蛋白酶消化成人包皮获得表皮细胞，再通过胰蛋白酶与乙二胺四乙酸（EDTA）消化并制成单个表皮细胞悬液，接种至人胎盘Ⅳ型胶原包被的培养瓶内．以Dulbecco改良Eagle培养基／F12（DMEM／F12，1：1）作为表皮干细胞培养基置培养箱内培养，37℃静置10～l5min，留用快速贴壁细胞继续培养，所得细胞分别以能否呈克隆状生长、流式细胞仪测细胞周期、透射电镜观察其超微结构及β1-整合素、角蛋白19（K19）免疫细胞化学染色进行鉴定。结果 人胎盘Ⅳ型胶原包被的培养瓶内快速贴壁细胞继续培养24h后细胞呈克隆状生长；电镜观察其超微结构示非成熟细胞特征；细胞周期分析示，第2代中静息期／DNA合成前期（G0／G1期）细胞占86．83％。β1-整合素、K19免疫细胞化学染色呈阳性。结论 成体表皮干细胞在体外得到成功分离与培养。     

氨茶碱对淋巴瘤细胞系增殖与凋亡的影响及机制探讨

为探讨磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）抑制剂在淋巴瘤细胞增殖与凋亡中的作用及机制，研究了非选择性PDE抑制剂氨茶碱（aminophylline，AM）对Burkitt淋巴瘤细胞系Raji的影响。采用MTT检测，光学显微术，电镜术及膜联蛋白V染色观察细胞增殖、细胞凋亡的形态学变化及凋亡率；用流式细胞术和RT-PCR技术检测细胞周期，周期蛋白B1和Bcl-2的表达及线粒体跨膜电位的变化。结果显示，氨茶碱对Raji细胞增殖呈浓度依赖性抑制作用；形态学观察发现随氨茶碱浓度增加，细胞体积明显缩小，核固缩，核染色质核膜下聚集，出现凋亡小体；细胞涂片显示，核染色质凝聚、核碎裂；电镜观察有典型凋亡细胞；膜联蛋白V染色显示氨茶碱诱导Raji细胞凋亡率增加，线粒体跨膜电位（Δφm）呈浓度依赖性下降；流式细胞术及RT-PCR显示氨茶碱下调Bcl-2蛋白及mR-NA的表达；细胞周期分析显示经氨茶碱处理的细胞出现S期阻滞、细胞周期蛋白B1表达下调。结论：氨茶碱可通过S期阻滞抑制细胞增殖、下调Bcl-2的表达及降低线粒体膜电位而诱导Raji细胞凋亡。     

DIM对雌激素非依赖性乳腺癌细胞增殖的影响

目的探讨3,3-二吲哚基甲烷(DIM)对雌激素非依赖性乳腺癌细胞MDA-MB-468体外增殖和体内成瘤能力的影响及其机制。方法 6×10~6个MDA-MB-468细胞接种BALB/c裸鼠,建立乳腺癌细胞异种肿瘤移植模型,5 mg/(kg·d)DIM喂食,检测DIM对MDA-MB-468肿瘤细胞致瘤及生长能力的影响。体外实验,不同浓度(0,30,60μmol/L)的DIM处理MDA-MB-468细胞,采用CCK-8法检测DIM对细胞增殖的影响;流式细胞仪测定细胞周期和细胞凋亡;Western印迹检测细胞周期调控蛋白(CyclinD 1),CDK4,CDC25A的表达水平。结果异种肿瘤移植模型中,DIM可显著抑制MDA-MB-468细胞的成瘤能力。体外实验,DIM对乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖的抑制作用呈时间和剂量依赖性。流式细胞仪结果显示;DIM可改变MDA-MB-468细胞进程,将其阻滞于G1/S、G2/M期,并且60μmol/L DIM作用组有明显的诱导凋亡作用。DIM作用MDA-MB-468细胞48 h后,细胞周期因子CyclinD I,CDK4及CDC25A蛋白表达呈剂量依赖性下降(P0.05)。结论 DIM可有效抑制雌激素非依赖性乳腺癌细胞的体外增殖和体内成瘤,其机制可能与细胞周期重要调控蛋白表达下调有关。     

氨茶碱对白血病K562细胞凋亡的影响

目的：探讨氨茶碱对慢性粒细胞白血病细胞系（K562细胞株）凋亡的影响。方法：取对数生长期的K562细胞加入250．0mg／L的氨茶碱共同培养，对照组不加氨茶碱，72h后收集细胞进行检测：采用吖啶橙染色，荧光显微镜观察细胞凋亡，流式细胞术（FCM）检测细胞周期。结果：吖啶橙染色出现明显凋亡形态学改变，细胞周期分析显示氨茶碱处理组S期细胞比率明显增高，提示S期阻滞。结论：氨茶碱可将K562细胞阻滞于S期，并诱导凋亡。     

鱼藤素对U937细胞细胞周期及核孔蛋白Nup98和Nup88的调控作用

目的研究鱼藤素对人类白血病细胞株U937细胞体外抗肿瘤作用，研究其引起细胞周期与核孔蛋白Nup98和Nup88的改变，探讨其抗癌作用的分子机制。方法采用MTT法检测细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞周期分布，激光共聚焦显微镜检测Nup98和Nup88蛋白表达变化，免疫电镜和流式细胞术观测鱼藤素对Nup98和Nup88的调控，Western blot检测鱼藤素对U937细胞Nup98和Nup88蛋白表达的影响。结果①鱼藤素对U937细胞具有明显的增殖抑制作用，其抑制作用呈时间和剂量依赖性。②鱼藤素作用U937细胞后细胞周期发生变化，0、5、10、20、40、80nmol／L鱼藤素处理U937细胞24h，主要使细胞阻滞于S期和G2／M期，而G1／G0期细胞呈浓度依赖性降低。G1／G0期细胞比例依次为73．01％、71．15％、68．42％、52．45％、43．99％和22．82％，S期细胞比例依次为17．18％、16．30％、18．09％、27．56％、31．21％和46．85％，G2／M期细胞比例依次为9．75％、12．31％、13．09％、18．99％、24．83％和27．79％。③鱼藤素可以调节U937细胞Nup98和Nup88的表达，低浓度即可使Nup98表达上调，而使Nup88表达下调。结论鱼藤素能够抑制U937细胞增殖，使细胞阻滞于S期和G2／M期，而G1/G0期细胞呈浓度依赖性降低。其抗肿瘤机制可能通过参与调控U937细胞Nup98和Nup88的表达，使Nup98表达上调，而使Nup88表达下调有关。     

二烯丙基二硫对人结肠癌SW480细胞增殖抑制的作用

目的探讨二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)对人结肠癌细胞系SW480增殖抑制作用及机制。方法以人结肠癌SW480细胞为实验研究对象，通过MTT法测定DADS对SW480细胞的增殖抑制效应，采用HE染色及流式细胞仪检测药物作用前后细胞形态学及细胞周期分布等方面的变化。结果MTT法测定结果显示DADS可抑制SW480细胞增殖。呈浓度依赖性；形态学观察发现DADS诱导SW480细胞呈现出成熟分化的特征；随着DADS浓度加大，阻滞在G2／M期的细胞数目增多，亚二倍体峰逐渐增高。结论DADS可抑制人结肠癌SW480细胞增殖，使癌细胞阻滞于G2/M期。     

人原发性肝癌细胞ABCG2+表型的检测、分离及其生物学特性的初步研究

目的检测人原发性肝癌ABCG2^＋亚群细胞并加以分离，对其生物学特性进行初步研究。方法通过PE-ABCG2单克隆抗体标记，流式细胞仪检测、分选ABCG2^＋细胞，体外培养后进行细胞周期、增殖活性和凋亡的检测。结果原发性肝癌细胞中存在ABCG^2＋表型，占细胞总数的1．3％；体外培养24 hours，ABCG2^＋表型有81．48％处于细胞周期的G0／G1期，non-ABCG2^-表型为46．05％；ABCG2^＋表型凋亡率为11．5％，non-ABCG2^-为27．9％；体外连续培养7天，ABCG2^＋表型增殖活性高于non-ABCG2^-表型。结论原发性肝癌细胞中存在比例为1．3％的ABCG2^＋亚群细胞，大多数处于细胞周期的G0／G1期，与non-ABCG2^＋-细胞相比，具有更高的增殖活性和抗凋亡能力。     

尺骨软骨样副脊索瘤的诊断与误诊分析

目的 探讨尺骨原发软骨样副脊索瘤的诊断、误诊原因及预防对策。方法 对1例尺骨软骨样副脊索瘤的标本，采用10％福尔马林固定，石蜡切片，HE染色，光镜观察及免疫组化，会诊和病理读片会讨论。结果 临床、X线均诊为骨囊肿，病理则因组织形态学上既象软骨样细胞又象脂肪样细胞而发不出明确诊断。会诊结果为副脊索瘤。免疫组化及病理读片会讨论的结果为软骨样副脊索瘤。结论 原发于尺骨的软骨样副脊索瘤非常罕见。组织学上为：在粘液基质中可见软骨和脊索两种成分恶性双相分化的肿瘤细胞。误诊的主要原因是：临床、X线均不具特征性和与其它骨病不易区别。肿瘤发病部位及类型罕见。临床、X线未想到，病理对此类型不认识。     

RNA干扰体外抑制肝癌细胞端粒逆转酶基因表达的研究

目的 利用小片段干扰RNA(siRNA)在肝癌细胞内诱导RNA干扰(RNAi)，抑制端粒逆转录酶(hTERT)基因表达，在体外进行RNAi对肝癌治疗的试验研究。方法 构建针对hTERT基因的siRNA(siRNA-hTERT)，转导入肝癌细胞7721，在瘤细胞内诱导RNAi，采用流式细胞分析、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法、免疫组化等技术检测siRNA处理前后细胞增殖及hTERT基因表达变化。结果 siRNA-hTERT对肝癌细胞生长抑制率达37．5％；细胞周期中S期细胞明显减少，G1／G0期细胞显著增加；hTERT基因的mRNA表达由99．4％下调到53．1％，其蛋白表达由86．3％下调到46．6％。结论 RNAi在体外明显抑制了肝癌细胞中hTERT基因的表达和瘤细胞增殖。     

正常人骨髓成纤维样基质细胞对骨髓瘤细胞RPMI8226增殖的影响

为了观察正常人骨髓成纤维样基质细胞系HFCL对多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226增殖的影响，建立了RPMI8226细胞和HFCL细胞共培养体系，用MTT法测粘附率，台盼蓝拒染法测定生长曲线；流式细胞术(FCM)检测细胞周期的变化，瑞氏—吉姆萨染色后进行分裂指数(MI)测定，Western blot检测增殖细胞核抗原(PCNA)表达。结果显示，与HFCL细胞共培养1小时后，RPMI8226细胞的粘附率为29．4％；生长曲线显示直接接触组RPMI8226细胞生长受抑，而非直接接触组(transwell组)无变化；RPMI8226细胞与HFCL细胞共培养后，直接接触组G1期细胞增高，S期细胞减少；其分裂指数表现为单独骨髓瘤细胞组大于与HFCL直接接触组；直接接触组PCNA表达下调。结论：正常人骨髓成纤维样基质细胞HFCL能抑制骨髓瘤细胞系RPMI8226的增殖，阻止其细胞周期的运行。     

猪骨髓间质干细胞生物学特性及分化为成骨细胞和心肌细胞的能力

目的：建立猪骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外分离培养方法。对猪MSCs的生物学特性及分化为成骨细胞和心肌细胞的能力进行研究。方法：抽取猪骨髓体外培养MSCs，绘制生长曲线，用流式细胞仪检测细胞周期。选择第二代MSC体外诱导分化为成骨细胞和心肌细胞。通过碱性磷酸酶染色及钙沉积对成骨细胞进行鉴定；用免疫组化，透射电镜鉴定心肌细胞。结果：MSC细胞形态呈长梭形或多边形，细胞生长曲线呈S形，群体倍增时间为26h，细胞周期显示有69．22％细胞处于Go／G1期，24．44％细胞处矛S期，细胞化学染色显示POX、SB阴性，PAS、α-NAE阳性，约1％细胞ALP阳性。MSC经体外诱导分化后可形成骨细胞和心肌细胞。结论：猪骨髓MSCs可在体外长期、稳定培养，具有多潜能分化活性，可以为何质干细胞系及组织工程研究提供较理想的细胞来源。为临床何质干细胞的应用研究提供动物模型，并为进一步的临床康复研究提供实验依据。     

异种无细胞真皮活性复合皮的制备

目的体外重建异种无细胞真皮活性复合皮.方法将表皮细胞、成纤维细胞种植于异种无细胞真皮基质表面,体外培养约1周,定时取材行真皮表面HE染色、常规组织切片HE染色及扫描电镜观察.结果表皮细胞、成纤维细胞种植后24h即贴附于真皮表面,电镜观察可见有伪足形成.培养5～7d可融合为致密单层细胞膜.结论以无细胞真皮为支架,采用细胞培养技术可于体外重建复合皮.     

酪氨酸磷酸酶抑制剂正矾酸钠对Raji淋巴瘤细胞增殖与凋亡的影响及机制探讨

为了探讨蛋白酪氨磷酸酶（PTPase)通路在淋巴瘤细胞增殖与凋亡中的作用及机制，应用细胞培养结合MTT检测，光镜及电镜形态学观察，DNA凝胶电泳，流式细胞术和RT-PCR研究了特异的酪氨酸磷酸酶抑制剂正矾酸钠（Na3VO4)对Burkitt淋巴瘤细胞系Raji的影响。结果：MTT检测及CFU-Raji培养显示Na3VO4对Raji细胞呈浓度依赖性抑制作用；倒置显微镜下原位观察发现随Na3VO4浓度增加，细胞体积明显缩小，核固缩，核染色质核膜下聚集，呈典型凋亡小体状；细胞胞体出芽，核染色质凝聚，核碎裂，电镜观察出现典型凋亡细胞；膜联蛋白染色显示Na3VO4诱导Raji细胞凋亡，线粒体跨膜电位下降，且在一定范围内呈浓度依赖性；DNA凝胶电泳出现DNA梯形条带；流式细胞术及RT-PCR示Na3VO4下调Bcl-2蛋白及mRNA的表达；细胞周期分析显示经Na3VO4处理的细胞出现G2-M期阻滞，细胞周期蛋白B1（cyclinB1)及mRNA的表达下调，结论：PTPase通路信号传导参与了Raji细胞增殖与凋亡过程的调节，加入其特异抑制剂Na3VO4可通过下调细胞周期蛋白B1的表达引起G2-M期阻滞抑制增殖，下调Bcl-2的表达及降低线粒体跨膜电位诱导Raji细胞凋亡。     

人脂肪间充质干细胞生物学特征及体外向类角质细胞的分化

目的：在体外不同培养条件下，脂肪来源问充质干细胞可以向成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞、内皮细胞、肌肉细胞、脂肪细胞和肝脏细胞等不同胚层来源的细胞分化。观察脂肪间充质干细胞在体外培养并向类角质细胞分化的能力。方法：实验于2005—06／2006—03在解放军军事医学科学院完成。实验方法：取20-45岁健康女性（已取得患者同意）脂肪组织行脂肪抽吸术后的脂肪颗粒。参照Zuk等方法分离脂肪问充质干细胞。取培养的第3代细胞，采用流式细胞仪鉴定细胞表面分子及细胞周期。取状态良好、融合至瓶底80％的第20代细胞，在5mg／L的秋水仙素处理后采集分裂细胞，以Giemsa染色进行核型分析。取第3代细胞以5μm维甲酸和5μg／L表皮细胞生长因子培养基向角质细胞诱导分化。对照组用含体积分数为0．05胎牛血清的L-DNMEM培养基。实验评估：采用倒置显微镜观察细胞形态，免疫组织化学方法检测角质细胞的标志物CK19。结果：①脂肪来源问充质干细胞表面分子CD29、CD90、CD44呈阳性，而CD34呈阴性。②细胞增殖曲线呈S型，接种的前3d细胞处于滞留期，3d后进入对数生长期，6d后进入平台期，细胞的群体倍增时间约为29h。处于对数生长期的细胞80％以上处于G0和G1期。③细胞染色体核型分析显示，染色体数目2n=46，核型46，xx，为女性正常核型。④对照组细胞贴壁后，呈成纤维细胞样，细胞呈长梭形，排列成漩涡状，贴壁较好。诱导组从诱导的第3天开始，细胞逐渐变成不规则，诱导第10天出现铺路石改变，形似角质细胞。⑤免疫组织化学方法检测显示，部分细胞专一地对CK19抗体呈阳性反应，有棕色染色。结论：可从人脂肪抽吸物中分离出间充质干细胞，脂肪间充质干细胞在体外一定条件下可向类角质细胞分化。