骨组织工程研究中的美学考量

目的：分别以珊瑚羟基磷灰石(CHA)、藻酸钙为成骨细胞载体，观察裸鼠体内的构建特定形态和可注射组织工程骨的可行性。方法：取兔髂骨，获取骨髓基质干细胞，经体外扩增培养诱导后，获得骨髓基质成骨细胞，分别与CHA和藻酸盐复合，植入和注射于裸鼠背部皮下，6、8周后进行大体观察、组织学和X线检查，观察软骨和骨的形成。以单纯CHA和藻酸盐植入作为对照。结果：植入CHA／成骨细胞组和注射藻酸盐/成骨细胞复合物组均有骨样组织形成，具备骨髓腔样结构，而对照组无骨形成。结论：CHA和藻酸盐均是较好的骨组织工程支架材料，复合成骨细胞后可构建特定形态和可注射组织工程骨。     

胶原/羟基磷灰石骨软骨一体化支架的生物学特性研究

[目的]对体外条件下胶原/羟基磷灰石一体化复合材料的生物学特性进行评价,探讨其作为骨软骨组织工程支架的可行性。[方法]以胶原和羟基磷灰石为原料,研制出由胶原逐层过渡到羟基磷灰石为主的一体化支架材料,其软骨层主要成分为胶原,骨层主要成分为羟基磷灰石。通过扫描电镜观察材料内部结构及孔径大小,液体位移法测定材料的孔隙率。将材料与兔骨髓基质细胞复合培养,MTT法测定细胞的生长曲线,扫描电镜观察细胞在材料上的生长粘附情况。[结果]胶原/羟基磷灰石一体化复合支架具有疏松多孔结构,其中软骨层孔径大小(90±15)μm,骨层孔径大小(120±20)μm,孔隙率(75±5.0)%。细胞在材料上生长良好。[结论]胶原/羟基磷灰石一体化复合材料具有适宜的孔隙结构和良好的生物相容性,可用作骨软骨组织工程支架材料。     

兔骨髓间充质干细胞复合两种材料体外生物相容性的比较

[目的]探讨丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶原／骨体外生物相容性，为组织工程寻找理想的载体材料。[方法]体外培养兔骨髓间充质干细胞分别于丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶原／骨体外复合培养，应用扫描电镜、激光共聚焦显微镜，四唑盐比色试验（MTT法），观察材料上复合培养的细胞的生物学特性。[结果]兔骨髓间充质干细胞可以在丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶原／骨良好的黏附、增殖和生长。两种材料相比较其相容性没有明显的差异。[结论]丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶原／骨均具有良好的生物相容性，可以作为组织工程理想的载体材料。     

仿生增强型纳米羟基磷灰石-聚乳酸复合支架研究现状

骨组织工程是修复骨缺损最有前途的方法,寻找理想的支架材料是目前骨组织工程研究的热点之一。近年来采用仿生学原理制备的增强型纳米羟基磷灰石聚乳酸复合支架材料因具有良好的生物相容性和生物降解性而广泛研究。该文就纳米羟基磷灰石-聚乳酸复合支架材料的制备、力学性能及影响因素、与骨髓间充质干细胞复合构建组织工程化骨、与骨形态发生蛋白复合构建活性人工骨的成骨性能研究现状作一简要综述。     

骨组织工程快速成型支架改性的相关研究

目的探讨胶原杂化及磷灰石表面沉积改性后的聚乳酸一羟基乙酸共聚物／β-磷酸三钙（PLGA／β—TCP）作为快速成型支架应用于骨组织工程的可行性。方法使用骨髓基质干细胞对胶原杂化及磷灰石表面沉积改性后的PLGA／β-TCP的生物相容性进行评估，通过扫描电镜观察改性后材料的表面特性及细胞与材料复合的形态学特征；细胞与材料复合后的繁殖与分化能力分别使用细胞计数及碱性磷酸酶定量方法进行评估。结果通过对亲水性、细胞增殖能力及碱性磷酸酶测定证实改性后的PLGA／β-TCP快速成型支架较单纯材料其亲水性及生物相容性有明显提高（P〈0．05）。结论胶原杂化及磷灰石表面沉积改性后的PLGA／β—TCP快速成型支架可作为三维支架应用于骨组织工程。     

类骨磷灰石涂覆改性聚(乙交酯/丙交酯)的细胞亲和性研究

目的 研究具有类骨磷灰石涂层的聚(乙交酯/丙交酯)[Poly(L-lactide-co-glycolide),PLGA]材料作为骨组织工程细胞支架材料的可行性.方法 采用氧等离子体预处理结合模拟体液1.5 SBF0孵育的方法对PLGA进行类骨磷灰石涂覆改性.用鼠OCT-1类成骨细胞作为种子细胞进行体外培养和扩增后分别种植于PLGA致密膜和多孔支架上,观察细胞在致密膜和多孔支架上的黏附率、黏附形态、增殖活力和生长形态.结果 经类骨磷灰石涂覆改性的PLGA,其表面OCT-1类成骨细胞的黏附率和增殖活力都得到了提高,细胞的黏附形态和生长形态良好;在多孔支架上培养的细胞能够迁移到支架的内部旺盛生长.结论 具有类骨磷灰石涂层的PLGA具有更高的细胞亲和性,可望成为一类新的骨组织工程细胞支架材料.     

应用荧光蛋白示踪组织工程骨体外构建的实验研究

目的应用荧光蛋白标记技术对组织工程骨体外构建过程进行细胞示踪。方法采用逆转录病毒pLEGFP-N1对种子细胞进行荧光蛋白标记,以羟基磷灰石为支架材料,体外构建细胞-材料复合体,测定细胞的粘附率。通过倒置荧光显微镜,定期观察种子细胞在支架材料内的分布。结果逆转录病毒载体pLEGFP-N1成功标记人骨髓基质干细胞(BMSCs),并对组织工程骨的体外构建和4周的体外培养进行了良好示踪;标记细胞的粘附率为(90.3±2.1)%,无标记处理细胞的粘附率为(92.0±1.5)%,两组数据差异无显著性意义(P=0.236)。结论采用逆转录病毒介导方式对种子细胞进行荧光蛋白标记后,细胞在材料内仍维持较高的粘附能力,这有利于对体外构建和长期培养组织工程骨时进行种子细胞示踪。     

骨髓基质成骨细胞复合支架材料构建组织工程性肌骨瓣的实验研究

目的探索用羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)的支架材料与成骨细胞复合构成组织工程性肌骨瓣修复骨缺损的能力。方法自2004年12月至2005年5月,于新西兰大耳白兔髂后上棘抽取骨髓基质干细胞并诱导分化为成骨细胞,然后与HA/TCP结合,共培养2周,通过相差显微镜、扫描电镜观察体外细胞生长情况,最后将复合物埋入兔的背阔肌下构成组织工程性肌骨瓣。术后6周进行大体解剖观察,HE染色,研究组织工程性肌骨瓣的生长情况。结果扫描电镜显示支架材料表面和孔隙内均有成骨细胞生长,有良好的增殖活动性和稳定细胞表型,材料中心区未见细胞生长,植入体内6周后取材见内植物有新骨形成,多位于内植物表面,可见成骨细胞、骨细胞、髓腔样结构、板层样骨基质等正常骨组织结构。结论骨髓来源的成骨细胞可用作骨组织工程的种子细胞,此种组织工程性肌骨瓣生长良好,可成功构建组织工程化骨。     

骨髓基质成骨细胞复合支架材料构建组织工程性肌骨瓣的实验研究

目的探索用羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)的支架材料与成骨细胞复合构成组织工程性肌骨瓣修复骨缺损的能力.方法自2004年12月至2005年5月,于新西兰大耳白兔髂后上棘抽取骨髓基质干细胞并诱导分化为成骨细胞,然后与HA/TCP结合,共培养2周,通过相差显微镜、扫描电镜观察体外细胞生长情况,最后将复合物埋入兔的背阔肌下构成组织工程性肌骨瓣.术后6周进行大体解剖观察,HE染色,研究组织工程性肌骨瓣的生长情况.结果扫描电镜显示支架材料表面和孔隙内均有成骨细胞生长,有良好的增殖活动性和稳定细胞表型,材料中心区未见细胞生长,植入体内6周后取材见内植物有新骨形成,多位于内植物表面,可见成骨细胞、骨细胞、髓腔样结构、板层样骨基质等正常骨组织结构.结论骨髓来源的成骨细胞可用作骨组织工程的种子细胞,此种组织工程性肌骨瓣生长良好,可成功构建组织工程化骨.     

仿生复合人工骨材料的组织工程细胞相容性研究

目的　探讨组织工程化人工骨的仿生构建模式及具有不同细胞相容性支架材料的选择。方法　分别采用人工合成材料生物活性玻璃陶瓷 (BGC)与双相羟基磷灰石 (HA/β TCP)为支架材料 ,与聚 DL 乳酸 (PDLLA)复合后 (重量比分别为 65∶1及 50∶1 )再复合I型胶原及重组合人类骨形态发生蛋白 (rhBMP 2 ) ,与兔骨膜成骨细胞 (密度 1× 1 0 6 /ml)复合培养 ,进行一般与超微形态学观察 ,测定生长曲线及成骨细胞碱性磷酸酶 (ALP)、骨钙素和I型胶原合成量的测定 ,比较细胞粘附能力、增殖活力及成骨活性。结果　生物活性玻璃陶瓷、双相羟基磷灰石分别与成骨细胞复合后的粘附能力、增殖活力 (1d组 :0 .380± 0 .0 32 ,0 .2 50± 0 .0 1 9;7d组 :0 .950± 0 .0 60 ,0 .650±0 .0 4 0 )、成骨活性 (3H 脯氨酸掺入活性 :6 .2 2 8± 1 .785 ,3 .81 8± 0 .858;骨钙素含量 :0 .70 9± 0 .1 1 5 ,0 .386± 0 .0 93 ;碱性磷酸酶 :0 .1 2 3± 0 .0 32 ,0 .0 83± 0 .0 1 8) ,前者均优越于后者。结论　该种仿生组织工程化人工骨的构建模式能较满意模拟天然骨优势 ,生物活性玻璃陶瓷、双相羟基磷灰石两种材料的共混体 ,有可能成为骨组织工程较理想的支架材料     

成人骨髓源成骨细胞体内异位成骨的实验研究

目的　观察成人骨髓源成骨细胞与珊瑚羟基磷灰石 (CHA)复合构建的组织工程化骨组织的体内异位成骨能力 ,探讨适宜的组织工程化骨组织的构建方式。　方法　抽取健康成人骨髓 ,采用全骨髓法培养 ,使成人骨髓基质干细胞 (hBMSCs)定向诱导分化为成骨细胞 ,然后种植于CHA上 ,复合培养 5d后植入裸鼠股部肌袋内 ,以未种植细胞的CHA作为对照。术后 4,8,12周取材作一般观察、X线摄片、组织学检查和源于成人的碱性磷酸酶 (ALP)及骨钙素 (OCN)的RT PCR检测。　结果　原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力 ,成骨细胞与CHA复合生长良好。实验组术后 4、8、12周均有新骨形成 ,随着时间延长 ,新骨生成量增多 ;对照组则均无新骨形成。术后 4周实验组RT PCR检测源于人的ALP及OCN表达均为阳性 ,对照组阴性。　结论　成人骨髓源成骨细胞与CHA复合培养后构建的组织工程化骨组织 ,具有良好的异位成骨能力 ,可望应用于临床修复骨缺损。     

人骨髓源性成骨细胞体外培养和生物学特性的研究

目的研究人骨髓源性成骨细胞的生物学特性,为骨组织工程选择理想的种子细胞提供依据。方法采用全骨髓培养法培养骨髓基质干细胞,传代扩增后采用诱导培养基进行诱导,对骨髓基质干细胞诱导成的成骨细胞进行细胞形态学观察,检测碱性磷酸酶活性及分泌钙结节和Ⅰ型胶原的能力。结果骨髓基质干细胞可以进行传代和大量扩增,经诱导培养后能够诱导出成骨细胞,诱导出的成骨细胞具有典型成骨细胞的形态学和生物学特性。结论骨髓源性成骨细胞具有良好的成骨细胞特性,可以作为骨组织工程的种子细胞。     

骨髓基质干细胞成骨-成脂分化及补肾中药对其影响的研究进展

骨髓基质干细胞在不同条件的诱导下，可以分化为成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、神经细胞等多种细胞系，在骨髓微环境中骨和脂肪形成之间的关系是复杂的，成骨细胞与脂肪细胞均来源于骨髓基质干细胞 (MSCs)，并且在其向成骨细胞和脂肪细胞分化之间存在相互逆转的关系和很大程度的可塑性。骨质疏松患者骨量减少与骨髓腔中脂肪组织增加有关，这可能与骨髓中MSCs分化失衡，过多向脂肪细胞分化有关。中医从“肾主骨”、“髓生骨”理论出发，认为肾精不足所致的骨髓空虚是骨质疏松症发病的关键，补肾中药通过影响骨髓基质干细胞成骨-成脂分化，从而防止骨质疏松症的发生。     

骨组织工程细胞支架复合珊瑚羟基磷灰石生物相容性研究

目的研究复合珊瑚羟基磷灰石(CCHA)与成骨细胞的生物相容性。方法将成骨细胞分别和复合骨形态发生蛋白的珊瑚羟基磷灰石(CCHA)、单纯珊瑚羟基磷灰石(CHA)混合培养,检测细胞增殖指数和碱性磷酸酶(ALP)活性。结果CCHA对成骨细胞的ALP活性有明显的促进作用,CHA对ALP活性没有影响。二者对细胞增殖指数均无影响。结论CCHA具有良好的生物相容性和骨诱导作用。     

Hydroxyapatite ceramics as a carrier of gene-transduced bone marrow cells

 The aim of this study was to develop an efficient exogenous gene delivery system using cultured marrow cells and porous hydroxyapatite ceramics. Bone marrow cells were obtained from the femoral shaft of a Fischer 344 rat and cultured in a medium containing 15% fetal bovine serum until confluent. After trypsinization, cells were subcultured at a cell density of 1 × 10⁴ cells/cm² in the presence of fetal bovine serum. The subcultured bone marrow cells were infected with recombinant retroviruses carrying the lacZ gene. The retrovirus infection was performed seven times from day 1 to day 7 during the culturing procedure. Cells expressing the lacZ gene were stained blue with the X-gal staining and represented approximately 80%. Composites of virus-infected bone marrow cells and hydroxyapatite ceramics were implanted at the subcutaneous site of recipient Fischer 344 rats. Four weeks after the implantation the ceramics were harvested. The histological sections of the ceramics showed abundant bone formation in the pores of the ceramics and obviously blue-stained osteoblasts and osteocytes. Other cell types that were stained blue were some fibroblastic cells and endothelial cells in the newly formed capillaries. These findings indicate that osteoblasts and osteocytes in the newly formed bone were derived from the cultured bone marrow cells, and therefore gene transfection by retroviruses did not disturb the bone formation process. Because of the durability of the newly formed bone tissue, creating composites of cultured bone marrow cells and hydroxyapatite ceramics might be an ideal method for exogenous gene transfection. Received: January 30, 2002 / Accepted: July 25, 2002 Offprint requests to: H. Ohgushi     

组织工程化骨修复猕猴长段骨缺损的实验研究

目的 探讨用生物衍生骨材料和骨髓基质干细胞(MSCs)复合后构成的组织工程化骨对异体猕猴长段骨缺损的修复作用。方法 于猕猴胫骨结节抽取MSCs并使诱导分化为成骨样细胞，用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记，培养后与人源生物衍生骨材料体外复合构成组织工程化骨，植入15只异体猕猴修复桡骨2．5cm长段骨缺损作为实验组；用单纯生物衍生骨材料修复对侧同样骨缺损作为对照组；另取2只猕猴双侧桡骨同样部位和大小骨缺损旷置作为空白组。术后1、2、3、6和12周时各处死3只动物取材，空白组12周取材，行大体观察、组织学和免疫组织化学检测。结果 实验组和对照组术后1、2和3周移植物周围组织反应较明显，6周后明显减轻，12周时基本消失。实验组标记成骨样细胞于术后6周仍存在，术后12周基本消失；骨缺损部位骨样组织、软骨、编织骨和板层骨出现时间均较对照组早，且骨愈合时间提前3～6周。实验组骨缺损以多点方式直接成骨，对照组则从两端以“爬行替代”方式成骨。空白组术后12周骨缺损均无愈合。结论 生物衍生骨材料和MSCs复合构建的组织工程化骨异体植入修复猕猴长段骨缺损可超越骨段移植的“爬行替代”过程，使骨缺损能较快愈合。生物衍生骨材料和同种异体MSCs复合组织工程化骨可作为构建骨组织工程的一种较好选择方式。     

人骨髓基质干细胞与表面置换珊瑚羟基磷灰石培养的定向诱导分化

目的观察人骨髓基质干细胞（hMSC）与表面置换的珊瑚羟基磷灰石（SCHA）体外培养的细胞粘附、增殖和分化，寻找理想的骨修复材料。方法海南天然滨珊瑚在特定温度和压力下部分水热反应，制成表面置换的珊瑚羟基磷灰石，将SCHA薄片与人骨髓基质干细胞体外培养，经诱导后于4、8、12、16d分别用荧光显微镜和扫描电镜（SEM）观察细胞活性、粘附和分化过程。结果SCHA保留原有的珊瑚贯穿多孔的三维结构。荧光显微镜可见hMSC在SCHA的表面和孔道内生长良好，第16d达最高水平；电镜显示细胞粘附良好，分化为成骨细胞，分泌大量胶原纤维，可见合成的钙结节。结论hMSC在表面置换的珊瑚羟基磷灰石内粘附、增殖、分化良好，两者具有较好的生物相容性，SCHA是一种良好的骨组织工程支架材料。     

Autogenous cultured bone graft--bone reconstruction using tissue engineering approach.

Maniatopoulos et al. reported the formation of calcified bone-like tissue when rat bone marrow cells were cultured in the presence of dexamethasone and beta-glycerophosphate. We have succeeded to construct the in vitro cultured bone on the porous framework of hydroxyapatite ceramics (HA). After 2 weeks of the culture, the construct showed the existence of mineralized collagen fibers on the surface of HA determined by Scanning Electron Microscopy. The construct also demonstrated high alkaline phosphatase (ALP) activity together with noticeable level of osteocalcin. The results indicate that the construct consisted of thin layer of bone matrix covered hydroxyapatite surface and abundant bone forming active osteoblasts. After the in vivo implantation of the construct, volume of the matrix increased and obvious bone tissue was detected by ordinal microscopy even one-week after implantation and its high osteogenic activity was maintained for a long term (one year). The in vivo bone is biologically active tissue evidenced by Northern blot analysis of the implanted construct which showed ALP and osteocalcin mRNA expression comparable to those of normal cancellous bone. These results demonstrate that the in vitro fabricated cultured bone/HA construct can possess new bone forming capability in in vivo situations. We have also succeeded to fabricate the construct using aged human marrow cells and the construct showed thick lamellar bone formation after the in vivo implantation. Based on these findings, we propose alternative approach for bone reconstruction surgery using the autogenous cultured bone/HA construct. Importantly, we can fabricate the implantable autogenous bone tissue derived from patient's marrow cells and the cells can be obtained by needle aspiration without damaging the patient's normal tissue.