我国主要问号钩端螺旋体血清群lipL21基因序列及其产物免疫反应性分析

目的 分析我国15群15型问号钩端螺旋体（简称钩体）参考标准株外膜脂蛋白lipL21基因序列，构建该基因原核表达系统并鉴定表达产物的免疫原性，了解lipL21基因自然表达状况。方法 高保真PCR扩增上述问号钩体株及双曲钩体Paloc型PalocⅠ株基因组DNA中全长lipL21基因片段，T-A克隆后测序并构建其原核表达系统。分别用钩体TR/PatocⅠ和rLipL21兔抗血清为一抗的Western blot鉴定目的重组蛋白rLipL21的免疫原性，显微镜凝集试验（MAT）检测rLipL21兔抗血清的交叉凝集效价。以盐变-去垢剂处理法提取钩体外膜蛋白，用SDS-PAGE和免疫印迹法检测上述钩体株lipL21基因自然表达情况。结果 上述钩体株均存在序列高度保守的lipL21基因，其核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98．75％～99．82％和99．46％～100％。rLipL21能与TR/PatocⅠ及rLipL21兔抗血清发生结合反应。rLipL21免疫家兔能产生抗体，该抗体对上述15株问号钩体MAT效价为1：16～1：128。问号钩体外膜标本中均可检出LipL21，双曲钩体则否。结论 我国钩体群参考标准株均含有序列保守的lipL21基因并自然表达于外膜，双曲钩体PatocⅠ株虽含有lipL21基因但未表达。rLipL21具有良好的抗原性和免疫反应性，有可能作为新型钩体疫苗或检测试剂盒的候选属特异性表面抗原之一。     

钩端螺旋体属特异性外膜蛋白抗原的分析

致病性问号钩端螺旋体(简称钩体)血清群众多,各群间交叉保护作用较弱或无,目前国内外均采用当地流行的钩体血清群来制备多价钩体疫苗,但对疫苗中未包含钩体血清群感染的保护作用极其有限,易造成钩体病的暴发流行。已知80℃灭活、生理盐水回收的腐生性双曲钩体PatocⅠ株全细胞抗原(TR PatocⅠ)能与所有钩体病人血清发生凝集反应,但其抗血清能否凝集不同血清群的问号钩端螺旋体尚不清楚。本研究中,我们采用TR PatocⅠ免疫的兔抗血清与我国15群17型问号钩体参考标准株、2群2型双曲钩体国际标准株进行了显微镜凝集试验(MAT) ,发现该抗血清能…     

环介导的等温扩增与实时荧光PCR检测问号钩端螺旋体的比较

目的 通过比较环介导的等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与实时荧光PCR( real-time PCR)技术在检测问号钩端螺旋体的特异性及灵敏度方面的差异,寻找一种快速、灵敏且特异性强的问号钩端螺旋体检测方法。方法 根据问号钩端螺旋体lipL41基因序...     

问号钩端螺旋体ompA基因分析及其重组表达产物的免疫学鉴定

目的 了解我国15群15株问号钩端螺旋体(简称问号钩体)参考标准株携带ompA基因情况,重组表达OmpA(rOmpA)并鉴定rOmpA的免疫原性和免疫保护性.方法 采用酚-氯仿法提取问号钩体基因组DNA,PCR扩增全长ompA基因,T-A克隆后测序.构建问号钩体黄疸出血群赖型56601株ompA基因的原核表达系统,采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶}冬{像分析系统检测rOmpA表达情况及其产鼍.rOmpA免疫家兔以获得抗血清,采用免疫扩散试验检测抗血清效价.采用Western blot检测rOmpA与其抗血清和问号钩体56601株全菌抗血清的免疫反应性,显微镜凝集试验(MAT)检测rOmpA抗血清对15株问号钩体的交叉凝集情况.分别采用问号钩体黏附J774A.1细胞模型和豚鼠感染模型,了解rOmpA兔抗血清黏附阻断及rOmpA免疫保护作用.结果 15株问号钩体均含有序列保守的ompA基因,双曲钩体Patocl株则否.rOmpA表达量约占细菌总蛋白的20%.rOmpA能诱导家兔产生抗体,其抗血清免疫扩散效价为1:4.兔抗血清及问号钩体56601株全菌抗血清均能与rOmpA产生阳性Western blot信号.rOmpA抗血清对15株问号钩体的MAT效价为1:20～1:320.1:10～1:160稀释的rOmpA抗血清均能阻断问号钩体黏附J774A.1细胞,100μg和200μg rOmpA对豚鼠的免疫保护率分别为50.0%和75.0%.结论 ompA基因仅存在于不同血清群致病性问号钩体基因组中.rOmpA具有较好的抗原性,多种免疫学方法 检测显示,有可能作为通用型问号钩体基因上程疫苗的候选抗原.     

问号钩端螺旋体脂蛋白LipL32膜定位及其免疫应答

目的 确定问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性脂蛋白抗原LipL32膜定位及其自然抗体应答情况和抗体类型.方法 IPTG诱导目的 重组蛋白rLipL32-1和rLipL32-2表达,Ni-NTA亲和层析法提纯rLipL32.采用显微镜凝集试验(MAT)检测四川地区钩体患者血清标本及rLipL32兔抗血清与我国问号钩体参考标准株的交叉凝集情况.采用胶体金免疫电镜技术对LipL32进行膜定位.建立基于rLipL32的ELISA,检测钩体患者血清中特异性抗体类型及其水平.结果 黄疸出血群是四川地区最主要的优势钩体血清群.rLipL32兔抗血清均能与我国问号钩体参考标准株发生MAT效价为1∶80～1∶320的交叉凝集反应.LipL32是位于钩体外膜表面的蛋白质分子.156例MAT阳性钩体患者血清标本中,rLipL32-1和rLipL32-2特异性IgM阳性率分别为91.0%～92.9%和90.4%～92.3%,特异性IgG阳性率分别为99.4%和97.4%～98.1%.结论 LipL32是问号钩体属特异性表面蛋白抗原.自然感染钩体时,LipL32-1和LipL32-2可诱导机体产生IgM和IgG两类血清抗体.rLipL32-1和rLipL32-2可作为研制检测试剂盒的候选抗原.     

问号钩端螺旋体血清群LipL41基因型分析及其表达产物的免疫学鉴定

目的 确定我国15群15株问号钩端螺旋体(简称钩体)参考标准株和2群2株双曲钩体国际标准株携带LipL41基因情况，构建该基因的原核表达系统，鉴定表达产物的免疫原性。方法 常规酚—氯仿法提取上述17株钩体基因组DNA，高保真PCR扩增全长LipL41基因片段，T—A克隆后测序分型。构建LipL41基因原核表达系统，SDS-PAGE检测重组目的蛋白(rLipL41)表达情况。分别用钩体属特异性TP/patoe Ⅰ抗原、rLipL41兔抗血清的Western blot鉴定其免疫反应性和抗原性。分别用显微镜凝集试验(MAT)、钩体黏附J774A．1细胞模型检测兔抗rLipL41血清的交叉凝集效价和黏附阻断作用。结果 15株问号钩体均有LipL41基因，并可分为LipL41／1和LipL41／2两种基因型，2株双曲钩体则否。11个LipL41／1基因和4个LipL41／2基因克隆之间的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为88．61％—88．67％和93．24％—97．18％。所构建的原核表达系统rLipL41／1和rLipL41／2的表达量分别占钩体总蛋白的30％和40％。rLipL41／1和rLipL41／2均能与TP/patoe Ⅰ抗血清发生结合反应，免疫家兔能产生抗体。rLipL41／1和rLipL41／2兔抗血清对上述15株问号钩体MAT效价为1：8，1：128、1：16～1：2．S6稀释时均能有效地阻断钩体对细胞的黏附。结论 我国主要的15群问号钩体代表株均有LipL41／1或LipL41／2基因。所构建原核表达系统能高效表达rLipL41／1和rLipL41／2。rLipL41／1和rLipL41／2是具有良好抗原性和免疫反应性、广泛存在于不同血清群问号钩体表面的蛋白抗原。     

问号钩端螺旋体T和B细胞表位联合基因的原核表达及其产物免疫性分析

目的 构建问号钩端螺旋体(简称钩体)LipL32、OmpL1和LipL21蛋白的优势T-和B-细胞联合表位融合基因及其原核表达系统,并对表达产物的免疫原性进行鉴定.方法 人工合成多表位联合基因并构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE检测重组蛋白;采用MAT检测重组蛋白兔抗血清与我国钩体标准参考株的凝集效价;Western blot和ELISA检测重组蛋白的免疫原性.结果 获得了多表位融合基因并构建了原核表达系统.表达产物的相对分子质量约为23×103,且主要以可溶性形式存在;重组蛋白兔抗血清免疫双扩散效价为1∶8,该抗血清能与我国15群的钩体标准参考株发生凝集反应,ELISA证明该重组蛋白能检测不同群型钩体感染患者血清中的抗钩体抗体.结论 成功构建了包含钩体LipL32、OmpL1和LipL21蛋白的优势T和B细胞联合表位基因及其原核表达系统,表达产物具有良好的抗原性和交叉免疫反应性,可作为研制通用型问号钩体基因工程疫苗及血清学检测的抗原.     

钩端螺旋体多抗原肽的构建及免疫性分析

目的 构建问号钩端螺旋体(简称钩体)主要外膜蛋白OmpL1、LipL21和LipL32优势抗原表位的串联基因及其表达系统,了解该重组蛋白的免疫活性.方法 采用噬菌体M13KE表面展示技术结合Western blot分析,鉴定了OmpLl、LipL21和LipL32的优势抗原表位,人工合成优势抗原表位串联基因并构建其原核表达系统.SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况;Western blot及ELISA鉴定重组蛋白的免疫活性.结果 该合成基因在原核表达系统中得到了有效表达,且表达产物主要以可溶性形式存在.Western blot和ELISA结果 显示该重组蛋白能与兔抗钩体全菌抗体及不同血清群的钩体病人血清中的抗体产生免疫反应.结论 本研究成功构建了钩体多表位串联基因及其表达系统,所表达目的 蛋白具有良好的免疫活性,且对不同血清群型抗体之间均有免疫原活性.     

问号钩端螺旋体rLTB/rCTB-LipL32/1免疫保护作用及野生株LipL32基因表达和患者抗体检测

目的构建LTB—LipL32／1和CTB—LipL32／1融合基因原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫和佐剂活性及保护作用，了解问号钩端螺旋体(简称钩体)野生株LipL32基因携带、表达及钩体病人血清LipL32基因产物抗体产生频率。方法采用常规分子生物学技术构建LTB—LipL32／1和CTB—LipL32／1融合基因及其原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rLTB-LipL32／1及rCTB-LipL32／1表达情况。分别采用Western blot和GM1-ELISA检测rLTB-LipL32／1及rCTB—LipL32／1的免疫反应性和佐剂活性。采用PCR和MAT分别检测97株问号钩体野生株LipL32基因及其表达情况。采用ELISA检测228例钩体病人血清LipL32基因产物的抗体。采用豚鼠保护试验检测重组蛋白的免疫保护作用。结果与报道的相关序列比较，LTB—LipL32／1和CTB-LipL32／1融合基因核苷酸序列相似性分别为99．12％～99．71％和98．54％～99．42％，氨基酸序列相似性分别为97．58％-99．63％和96．77％～99．63％。rLTB-LipL32／1和rCTB—LipL32／1表达产量均约为细菌总蛋白的10％，并主要以包涵体形式存在。rLTB—LipL32／1和rCTB-LipL32／1均分别能与LipL32／1兔抗血清和牛GMI结合。97．9％(95／97)问号钩体野生株含有LipL32基因，95．9％(93／97)问号钩体野生株与rLipL32／1和rLipL32／2兔抗血清的MAT结果阳性。97．4％(222／228)和94．7％(216／228)的病人血清rLipL32／1和rLipL32／2抗体阳性。rLTB-LipL32／1、rCTB-LipL32／1和rLipL32／1豚鼠保护率分别为75．0％、75．0％～87．5％、50．O％～62．5％。结论成功构建了LTB—LipL32／1和CTB—LipL32／1融合基因及其原核表达系统。rLTB-LipL32／1和rCTB-LipL32／1融合蛋白有良好的抗原性和佐剂活性及一定的免疫保护作用，具有成为问号钩体属特异性疫苗的良好前景。LipL32／1是不同问号钩体血清群中广泛存在、序列保守、高频率表达的基因。     

问号钩端螺旋体血清群LipL32基因型分析及其重组蛋白的免疫学鉴定

目的　探讨 15群 15型问号钩端螺旋体 (简称钩体 )中国参考标准株及 2群 2型双曲钩体国际参考标准株是否均存在主要外膜蛋白 (MOMP)基因 (LipL32 ) ,克隆并构建该基因的原核表达系统 ,鉴定表达产物的免疫性。方法　常规酚 氯仿法提取上述钩体株基因组DNA ,高保真PCR扩增全长LipL32基因片段 ,T A克隆后测定核苷酸序列并构建表达系统 ,不同浓度IPTG诱导后用SDS PAGE检测rMOMP表达情况。分别用兔抗TR patocⅠ钩体全菌抗血清、rMOMPs免疫兔血清的Westernblot鉴定其免疫反应性和免疫原性 ,显微镜凝集试验 (MAT)检测rMOMPs免疫兔血清的交叉凝集效价 ,钩体细胞黏附模型检测抗体阻断效果。结果　上述 17株钩体均有LipL32基因 ,但可分LipL32 1和LipL32 2两种基因型。 13个LipL32 1和 4个Li pL32 2基因型之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 95 .12 %～ 96 .6 0 %和 97.79%～ 98.16 %。IPTG诱导后rMOMP1和rMOMP2表达量分别占细菌总蛋白的 4 0 %和 10 %。rMOMP1和rMOMP2均能与兔抗钩体TR patocⅠ血清发生结合反应 ,免疫家兔可对上述 17株钩体产生 1∶2～ 1∶6 4MAT效价的凝集抗体。 1∶2～ 1∶16稀释的兔抗rMOMP1和rMOMP2血清均能有效地阻断钩体的黏附。结论　所有检测的钩体具有LipL32 1或LipL32 2基因。所     

中国主要问号钩端螺旋体血清群外膜蛋白OmpL1的基因型,原核表达系统构建表达及免疫学鉴定

目的 探讨15群15型问号钩端螺旋体(简称钩体)中国参考标准株及2群2型双曲钩体国际参考标准株是否均存在外膜蛋白OmpL1基因，克隆并构建该基因的原核表达系统，鉴定表达产物的免疫性。方法 常规酚．氯仿法提取上述钩体的基因组DNA，高保真PCR扩增全长OmpL1基因片段,T-A克隆后测定核苷酸序列并构建原核表达系统，不同浓度lPTG诱导后用SDS-PAGE检测重组蛋白rOMPLI表达情况。分别用兔抗钩体TR／PatocⅠ抗原、rOMPL1血清的Westernblot鉴定其免疫反应性和免疫原性。分别用显微镜凝集试验(MAT)和钩体细胞黏附模型检测兔抗rOMPLI血清的交叉凝集效价和细胞黏附阻断作用。结果 上述17株钩体均具有OmpL1基因，但至少可分3种基因型：OmpL1/1、OmpL1/2和OmpL1/3。与文献报道比较，所克隆的OmpL1/1、OmpL1/2和OmpL1／3基因核苷酸序列同源性分别为93．87％～94．08％、89．82％～100％和80．89％～81．72％，其氨基酸序列同源性分别为93．13％～98．75％、91．87％～100％和85．63％～88．44％。IPTG诱导后pET32a-OmpL1/1．E．coli／BL21DE3和pET32a-OmpL1/2-E．coliBL21DE3的rOMPL1/1和rOMPL1/2表达量分别占细菌总蛋白的30％和20％。rOMPL1，1和rOMPLl，2均能与兔抗钩体TR／PatocⅠ抗原血清发生免疫结合反应，免疫家兔可获得抗体。兔抗rOMPL1/1和rOMPL1/2血清对上述17株钩体的MAT效价为1：2．1：32，1：2．1：16稀释时均能有效地阻断钩体黏附J744A．1细胞。结论 所检测的钩体均有OmpLl基因，但至少可分为3种不同的基因型。所构建的原核表达系统表达的rOMPL1/1和rOMPL1/2具有良好的免疫原性和免疫反应性。rOMPL1/1和rOMPL1/2具有属特异性、钩体表面的膜蛋白抗原，能诱生交叉凝集抗体，并具有钩体黏附阻断的作用。     

问号钩端螺旋体毒力相关蛋白InvA转录和表达特征的研究

目的 确定我国不同基因种问号钩端螺旋体(简称钩体)参考标准株携带毒力相关基因invA的情况,了解问号钩体赖株感染细胞前后invA基因转录和表达水平的变化.方法 采用PCR检测4个不同基因种问号钩体株及双曲钩体Patoc Ⅰ株invA基因.克隆问号钩体全长invA基因并测序,构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株invA基因原核表达系统.Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组蛋白rlnvA后免疫家兔获得抗血清,免疫双扩散法检测其效价.建立问号钩体赖株感染人胚肾上皮细胞HEK293模型,采用荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测问号钩体赖株感染HEK293细胞前后invA基因的转录和表达水平的变化.结果 4个不同基因种的问号钩体株均含有invA基因,双曲钩体Patoc Ⅰ株则否.4株不同基因种的问号钩体invA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.33%～100%和98.66%～100%.所构建的原核表达系统能有效地表达rInvA.rInvA兔抗血清免疫双扩效价为1:16.问号钩体赖株感染HEK293细胞30 min以后可大量黏附于细胞表面.问号钩体赖株感染HEK293细胞30 min时,invA基因mRNA水平明显上调,45 min时达到峰值,然后逐渐下降.问号钩体赖株感染HEK293细胞后45 min和60 min时可检出InvA蛋白,感染前及感染90 min以后检测结果均为阴性.结论 invA基因是致病性问号钩体所特有的基因.invA基因具有宿主细胞接触式表达及瞬时表达的特点,与问号钩体侵入宿主细胞密切相关.     

问号钩端螺旋体鞘磷脂酶类溶血素基因功能分析及其感染细胞后转录水平变化

目的 了解问号钩端螺旋体(简称钩体)鞘磷脂酶类溶血素基因sph1～sph4产物溶血活性及其感染细胞后转录水平的变化.方法 以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株、波摩那群波摩那型罗株和非致病性双曲钩体三宝垄群Patoc型Patoc Ⅰ株基因组DNA为模板,采用PCR扩增全长sph1～spl4基因片段,扩增产物T-A克隆后测序.构建sph1～sph4基因原核表达系统,采用SDS-PAGE检测目的 重组蛋白rSph1～rSph4的表达情况,Ni-NTA亲和层析柱提纯rSph1～rSpM.采用绵羊血平板对rSph1～rSph4溶血活性进行鉴定,实时荧光定量RT-PCR检测问号钩体赖株感染J774A.1细胞前后sph1～sph4基因转录水平的变化.结果 问号钩体赖株和罗株基因组DNA中均能扩增sph1～sph4基因,双曲钩体Patoc Ⅰ株则否.与报道的相应基因序列比较,所克隆的sph1～sph4基因核苷酸序列相似性均为100%.所构建的原核表达系统能分别表达目的蕈组蛋白rSph1～rSph4.rSph1～rSph4均有溶血活性,其中以rSph2溶血活性最强.问号钩体赖株感染J774A.1细胞后,sph1～sph4基因转录水平均上调,其中sph2和sph4基因mRNA水平上调更为明显.结论 sph1～sph4基因仅存在于致病性问号钩体中,其表达产物有溶血活性.问号钩体赖株感染细胞后sph1～sph4基因转录水平的上调,提示此类鞘磷脂酶类溶血素可能在问号钩体感染宿主过程中有重要作用.     

问号钩端螺旋体铁离子调节蛋白A的免疫原性及保守性研究

目的克隆表达和鉴定问号钩端螺旋体（L．interrogans，简称钩体）黄疸出血群赖型赖株中铁离子调节蛋白A（IRPA），研究IRPA的免疫原性和在不同钩体菌种中的保守性，探讨其在致病和疫苗研究中的意义。方法生物信息学软件分析预测IRPA的特征。构建原核表达质粒pQE31-IRPA，经IPTC诱导后用SDS-PAGE及Western blot鉴定表达情况。用表达的重组蛋白免疫BALB／c小鼠，Western blot检测其免疫原性和在不同血清型钩体中的保守性。ELISA和Western blot检测钩体全菌兔抗血清中的IRPA抗体。结果生物信息学预测结果显示，IRPA是可能位于外膜的脂蛋白，在钩体内有多个蛋白可能与之相互作用。成功克隆表达了重组质粒pQE31-IRPA，重组蛋白能刺激BALB／c小鼠产生抗体（效价为1：32000），并能与相应抗体反应，具有良好的免疫原性。在15株不同血清型的问号钩体及1株双曲钩体（L．biflex）中均可检测到重组蛋白的表达，并在钩体全菌兔抗血清中检测到其抗体。结论IRPA具有良好的免疫原性和保守性，为进一步研究其在钩体病中的作用机制及其作为候选基因疫苗的研究奠定了基础。     

感染人单核细胞THP-1前后钩端螺旋体外膜蛋白抗原表达差异性

目的 了解感染人单核细胞THP-1前后钩端螺旋体(简称钩体)外膜蛋白表达变化,为选择钩体基因工程疫苗候选抗原提供依据.方法 采用Triton X-114法提取感染THP-1细胞前后问号钩体黄疸出血群赖型赖株外膜蛋白.采用双向电泳技术分离钩体外膜蛋白,银染色法检测感染前后钩体外膜蛋白表达量及其差异.感染细胞后4个表达显著上调和4个表达显著下调的钩体蛋白点胰酶水解后,采用LC-MS/MS方法进行鉴定.应用生物信息学软件分析靶蛋白跨膜区和信号肽,采用实时荧光定量RT-PCR检测感染细胞前后靶基因mRNA水平变化.构建靶基因原核表达系统,采用钩体感染豚鼠模型了解重组靶蛋白的免疫保护作用.结果 感染THP-1细胞60 min后,问号钩体赖株外膜蛋白中Loa22、GroEL、F0F1 ATP合成酶α和β亚单位表达水平均显著升高(P＜0.05),FluB2、LigB、OmpA和OmpA家族蛋白表达显著下降(P＜0.05),实时荧光定量RT-PCR检测结果与之基本一致.生物信息学分析结果显示,上述8个外膜蛋白中,OmpA和OmpA家族蛋白为跨膜蛋白,其余均无跨膜结构,Loa22、LigB和OmpA家族蛋白含有信号肽.200 μg重组表达的靶蛋白 rLoa22或rGroEL对豚鼠的免疫保护率均为75.0％.结论 问号钩体赖株感染细胞时外膜蛋白表达谱可发生明显变化.感染后高表达的钩体外膜蛋白尤其是GroEL和Loa22,可作为钩体基因工程疫苗侯选抗原.     

钩端螺旋体毒性蛋白VapC核酸酶活性及其对宿主细胞毒性作用的研究

目的 了解钩端螺旋体毒素-抗毒素系统中毒性蛋白VapC的功能及其对宿主细胞的毒性作用.方法 以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板,采用PCR扩增全长vapB、vapC、vapBC基因并构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rVapB和rVapC 表达情况,Ni-NTA亲和层析柱提纯rVapB和rVapC.检测rVapB和rVapC有无水解问号钩体赖株及THP-1细胞DNA或RNA活性.分别采用实时荧光定量PCR和Western blot试验,检测问号钩体赖株感染THP-1细胞前后vapB和vapC基因转录及表达水平的变化.构建vapB和vapC基因真核表达载体并转染细胞,采用CCK-8试剂检测VapB和VapC蛋白对细胞活性的影响.结果 所克隆的vapB和vapC基因核苷酸及氨基酸序列与文献报道完全相同.所构建的原核表达系统能分别表达rVapB 和rVapC.rVapC可水解RNA,但不水解DNA.问号钩体赖株感染THP-1细胞后,vapB和vapC基因 转录及表达水平均显著上调,部分毒性蛋白VapC外分泌.转染vapC基因的人肾小管上皮细胞HEK293大量死亡.结论 问号钩体赖株VapC蛋白为RNA酶,可在感染宿主细胞过程中外分泌并对细胞有明显毒性.     

钩端螺旋体vwA1和vwA2基因原核表达产物功能的初步研究

目的 构建致病性问号钩端螺旋体(简称钩体)黄疸出血群赖型赖株vwA1和vwA2基因原核表达系统,初步了解目的重组表达产物rVwA1和rVwA2与血小板性出血相关性.方法 采用高保真PCR扩增问号钩体赖株vwA1和vwA2基因并测序,常规方法构建vwA1和vwA2基因原核表达系统.采用SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图像分析系统检查rVwA1和rVwA2表达情况及其可溶性,Ni-NTA亲和层析柱提纯rVwA1和rVwA2.采用实时荧光定量RT-PCR检测问号钩体赖株感染人脐静脉内皮细胞株HUVEC前后vwAl-mRNA和vwA2-mRNA水平变化.采用流式细胞术检测rVwA1与人血小板膜糖蛋白结合能力.采用酶切试验及SDS-PAGE观察人血管性血友病因子裂解酶ADAMTS13水解rVwA2的情况.结果 所克隆的钩体vwA1和vwA2基因与报道的相应基因比较,其核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％.所构建的vwA1和vwA2基因原核表达系统能分别表达可溶性rVwA1和rVwA2.问号钩体赖株感染HUVEC 8 h后,钩体vwAl-mRNA和vwA2-mRNA水平均显著上调(P＜0.05).流式细胞术检测结果显示,钩体rVwA1与人血小板结合率为60.8％.人ADAMTS13可水解重组人vWF-A2( rhvWF-A2),但不能水解钩体rVwA2.结论 vwA1和vwA2基因可能在钩体感染中发挥作用,其中vwA1基因产物功能与钩体病出血密切相关.     

问号钩端螺旋体侵入单核-巨噬细胞方式及其吞噬泡形成差异性研究

目的 探讨问号钩端螺旋体(简称钩体)侵入人或鼠单核-巨噬细胞方式及其吞噬泡形成差异性.方法 采用透射电镜观察问号钩体黄疸出血群赖型赖株侵入小鼠单核-巨噬样细胞J774A.1和佛波酯(PMA)激活的人单核细胞THP-1后吞噬泡形成情况.采用免疫荧光联合激光共聚焦显微镜及荧光分光光度仪等方法,观察细胞内吞抑制剂单丹磺酰尸胺(MDC)、氧化酚砷(PAO)阻断及内吞相关网格蛋白抗体封闭前后,J774A.1细胞和PMA激活的THP-1细胞内问号钩体赖株数量的变化.结果 J774A.1细胞内问号钩体存在于吞噬泡内,THP-1细胞内问号钩体无吞噬泡膜包绕.MDC和PAO能以剂量依赖方式抑制J774A.1和THP-1细胞内吞问号钩体,其中10 μmol/L以上MDC和1 μmol/L以上PAO阻断的J774A.1和THP-1细胞内问号钩体数量明显少于未阻断细胞(P＜0.05).网格蛋白抗体封闭后,J774A.1和THP-1细胞内问号钩体数量也明显减少(P＜0.05).结论 问号钩体以网格蛋白依赖性内吞途径侵入人或鼠单核-巨噬细胞.人或鼠单核-巨噬细胞内问号钩体吞噬泡形成有明显差异,这可能是人或鼠感染问号钩体后发病情况不同的原因之一.     

问号钩端螺旋体MazF蛋白对巨噬细胞的毒性作用分析

目的了解问号钩端螺旋体（简称钩体） MazEF毒素-抗毒素系统中MazF蛋白对巨噬细胞的细胞毒性及其机制。方法采用原核表达系统表达问号钩体赖型赖株MazEF毒素-抗毒素系统中的MazE和MazF蛋白（ rMazE和rMazF ）。采用DNA和RNA降解试验确定rMazF的DNA或RNA酶活性以及rMazE抑制rMazF酶活性的作用。采用实时荧光定量RT-PCT、Western blot 和激光共聚焦显微镜法,分别检测问号钩体赖株感染THP-1单核细胞时mazE和mazF基因转录、表达及分泌情况。采用CCK-8法和流式细胞术检测mazF基因产物对THP-1细胞的细胞毒性及死亡方式。结果 rMazF能水解问号钩体赖株和 THP-1细胞的RNA,但无DNA酶活性, rMazE 能抑制rMazF的RNA酶活性。感染THP-1细胞后,mazE-mRNA和mazF-mRNA及MazE和MazF蛋白表达水平显著升高,但仅有MazF蛋白外分泌。 mazF 基因产物对 THP-1细胞有细胞毒性并引起细胞坏死。结论MazEF毒素-抗毒素系统中具有RNA酶活性的MazF蛋白是问号钩体的毒力因子,可引起感染的巨噬细胞坏死。     

细胞周期及其调控基因对问号钩端螺旋体诱导单核-巨噬细胞凋亡的影响

目的 了解不同细胞周期及其调控基因对问号钩端螺旋体(简称钩体)诱导人或鼠单核-巨噬细胞凋亡的影响.方法 采用细胞周期染色试剂盒及流式细胞仪检测问号钩体黄疸出血群赖型赖株感染前后小鼠单核-巨噬样细胞株J774A.1和人单核细胞株THP-1的细胞周期及其变化.采用细胞周期阻滞剂及流式细胞仪建立细胞周期同步化的J774A.1和THP-1细胞并进行鉴定.采用AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒及流式细胞仪检测问号钩体赖株感染后细胞周期同步化与非同步化J774A.1和THP-1细胞早期凋亡、晚期凋亡/坏死率.采用实时荧光定量RT-PCR检测问号钩体赖株感染前后J774A.1和THP-1细胞的细胞周期及凋亡基因p21、p27、p53、c-myc和cycA mRNAs水平变化.结果 未感染钩体的正常J774A.1和THP-1细胞均分别处于G1、S和G2/M期,感染后均以G1期细胞为主,但S期THP-1细胞有所增加,J774A.1细胞则否(P＜0.05).J774A.1和THP-1细胞可分别被不同细胞周期阻滞剂阻滞在G1、S、G2/M或M期.G1期J774A.1和THP-1细胞感染后均无明显的早期凋亡现象,M期细胞早期凋亡、晚期凋亡/坏死率均明显升高(P＜0.05),G1期THP-1细胞晚期凋亡/坏死率明显升高(P＜0.05),J774A.1细胞则否.J774A.1和THP-1细胞感染后,p21 mR-NA水平均明显高于未感染细胞(P＜0.05),J774A.1细胞c-myc和p27 mRNAs水平、THP-1细胞cycAmRNA水平也高于未感染细胞(P＜0.05).结论 不同细胞周期及其调控基因对问号钩体诱导人或鼠单核-巨噬细胞凋亡有明显影响,但存在细胞种类差异性.