CDK2促进K562细胞早期红系分化

目的 探讨细胞周期调节蛋白CDK2对K562细胞红系分化的影响.方法 分别用CDK2表达质粒和干扰RNA分子转染K562细胞,用Western blot法检测过表达或干扰效率,使用real-time PCR和联苯胺染色法检测K562细胞分化.结果 CDK2在K562细胞红系分化早期呈现表达上升趋势;在K562细胞中过表达CDK2可促进hemin诱导的红系分化;反之,干扰K562内源的CDK2表达会对K562红系分化产生抑制作用.结论 CDK2在K562细胞早期红系分化过程中发挥促进作用.     

miR-34a-5p抑制K562细胞红系分化

目的探索miR-34a-5p对K562细胞红系分化的影响。方法分别用miR-34a-5p模拟物和反义抑制寡核苷酸转染K562细胞,用real-time PCR法检测过表达或干扰效率,并进一步用流式细胞术和联苯胺染色法检测K562细胞向红系的分化情况;通过Western blot方法检测miR-34a-5p的靶基因。结果 miR-34a-5p在K562细胞红系分化过程中呈现表达下降趋势;在K562细胞中过表达miR-34a-5p可抑制hemin诱导的红系分化(P0.05);反之,干扰K562内源的miR-34a-5p表达会对K562红系分化产生促进作用(P0.01);另一方面,miR-34a-5p通过靶向抑制c-MYB的表达抑制细胞向红系分化。结论 miR-34a-5p通过抑制c-MYB在K562细胞早期红系分化过程中发挥促进作用。     

微小RNA miR-181a促进慢性粒细胞白血病K562细胞分化

目的探讨微小RNA miR-181a对慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞的作用。方法构建了miR-181a过表达的慢病毒载体,采用实时定量PCR方法检测CD235a和γ球蛋白的表达,评价K562细胞向红系分化的程度,检测CD61和CD41的表达,评价K562细胞向巨核系分化的程度,采用CCK实验检测细胞增殖情况。结果氯高铁血红素佛及波酯诱导后,miR-181a在K562细胞中过表达能够增强CD235a、γ球蛋白、CD61和CD41的表达水平(P0.05);miR-181a过表达能够明显抑制K562细胞的增殖(P0.05)。结论 miR-181a过表达促进K562细胞的分化并抑制其细胞的增殖。     

KLF4过表达抑制人白血病K562细胞系的增殖及迁移

目的探索人锌指转录因子Krüppel样因子4(KLF4)过表达对人慢性髓系白血病细胞K562增殖及迁移能力的影响。方法设稳定过表达KLF4的白血病K562细胞系作为实验组(命名为K562-KLF4细胞),空白K562细胞及空质粒转染的K562细胞(命名为K562-C1细胞)作为对照组。实时荧光定量PCR检测各组细胞KLF4mRNA的表达含量;Western blot检测各组细胞KLF4的蛋白相对表达含量;MTS法检测各组细胞的增殖水平;Transwell检测各组细胞的迁移能力。结果 K562-KLF4细胞KLF4 mRNA的相对表达量比2个对照组明显增高(P0.05);与对照组相比,K562-KLF4细胞KLF4蛋白相对表达含量明显增加(P0.05),其过表达率为77.78%;K562-KLF4细胞增殖和迁移能力明显被抑制(P0.05)。结论 KLF4过表达能抑制K562细胞的增殖及迁移能力。     

当归多糖诱导K562细胞向红系样细胞分化及其信号转导通路研究

目的 探讨当归多糖(APS)诱导K562细胞向红系样细胞分化相关的信号转导通路. 方法 实验分组:对照组采用常规方法培养;APS组在常规培养基础上加入APS(终浓度100～500mg/L),分别培养12h、1d、2d、3d.联苯胺染色与分光光度法检测经APS诱导后K562细胞向红系样细胞分化的血红蛋白表达;激光扫描共焦显微镜观察JAK_2、信号转导和转录激活因子5(STAT_5)在各组细胞内的分布;Western blotting检测细胞核、质蛋白中JAK_2、STAT_5的表达变化;免疫沉淀法检测质蛋白中JAK_2的磷酸化改变. 结果 经APS诱导后K562细胞的联苯胺染色阳性率增高,随着APS诱导浓度增加K562细胞合成血红蛋白也增加;APS诱导K562细胞12h、24h和48h,核蛋白中STAT_5表达较对照组增加,质蛋白中STAT_5表达减少;APS组与对照组K562细胞的JAK_2表达未见显著差异,但APS组的JAK_2磷酸化强于对照组. 结论 APS可诱导K562细胞向红系样细胞分化,其机制可能与APS启动JAK_2的酪氨酸磷酸化,继而引起STAT_5核转位,通过信号转导通路的调控影响细胞的增殖分化.     

转录因子Sp1抑制K562细胞红系分化

 目的 研究转录因子Sp1在K562细胞诱导向红系分化过程中的表达变化,并确定其对于红系分化及珠蛋白表达的影响。方法 用定量PCR及Western blot的方法确定Sp1在红系分化过程中的表达情况。通过RNAi的方法抑制Sp1的表达,并通过联苯胺染色确定K562细胞中血红蛋白的表达情况,同时定量PCR的方法分析红系分化相关基因的表达,流式细胞技术检测红系分化过程中表面标志蛋白的表达情况。结果 在hemin诱导的K562细胞以及促红细胞生成素EPO诱导的造血干细胞向红系分化过程中,Sp1的mRNA及蛋白水平均呈明显下降,提示其可能负调节红系分化过程。在K562细胞中抑制Sp1的表达则可明显提高K562细胞中的血红蛋白含量,促进γ-,ε-珠蛋白,CD71,CD235a基因的表达,同时CD71,CD235a阳性细胞比例明显增加。结论 以上结果说明转录因子Sp1负调节红系分化过程,抑制Sp1的表达可提高K562细胞中珠蛋白的表达,并促进K562细胞向红系分化。     

氨基甾体H42649对K562白血病细胞的抑制增殖和诱导分化作用

目的观察氨基甾体H42649对人慢性粒细胞白血病K562细胞系的抑制增殖和诱导分化作用。方法采用液体培养实验,MTT实验,集落培养实验观察10-8～10-4mol/L浓度的H42649对K562细胞增殖能力的影响;采用Wright-Giemsa染色,联苯胺染色和流式细胞术评价10-6mol/L浓度的H42649对K562细胞的诱导分化作用。结果不同浓度的H42649连续作用K562细胞1～5 d后,细胞计数和集落计数明显减少;第5 d处理组的MTT值显著低于对照组,并呈剂量依赖关系;10-6mol/L浓度的H42649对K562细胞作用5d后,联苯胺染色A值升高(P<0.01),形态学观察其趋向成熟分化,流式细胞术检测药物处理4 d后K562细胞膜上CD71表面标记表达阳性率为84%。结论氨基甾体H42649能显著抑制K562细胞的增殖并诱导其向红系分化,提示该药可作为一种新型慢粒白血病细胞的诱导分化剂。     

低氧下K562细胞向红系分化进程中GATA-1与miR-451a表达的相关性研究

目的:探讨低氧下人慢性髓细胞性白血病K562细胞向红系分化进程中GATA结合蛋白1(GATA binding protein-1,GATA-1)与微小RNA-451a(microRNA-451a,miR-451a)表达的相关性。方法:将K562细胞分为常氧组和低氧(1%O2)组,经40μmol/L氯化血红素分别诱导分化至48和72 h。RT-qPCR检测γ-珠蛋白(γ-globin)的mRNA表达,联苯胺染色观察细胞血红蛋白生成情况,流式细胞术检测CD235a的表达水平,验证K562细胞红系分化模型是否复制成功。在K562细胞向红系分化的不同时点,采用Western blot检测两组细胞GATA-1的蛋白表达情况;采用RT-qPCR检测两组细胞GATA-1 mRNA和miR-451a的表达水平并进行相关性分析。检测GATA-1过表达组、干扰组和阴性对照组K562细胞的红系分化指标,同时采用瑞氏-吉姆萨染色法分析上述组别细胞形态学的变化,明确GATA-1过表达和抑制后K562细胞的红系分化情况。RT-qPCR检测GATA-1过表达和抑制后miR-451a的表达变化。结果:两组细胞分化48 h和72 h后,γ-globin表达量、联苯胺染色阳性率和CD235a表达量均显著高于0h(P<0.05),且低氧组72 h的γ-globin表达量、联苯胺染色阳性率和CD235a表达量均显著高于常氧组(P<0.05)。低氧组GATA-1 mRNA和miR-451a的表达水平随红系分化过程均呈现上升趋势(P<0.05),并在72 h均显著高于常氧组(P<0.05)。相关性分析结果显示,低氧下GATA-1 mRNA与miR-451a的表达呈正相关(P<0.01)。GATA-1慢病毒感染K562细胞72 h后,低氧下过表达组γ-globin表达量、联苯胺染色阳性率、CD235a表达量及体积增大、核偏移和核缩小的细胞数均显著高于阴性对照组(P<0.05);72 h干扰组γ-globin表达量、联苯胺染色阳性率、CD235a表达量及体积增大、核偏移和核缩小的细胞数均显著低于阴性对照组(P<0.05)。与阴性对照组相比,低氧下过表达GATA-1后,72 h时miR-451a的表达显著增高(P<0.05);干扰GATA-1后,72 h时miR-451a的表达显著降低(P<0.05)。结论:低氧通过诱导GATA-1表达增高而上调miR-451a,从而促进K562细胞向红系分化。     

IFN-γ促进红系终末分化

目的探索IFN-γ对体外红系终末分化的调节作用。方法用real-time PCR法检测IFN-γR1/R2在血红素(hemin)诱导K562细胞红系分化过程中的表达变化。以IFN-γ处理hemin诱导的K562细胞和人脐血CD34+细胞来源的红系细胞,用real-time PCR检测红系分化标志物CD235a和CD71表达。用联苯胺染色展现IFN-γ处理的K562细胞中血红蛋白含量,通过Western blot和real-time PCR检测红系相关转录因子GATA1和NFE2的表达。结果 Hemin诱导下分化的K562细胞中IFN-γR1/R2 mRNA先减少后增高,IFN-γ促进K562及造血干祖细胞红系分化晚期CD71及CD235a的表达,增加联苯胺阳性染色率。IFN-γ对红系分化的促进作用具有时间依赖性。机制研究表明IFN-γ可促进红系关键转录因子NFE2的表达。结论 IFN-γ促进K562细胞及人脐血造血干祖细胞的红系终末分化。     

蛇六谷提取物抑制K562细胞增殖并诱导分化的作用

目的:探讨蛇六谷提取物(TuAKe)抑制人慢性髓系白血病K562细胞增殖和诱导分化的作用机制。方法:不同浓度的TuAKe处理K562细胞,MTT比色法和半固体集落形成实验检测K562细胞的增殖能力;瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态;流式细胞术检测分化相关抗原CD11b、CD14和CD42b的阳性表达率;Western blot法检测细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白E1(cyclin E1)和红系分化核转录因子GATA-1的蛋白表达水平。结果:TuAKe能够抑制K562细胞增殖,改变细胞形态,抑制K562细胞进入S期,并阻滞在G_2/M期,提高分化相关抗原CD11b、CD14和CD42b阳性表达率,上调GATA-1蛋白表达,同时下调CDK2和cyclin E1蛋白表达(P0.05)。结论:TuAKe可能通过调控细胞周期抑制K562细胞增殖,同时诱导K562细胞多向分化。     

p38-2G4蛋白高表达对小鼠红白血病细胞增殖和分化的影响

目的探讨小鼠增殖相关蛋白p38-2G4基因表达上调对小鼠红白血病(MEL)细胞增殖和诱导分化能力的影响。方法构建p38-2G4-pLJM1高表达重组载体与pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.2包装质粒共转染HEK293T细胞慢病毒,感染MEL细胞,建立稳定高表达p38-2G4蛋白的MEL细胞系,Western blotting检测稳定株p38-2G4蛋白的表达。MTT实验和联苯胺染色法检测p38-2G4蛋白高表达对MEL细胞增殖和诱导分化能力的影响。结果高表达稳定株中p38-2G4蛋白表达量明显高于对照组细胞(P0.05)。p38-2G4蛋白的高表达能显著影响MEL诱导分化过程,导致血红蛋白合成减少(P0.05),但不能明显改变细胞活力(P0.05)。结论 p38-2G4蛋白的高表达对MEL细胞增殖无明显影响,但能显著影响其被丁酸钠诱导分化的过程。     

Daxx抑制K562细胞向巨核细胞分化

目的:观察过表达死亡结构域相关蛋白(Daxx)对K562细胞活力和向巨核细胞分化的影响。方法:建立稳定过表达Daxx的K562细胞,荧光显微镜观察、实时荧光定量PCR和Western blot检测Daxx的过表达效果,CCK-8法检测过表达后细胞活力的变化;佛波酯(PMA)诱导K562细胞向巨核细胞系分化,Western blot检测在K562细胞向巨核细胞分化过程中Daxx和p-ERK的表达变化,流式细胞术检测CD41和CD61的表达变化;PMA处理过表达Daxx的K562细胞,NBT还原实验检测细胞分化情况,流式细胞术检测过表达Daxx后CD41和CD61的表达变化,Western blot检测p-ERK的蛋白水平。结果:建立了稳定的过表达Daxx的K562细胞,过表达Daxx抑制K562细胞的活力。PMA诱导K562细胞向巨核细胞分化,CD41和CD61表达水平增高,同时p-ERK的蛋白水平升高,Daxx表达水平下降。过表达Daxx可以抑制K562细胞向巨核细胞分化,CD41和CD61表达降低,同时p-ERK的蛋白水平降低。结论:过表达Daxx可以抑制K562细胞生长及向巨核细胞分化,同时抑制ERK的磷酸化。     

siRNA沉默RALA基因影响人白血病K562细胞增殖和凋亡

目的: 研究小干扰RNA(siRNA)抑制v-ral 猴白血病病毒癌基因同系物A(RALA)基因表达对人慢性粒细胞性白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。方法: 利用Lipofectamine^TM 2000将化学合成的RALA siRNA转染体外培养的K562细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测RALA siRNA对K562细胞增殖的影响;台盼蓝拒染法检测RALA siRNA对K562细胞存活率的影响;real-time PCR检测RALA mRNA表达水平;Western blotting检测RALA蛋白表达水平;annexin V/PI双染流式 细胞仪检测RALA siRNA对K562细胞凋亡的影响;Hoechst 33258染色荧光显微镜观察细胞形态学变化。结果: RALA siRNA可明显抑制K562细胞内RALA mRNA和蛋白的表达(P<0.05);与阴性对照组相比,转染RALA siRNA的K562细胞增殖明显受到抑制(P<0.05);流式细胞术结果显示转染RALA siRNA的K562细胞凋亡较阴性对照组显著增加(P<0.05);Hoechst 33258染色见转染RALA siRNA的K562细胞出现典型的凋亡形态学变化。结论: 癌基因RALA在白血病发生发展过程中发挥重要作用。siRNA下调RALA mRNA和蛋白的表达,可抑制人白血病K562细胞增殖,诱导细胞凋亡,提示RALA可能是白血病治疗的新靶点。     

下调miR-21 抑制PI3K / AKT 信号通路对白血病细胞增殖凋亡的影响

目的:探讨miR-21 对白血病K562 细胞增殖凋亡的影响及对PI3K/ AKT 信号通路的调控作用。方法:将K562 细胞分为对照组、miR-21 NC 组和miR-21 干扰组,对照组不做处理,后两组采用阳离子脂质体LipofectamineTM2000 转染miR-21 inhibitor 和miR-21 negative control。转染48 h 后,利用实时荧光定量(qRT-PCR)检测各组细胞中miR-21 mRNA 的表达情况,采用MTT 比色法检测miR-21 对细胞增殖率的影响,流式细胞仪检测miR-21 对细胞周期和凋亡率的影响,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测miR-21 对各组细胞中PI3K/ AKT 信号通路相关蛋白PI3K、AKT 和p-AKT 表达的影响。结果:miR-21 干扰组中细胞的miR-21 mRNA 表达水平和细胞的存活率较对照组和miR-21 NC 组均明显降低;与对照组和miR-21 NC 组比较,流式细胞仪检测miR-3 干扰组中G0/ G1 期所占细胞比例明显升高,S 期细胞所占比例明显下降,细胞的凋亡率明显升高。Western blot 检测p-AKT 的表达水平较对照组和miR-21 NC 组明显下降,但PI3K 和AKT 蛋白的表达水平变化不大。结论:下调miR-21 能够抑制白血病K562 细胞的增殖,促进其凋亡,其作用机制可以与抑制PI3K/ AKT 信号通路有关。     

地西他滨抑制K562白血病细胞增殖和诱导分化的作用

目的:观察地西他滨(DAC)抑制白血病K562细胞生长和诱导分化的作用。方法:不同浓度的DAC处理K562细胞。MTT法和半固体集落生成实验检测K562细胞增殖能力;瑞氏染色观察细胞形态;流式细胞术检测分化相关抗原CD11b和CD42b阳性表达率;Western blot检测细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白E1(cyclin E1)、细胞周期负调控因子P27、红系分化核转录因子GATA-1及粒系分化核转录因子PU.1蛋白的表达水平。结果:DAC能够减少K562细胞集落形成的数量,降低细胞活力,减少核质比,抑制K562细胞进入S期,并阻滞在G_2/M期,提高分化相关抗原CD11b和CD42b阳性表达率,上调P27、GATA-1和PU.1蛋白表达,同时下调CDK2和cyclin E1蛋白表达。结论:DAC可能通过调控细胞周期抑制K562细胞增殖,同时诱导多向分化。     

黏蛋白16基因通过磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路调节胆囊癌细胞活力和迁移

目的 探讨黏蛋白16基因（MUC16）是否通过磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路调节胆囊癌细胞（GBC-SD）活力和迁移。 方法 过表达MUC16后,通过Real-time PCR筛选相关基质金属蛋白酶（MMP）家族的蛋白质。其次,过表达MUC16、敲低MUC16和PI3K/Akt通路抑制剂BKM120处理后,通过免疫印迹法检测PI3K/Akt通路和MMP-9的蛋白水平。最后,过表达MUC16或敲低MUC16,通过细胞计数试剂盒8（CCK-8）和刮伤实验检测GBC-SD的活力和迁移情况。 结果 过表达MUC16后,MMP-9 mRNA的相对表达量显著升高（P<0.05）。过表达MUC16后, MMP-9、p-Akt、PI3K的蛋白水平明显升高（P<0.05）,但是PI3K抑制剂BKM120可以避免这现象。而敲低MUC16后,发现MMP-9、p-Akt、PI3K的蛋白水平明显降低（P<0.05）。过表达MUC16后,GBC-SD的细胞活力和迁移能力明显增高（P<0.05）,而敲低了MUC16后,GBC-SD的细胞活力和迁移能力明显降低（P<0.05）。另外,敲低MMP-9后,GBC-SD的细胞活力和迁移能力也明显降低（P<0.05）。但是,在过表达MUC16的同时敲低MMP-9,发现GBC-SD的细胞活力和迁移能力与对照组相比差异无显著性（P>0.05）。 结论 MUC16激活PI3K/Akt通路促进MMP-9的蛋白表达,进而提升胆囊癌细胞GBC-SD的细胞活力和迁移能力。     

RNA干扰致基因表达沉默细胞模型的建立

目的探讨siRNA和shRNA在基因功能研究中的应用。方法用化学方法合成siRNA,以及用常规的分子克隆方法构建shRNA表达载体。以人类K562细胞为实验对象,采用lipofectamine将MDM2基因的siRNA和shRAN表达载体导入细胞后,用多重RT鄄PCR和Westernblot检测目标基因MDM2的表达水平。结果K562细胞瞬时转染MDM2siRNA48h后,MDM2蛋白质表达下降超过60%;稳定转染shRNA表达载体后,MDM2基因在mRNA和蛋白质表达水平下降超过70%。实验结果表明成功地建立了MDM2表达下调的实验细胞模型。结论siRNA和shRNA都能有效地导致目标基因表达沉默,在基因功能研究中瞬时转染和稳定转染需要配合使用以获得更理想的实验结果。