脂质转染剂促进反义核酸的摄取和抗病毒作用

人工构建特异性互补于乙型肝炎病毒ｍＲＮＡ ＳＰⅡ增强子区的１５聚反义硫代寡核 ，并用ｒ＾３２Ｐ末端标记，然后用脂质转染包装，在ＨＢＶ基因转染的ＨｅｐＧ２细胞上证明，Ｌｉｐｏ－ａｓＯＮ细胞内摄入量及抗病毒活性较末修饰体明显提高。     

反基因锁核酸体外阻断肝癌细胞系乙肝病毒S基因表达简

 目的 探讨针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区的锁核酸体外抑制细胞内病毒复制的效果。方法 针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区设计合成锁核酸、硫代寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以阳离子脂质体介导,体外转染HepG2.2.15细胞,采用荧光定量聚合酶链反应技术和时间分辨免疫荧光技术分别监测2、4、6、8和10 d细胞培养上清液中HBV DNA、HBsAg和HBeAg的含量;四甲基偶氮唑蓝法检测锁核酸对细胞代谢的影响。 结果 加入锁核酸后,对细胞内HBV DNA复制、HBsAg与HBeAg表达均有较明显的时间和剂量依赖性抑制作用,6 d后抑制率分别为52.14%、57.48%和29.63%。锁核酸对细胞代谢无明显影响。结论 针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区的锁核酸,体外能有效抑制乙肝病毒的复制,既为乙肝病毒治疗提供有效靶位,也为反基因治疗治疗提供理论和实验依据。     

乙型肝炎病毒转基因小鼠

乙型肝炎病毒转基因小鼠对研究HBV基因结构和功能，基因表达的调控，HBV的复制和致肝细胞病变的关系，HBV感染和宿主免疫系统的应答以及HBV感染与肝细胞癌之间的相互关系等，都有极为重要的意义。本文对HBV转基因小鼠及其在研究HBV中的应用进用综述。     

HBsAg中蛋白与IL-18联合核酸免疫HBsAg转基因小鼠的实验研究

对乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)转基因小鼠鼠系所进行的ＨＢＶ核酸疫苗免疫转基因小鼠的实验研究〔1,2〕 提示核酸疫苗有治疗潜力。本研究的目的是研究在白细胞介素 18(ＩＬ 18)的辅助作用下 ,ＨＢＶ表面抗原中蛋白核酸疫苗免疫ＨＢｓＡｇ转基因小鼠的效果。材料与方法质粒构建 :引物设计 :上游引物 :5′ ＧＴＡＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣ 3′ ;下游引物 :5′ ＧＴＡＧＡＴＣＴＧＡＧＡＧＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＴＴＧ 3′。ＰＣＲ法扩增ＨＢｓＡｇ中蛋白基因序列 ,将ＰＣＲ产物亚克隆至ｐＧＥＭＴｅａｓｙ载体 (Ｐｒ…     

HBV S基因反义锁核酸抑制病毒体外复制

 目的　探讨乙型肝炎病毒S基因反义锁核酸（LNA）片段在HepG22.2.15细胞内抗病毒效果及有效LNA片段筛选。方法　设计合成互补于HBV S基因mRNA翻译起始区同一位点的4条不同序列长度LNA片段,以阳离子脂质体介导,作用于HepG22.2.15细胞株,采用ELISA法和实时荧光定量聚合酶链技术（FQ-PCR）分别监测24、48和72h细胞培养上清液中HBsAg和HBV DNA的含量;四甲基偶氮唑蓝（MTT）法监测细胞代谢。结果　4条不同序列长度反义LNA均显著性抑制HBsAg表达和HBV DNA复制,72h后最高抑制率分别达72.43%和34.73%。HBsAg分泌量和HBV DNA的拷贝数均明显低于对照组（P<0.01）。LNA对细胞代谢无明显影响。结论　针对HBV S基因mRNA翻译起始区的反义LNA片段体外能显著抑制HBV表达,且抑制作用最强序列长度在15~25个碱基之间。     

反基因锁核酸体外抑制乙肝病毒前S1基因表达

 目的 探讨针对乙肝病毒前S1基因同聚嘌呤区的锁核酸体外抑制细胞内病毒复制的作用。方法 针对乙肝病毒前S1基因同聚嘌呤区,利用RNAstructure软件分别设计合成锁核酸、硫代寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以阳离子脂质体介导转染HepG2.2.15细胞,采用荧光定量聚合酶链反应技术（FQ-PCR）、时间分辨免疫荧光技术（TRFIA）和酶联免疫法（ELISA）分别监测1、3、5和7 d细胞培养上清液中HBV DNA、HBsAg和前S1抗原的含量;四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测锁核酸对细胞代谢的影响。结果 加入锁核酸后,对HBV DNA复制、HBsAg和前S1抗原表达均显示有较强的抑制作用,且抑制率随时间呈增高趋势,7 d后抑制率分别达64.32%、67.51%和63.88%。LNA对细胞代谢无明显影响。结论 针对乙肝病毒前S1基因同聚嘌呤区的反基因锁核酸,体外能有效抑制乙肝病毒的复制,既为乙肝病毒治疗提供有效靶位,也为反基因治疗提供理论和实验依据。     

反义锁核酸封闭c-myc第二外显子翻译起始区对肝癌细胞凋亡的影响

目的:探讨针对c-myc第二外显子翻译起始区的反义锁核酸对肝癌细胞活力和凋亡的影响。方法:设计合成能特异性封闭c-myc基因第二外显子翻译起始区的反义寡核苷酸、硫代寡核苷酸和锁核酸,分别以阳离子脂质体介导转染HepG2细胞,采用RT-PCR检测细胞内c-Myc的mRNA表达变化;Western blot检测细胞内cMyc的蛋白表达变化;流式细胞技术检测细胞凋亡情况;MTT法检测反义锁核酸的细胞毒性作用。结果:转染第5天后,反义锁核酸组c-Myc的mRNA相对表达量为0.335±0.016,明显低于对照组(P0.05);c-Myc蛋白相对表达量为0.448±0.037,也明显低于对照组(P0.01);凋亡细胞比例为32%±6%,显著高于对照组(P0.05)。结论:针对c-myc第二外显子翻译起始区的反义锁核酸能有效促进肝癌细胞的凋亡。     

LNAzyme特异性阻断丙肝病毒5'-NCR/C基因表达

目的 探讨针对HCV 5'-NCR/C双靶基因位点的锁核酸核酶对病毒基因复制与表达的特异性抑制作用.方法 实验分对照组和实验组.对照组分别为空白对照组和脂质体对照组.实验组分别为单靶区NCR组、单靶区C组和双靶区NCR/C组.半乳糖配体介导转染HepG2.9706细胞,用荧光定量PCR检测细胞培养液中HCV mRNA表达;化学发光技术检测细胞培养液中荧光素酶基因表达;荧光显微镜系统检测细胞内荧光蛋白表达;四甲基偶氮唑蓝法检测细胞代谢.应用SPSS 19.0统计学软件分析.各组间比较采用重复测量方差分析的SNK检验和Kruskal Wallis H检验.结果 加入锁核酸核酶后,对HCV RNA的复制均显示有较强的抑制作用(F=77.50,P＜0.05),单靶区NCR组、单靶区C组和双靶区NCR/C组的平均抑制率分别为62.12％、61.39％和75.37％;对荧光素酶的表达有抑制作用(F =48.65,P＜0.05),平均抑制率分别为66.49％、65.06％和73.30％.给药后24、48和96 h,HCV mRNA的平均抑制率分别为52.36％、66.81％和75.05％;荧光素酶的平均抑制率分别为53.02％、62.98％和79.45％;细胞内的荧光蛋白表达阳性细胞数均较对照组明显减少(P＜0.05).结论 针对5'-NCR/C基因位点的LNAzyme能特异性抑制丙型肝炎病毒的复制与表达,且双基因靶位优于单基因靶位.     

乙型肝炎病毒HBcAg免疫优势CTL表位多肽在HBV转基因小鼠体内的免疫学功能研究

目的 探讨基于乙型肝炎(Hepatitis bvirus ,HBV)核心抗原免疫优势细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位的治疗性多肽抗原组分、结构以及在HBV转基因小鼠体内的免疫学功能。方法 用分子设计的理论和方法，设计基于HBV核心抗原免疫优势性CTL表位、Pre—S2B细胞表位及破伤风类毒素通用TH表位的治疗性多肽疫苗候选分子，经Merri—field固相多肽合成技术合成，经高效液相色谱(HPLC)纯化、鉴定。以HBV转基因小鼠为试验对象，进行体内免疫学功能研究。结果 所设计治疗性多肽分子可在体诱导较强的抗原特异性CD8^ T细胞应答和适度的抗体反应，并抑制HBV特异性抗原的分泌和乙型肝炎病毒复制。结论 提示所设计基于HBV核心抗原免疫优势性CTL表位、Pre-S2 B细胞表位及破伤风类毒素通用TH表位的多肽分子可作为乙型肝炎治疗性多肽疫苗候选分子。     

乙型肝炎病毒转基因小鼠C57-TgN(adr2.0)SMMU品系的免疫病理研究

目的: 研究乙型肝炎病毒 (HBV)转基因小鼠C57 TgN(adr2. 0型)SMMU品系的免疫病理学特征, 并与临床人慢性乙肝相比较。方法: 以 20只SPF级肝脏有明显病变的HBV转基因小鼠为研究对象, 用间接免疫荧光法通过流式细胞仪, 分别检测转基因小鼠及正常C57BL/6小鼠外周血淋巴细胞表面CD3、CD4和CD8表达的水平, 同时取其肝组织和5例本院病理科存档确诊为慢性中度乙型肝炎患者的肝组织石蜡标本, 用EnVision免疫组化染色法检查肝组织内T细胞亚群的分布。结果: 转基因小鼠外周血淋巴细胞表面CD3、CD4和CD8表达的水平低于正常对照组小鼠; 肝组织内浸润的单个核细胞多数为CD3 CD4 细胞, 未发现CD57 、CD8 细胞。慢性乙型肝炎患者的肝组织内浸润的单个核细胞主要为CD3 CD4 或CD3 CD8 细胞和少量CD57 细胞。结论: C57 TgN(adr2. 0型 )SMMU的HBV转基因小鼠外周血及肝组织中CD的表达与人慢性乙肝患者的外周血及肝组织有明显不同。     

Hepatitis B virus (HBV)-transgenic mice as an investigative tool to study immunopathology during HBV infection

An overview is given regarding the use of hepatitis B virus (HBV) transgenic mice as an animal model of the HBV-carrier state. Initially, we show how HBV-transgenic mice have contributed insights into the immunopathobiological processes during HBV infection and later, we show how this new information from the experiments with HBV-transgenic mice could be used to develop new methods to combat HBV infection. By microinjecting the full or selected parts of the HBV-genome into the fertilized eggs of inbred mice, different laboratories have developed different lines of HBV-transgenic mice, which express products of the HBV genome and also show signs of HBV replication. Studies in HBV-transgenic mice have provided insights into the process of destruction of hepatocytes, the critical role of cytokines in controlling HBV replication and gene expression, mechanisms underlying the immune response defect in chronic HBV-carriers and the critical role of antigen presenting cells (APC), especially that of antigen presenting dendritic cells in persistent HBV infection. All this new information has given us a better understanding about HBV immunopathobiology, and has led to the development of new therapeutic approaches to combat HBV infection.     

高复制HBV转基因小鼠模型对抗乙型肝炎病毒药物的效应研究

 目的：研究高复制HBV转基因小鼠模型对抗乙肝病毒药物的效应评价。 方法： 选用抗乙肝药物拉咪呋啶、大剂量重组乙肝蛋白疫苗、α-1b型干扰素和RNA干扰在转基因小鼠进行药效及作用机制评价。 结果：拉咪呋啶、重组乙肝疫苗、α-1b型干扰素均可使HBV转基因小鼠血清中HBV DNA滴度显著降低。其中后两者还可提高机体脾细胞IL-2和IFN-γ的水平及使分泌IFN-γ脾细胞Elispot斑点数明显增加。将RNA干扰表达载体pU6-siHBV质粒尾静脉注入小鼠体内。注射后5 d血清HBsAg下降56.7%,抑制作用持续14 d。肝脏免疫组化显示HBcAg阳性细胞明显减少，但血清HBV DNA定量无明显降低。 结论： 本近交系高复制HBV转基因小鼠模型对抗乙肝药物药效学评估是可靠、可行的。     

丙肝病毒(HCV)及乙肝病毒(HBV)双表达载体的构建及表达

目的 :为探索HCV/HBV高效联合基因免疫策略 ,构建具有 2套独立表达单元的HCV/HBV真核表达载体。方法 :分别将与HCV核心区基因互补的cDNA和HBV核心区基因克隆于具有 2套独立表达单元的真核表达载体pRSC的巨细胞病毒启动子和RSV启动子下游 ,称为pRSC HBV/HCV ,转染SP2 / 0细胞 ,通过免疫荧光和Western印迹法观测蛋白的表达 ,免疫Balb/c小鼠 ,用酶联免疫小鼠体液免疫应答。结果 :pRSC HBV/HCV转染SP2 / 0细胞可见HBcAg及HCV核蛋白染色阳性荧光细胞 ,SDS Page电泳显示在 14kD及 2 1kD处均可见蛋白条带 ,与HBcAg及HCV核蛋白的的理论预期值一致 ,Western印迹分析显示在 14kD及 2 1kD处可见特异性的蛋白条带。 5只免疫鼠中全部出现抗 HCV及抗 HBV抗体 ,而对照组全阴性。结论 :pRSC HBV/HCV可分别表达HBcAg及HCV核蛋白 ,免疫Balb/c小鼠后可诱导其体液免疫应答 ,为进一步开展HCV/HBV联合基因免疫奠定了实验基础。     

针对S基因的siRNA或shRNA表达框对HepG2.2.15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用比较

目的 化学合成针对乙型肝炎病毒（HBV）S基因的siRNA，同时制备针对相同区段的shRNA表达框，并比较二者对HepG2．2．15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用。方法 化学合成针对HBVS基因的带有FITC标记的siRNA，设计合成带有FTrc标记的引物，PCR扩增含有RNA聚合酶Ⅲ启动子H1序列和shRNA编码序列的表达框，并对扩增产物进行纯化，将等摩尔数siRNA和shRNA表达框分别用脂质体转染稳定表达HBV的HepG2．2．15细胞，转染1d后流式细胞仪检测转染效率，转染3d后RT-PCR检测靶基因mRNA的水平，用SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测HBsAg的表达。收集转染前和转染后1、3、5和7d的细胞培养上清，检测HBsAg水平，同时用荧光定量PCR方法检测HBV　DNA的含量。结果成功制备了针对HBVS基因的shRNA表达框，将其与等摩尔数siRNA分别转染HepG2．2．15细胞后，RT-PCR证实细胞中HBV　mRNA水平降低，SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测到HBsAg的表达受到抑制，细胞培养上清中HBsAg和HBV DNA含量下降。与siRNA相比，shRNA表达框对HBV的抑制作用虽然起效较慢，但持续时间更长。结论shRNA表达框和siRNA均可明显抑制HBV的转录和表达，与siRNA相比，shRNA表达框能够更持久地抑制靶基因的表达。     

Increased liver pathology in hepatitis C virus transgenic mice expressing the hepatitis B virus X protein

Transgenic mice expressing the full-length HCV coding sequence were crossed with mice that express the HBV X gene-encoded regulatory protein HBx (ATX mice) to test the hypothesis that HBx expression accelerates HCV-induced liver pathogenesis. At 16 months (mo) of age, hepatocellular carcinoma was identified in 21% of HCV/ATX mice, but in none of the single transgenic animals. Analysis of 8-mo animals revealed that, relative to HCV/WT mice, HCV/ATX mice had more severe steatosis, greater liver-to-body weight ratios, and a significant increase in the percentage of hepatocytes staining for proliferating cell nuclear antigen. Furthermore, primary hepatocytes from HCV, ATX, and HCV/ATX transgenic mice were more resistant to fas-mediated apoptosis than hepatocytes from nontransgenic littermates. These results indicate that HBx expression contributes to increased liver pathogenesis in HCV transgenic mice by a mechanism that involves an imbalance in hepatocyte death and regeneration within the context of severe steatosis.     

恩替卡韦抑制乙型肝炎病毒复制型小鼠体内病毒的复制

目的 了解乙型肝炎病毒（HBV）复制型小鼠模型能否用于抗HBV药物的筛选。方法 采用高压注射体内转染法将HBV复制型重组质粒pHBV4.1导入雄性BALB/C小鼠,转染后24h按体重、年龄、血清HBeAg水平对小鼠进行配对,分为实验组和对照组（n=4）,2组小鼠分别连续3d（每日1次）给恩替卡韦和生理盐水灌胃。最后1次给药后24h处死小鼠。分别用Northern、Southern杂交检测小鼠肝脏HBV mRNA和HBV DNA复制中间体;ELISA检测血清中HBeAg和HBsAg。结果 重复2次实验的结果显示,实验组小鼠HBV DNA复制中间体水平明显低于对照组,而两组小鼠HBV mRNA、HBeAg和HBsAg水平无明显差异。结论 恩替卡韦抑制HBV复制型小鼠体内HBV的复制,提示该小鼠模型可以用于抗HBV药物的初步筛选。