基因测序技术在中药质量研究中的应用(Ⅱ)——山药基原的DNA测序鉴别

目的 :分析正品山药DioscoreapolystachyaTurcz .与地方习用品广山药D .persimilisPrainetBurkill、土山药D .japaonicaThunb .和方山药D .alataL .的核基因组 18SrRNA基因序列 ,为山药基原鉴别及品质评价提供分子依据。方法 :采用PCR直接测序技术测定山药及其地方习用品的 18SrRNA基因核苷酸序列并作序列同源性分析。结果 :山药、广山药和土山药的 18SrRNA序列长度均为 1810bp ,而方山药为 180 7bp。根据排序比较 ,广山药和正品山药的 18SrRNA序列完全相同 ,而与土山药和方山药的序列同源性分别为 99 89%和 97 5 1%。结论 :DNA测序技术可成为山药基原鉴定准确而有效的分子方法     

塞隆骨原动物高原鼢鼠核基因18S rRNA序列测定与分析

目的 :测定仓鼠科动物高原鼢鼠Myospalaxbaileyi的核rDNA基因序列 ,为塞隆骨正品基原检定提供分子依据。方法 :采用PCR直接测序技术测定高原鼢鼠 18SrRNA基因核苷酸序列并作序列特征分析。结果 :高原鼢鼠的 18SrRNA序列长度为 185 1bp。根据排序比较 ,高原鼢鼠与 2种鼠科动物间的DNA序列同源性为 72 .0 4 %～ 72 .18%。结论 :通过基因序列分析 ,DNA测序技术可成为塞隆骨正品基原检定的准确有效手段     

中药半夏的DNA分子与分子鉴别

目的 :分析半夏 [Pinelliaternata(Thunb .)Breit.]的核基因组 18SrRNA基因核苷酸序列 ,以中药半夏正品基原进行分子鉴别。方法 :采用PCR直接测序技术测定半夏及其伪品的 18SrRNA基因序列并作DNA序列变异分析。结果 :半夏和伪品虎掌的 18SrRNA序列长度均为 180 5bp ,两者存在 4个变异位点 ,而且在半夏 18SrRNA序列中有一个限制性内切酶AseⅠ识别位点 ,通过PCR RFLP图谱分析可以区别两者。结论 :通过DNA序列和PCR RFLP图谱差异分析 ,可对半夏正品基原进行准确而有效的分子鉴别     

基因测序技术在中药质量研究中的应用(Ⅰ)——山东郓城猴头半夏基原的DNA测序鉴别

目的 :分析半夏Pinelliaternata(Thunb .)Breit.及其伪品虎掌南星PinelliapedatisectaSchott的核基因组序列 ,为半夏正品基原鉴别提供分子依据。方法 :采用PCR直接测序技术测定半夏及其伪品的18SrRNA基因核苷酸离列并作序列变异和选择性内切酶谱 (PCR SR )分析。结果 :半夏和伪品的 18SrRNA序列长度均为 180 5bp ,根据排序比较 ,半夏原植物与商品药材间的序列完全相同 ,虎掌南星亦如此。而半夏与其伪品虎掌南星间则存在序列差异 (有 4个变异位点 )。在半夏 18SrRNA序列中有一个限制性内切酶AseⅠ识别位点 ,通过PCR SR图谱显示 80 0bp和 90 0bp2个酶切片断 ,而虎掌南星则无此位点 ,PCR SR图谱显示 1个未消化的 180 0bp片断。 结论 :通过核基因组序列和PCR SR图谱差异 ,DNA测序技术可成为半夏正品基原鉴别准确而有效的分子方法     

三七及其伪品的DNA测序鉴别

目的 :分析三七Panaxnotoginseng及其伪品竹节参P .japonicus、蓬莪术Curcumaphaeo caulis、温莪术C .wenyujin、桂莪术C .kwangsiensis的核基因和叶绿体基因序列 ,为三七的正品药材基原鉴定提供分子依据。方法 :采用PCR直接测序技术测定三七及其 4种伪品的 18SrRNA基因和matK基因核苷酸序列并作序列变异分析。结果 :三七和竹节参的 18SrRNA基因序列长度相同 ,均为 180 9bp ;matK基因长度亦相同 ,为 12 5 9bp。蓬莪术、温莪术和桂莪术 18SrRNA基因长度均为 1811bp、matK均为15 4 8bp。根据排序比较 ,三七与 4种伪品间的DNA序列存在很大差别。 结论 :通过序列差异比较分析 ,DNA测序技术可成为三七正品基原鉴定的准确、有效手段     

塞隆骨原动物高原鼢鼠核基因18SrRNA序列测定与分析

目的 :测定仓鼠科动物高原鼢鼠Myospalax baileyi的核rDNA基因序列 ,为塞隆骨正品基原检定提供分子依据。方法 :采用PCR直接测序技术测定高原鼢鼠 18S rRNA基因核苷酸序列并作序列特征分析。结果 :高原鼢鼠的 18Sr RNA序列长度为 1851bp。根据排序比较 ,高原鼢鼠与 2种鼠科动物间的DNA序列同源性为 72.04%～72.18%。结论 :通过基因序列分析 ,DNA测序技术可成为塞隆骨正品基原检定的准确有效手段。     

三七及其伪品的DNA测序鉴别

目的：分析三七Panax natoginseng及其伪品竹节参P．japoricuscus、蓬莪术Curcuma phaeocaulis、温莪术C．wenyujin、桂莪术C．kwangsiensis的核基因和叶绿体基因序列,为三七的正品药材基原鉴定提供分子依据。方法：采用PC8直接测序技术测定三七及其4种伪品的18S rRNA基因和matK基因核苷酸序列并作序列变异分析。结果：三七和竹节参的18S rRNA基因序列长度相同,均为1809bp;matK基因长度亦相同,为1259bp。蓬莪术、温莪术和桂莪术18S rRNA基因长度均为1811bp、marK均为1548bp。根据排序比较,三七与4种伪品间的DNA序列存在很大差别。结论：通过序列差异比较分析,DNA测序技术可成为三七正品基原鉴定的准确、有效手段。     

不同产地山药rDNA ITS区序列的比较

目的分析怀山药与其它产地山药的rDNA ITS区序列的差异,为山药的基源鉴定和品质评价提供分子依据。方法采用PCR扩增纯化后直接测序的方法测定不同产地山药的rDNA基因ITS核苷酸序列并作序列同源性分析。结果8种产地山药的ITS1片段长度均为165bp,ITS2片段长度均为158~160bp,5.8S片段长度为均为159bp。8种不同产地的山药ITS1和ITS2区分别有6个和9个碱基变异。结论利用ITS区序列的差异鉴别不同产区的山药提供了依据。     

五鹤续断18S rRNA基因序列的分析

目的 研究中药五鹤续断叶18S rRNA基因的序列特征,为五鹤续断分子鉴定提供分子依据.方法 采用PCR直接测序技术测定五鹤续断的18S rRNA基因核苷酸序列,并分析其序列组成.结果 通过对五鹤续断Dipsacus asperoides C.Y.cheng et T.M.Ai 叶的18S rRNA基因序列进行测序,获得了五鹤续断18S rRNA基因序列特征.结论 DNA测序技术可作为五鹤续断基原鉴定准确而有效的分子鉴定方法,也可为五鹤续断分子鉴定提供基础性资料.     

位点特异性PCR方法的建立及对近源种鹿茸药材的鉴别研究

目的:针对正品鹿茸与近源种鹿茸药材饮片鉴别的难点,建立一种简便、快速、准确的近源种鹿茸药材分子鉴别方法.方法:根据鹿科鹿属种动物cytb全序列比对分析,设计1对能准确鉴别正品鹿茸(包括梅花鹿和马鹿)和其他近源种鹿茸的引物,在此基础上建立鹿茸药材位点特异性PCR鉴别方法,并对影响PCR结果的主要因素退火温度、Taq用量、循环次数以及模板用量和重复性等进行方法学考察和优化.结果:在方法学考察的基础上,在μL PCR反应体系,退火温度为65℃的条件下,能准确扩增出约323 bp大小的阳性DNA条带,经测序验证结果表明,系正品鹿茸原动物的Cytb基因序列片段,而伪品鹿茸未扩增出条带.结论:所建立的位点特异性PCR方法,能将正品鹿茸与其他近源种鹿茸药材鉴别开来,具有较高的特异性、重复性,可广泛应用于鹿类药材的鉴别.     

中药三七根核糖体18S rRNA基因的序列分析

目的：研究中药三七根核糖体18SrRNA基因的序列特征。方法：根据模式植物拟南芥的18SrRNA的基因序列设计引物,对三七根的18SrRNA基因序列进行基因克隆、测序,并与模式植物拟南芥Arabidopsis thaliana以及人参属植物喜马拉雅人参Panax pseudoginseng Wall subsp.himalaicus var.angustifolius的相应序列进行比较。结果：通过对产于广西靖西的三七Panax pseudoginseng Wall.var.notoginseng(Bukill)Hoo et Tseng根的18SrRNA基因进行克隆测序,获得了三七根的18SrRNA基因的部分序列特征。结论：利用已完成全基因组序列测定的模式植物拟南芥的分子生物学信息来研究中药植物基源的基因组序列,将有助于加快中药植物基源的分子生物学研究进程。     

3种DNA分子标记法联合鉴别草珊瑚及其混伪品

目的采用18 S rRNA基因、ITS2序列、SCAR标记等3种DNA分子标记法鉴别草珊瑚,为其分子鉴定提供依据。方法通过PCR扩增、克隆测序后获得草珊瑚18 S rRNA基因序列,并进行Blast比对;通过PCR扩增、测序并注释后获得草珊瑚ITS2序列,从GenBank上收集混伪品和其他植物的ITS2序列,使用MEGA5.5软件,计算种内种间遗传距离,构建系统聚类树;通过RAPD法获得草珊瑚SCAR分子标记,克隆测序后,设计特异性引物扩增草珊瑚及其混伪品。结果获得的草珊瑚18 S rRNA基因长度为1 820 bp,Blast比对显示草珊瑚与金粟兰科同源性最高,同源性为99%,证明其为草珊瑚的18 S rRNA基因。获得的草珊瑚ITS2序列长度为500 bp,草珊瑚与其混伪品之间的遗传距离为0.190～0.219,混伪品之间的遗传距离为0～0.074,聚类分析显示草珊瑚聚为一支,混伪品聚为一支,与其他植物距离较远。获得草珊瑚的SCAR分子标记,用特异性引物扩增出现草珊瑚特异性产物,混伪品未出现特异性产物。结论 3种分子标记法联合可更有效地鉴别草珊瑚及其混伪品,从而建立一套新的鉴别草珊瑚与混伪品的方法,为其鉴别提供新的思路。     

全蝎DNA条形码分子鉴定研究

目的:本研究通过COI序列对全蝎及其混伪品进行DNA条形码鉴别,为全蝎药材分子鉴定提供科学依据。方法:通过野外采集东亚钳蝎正品,对采集样品形态学鉴定、DNA提取、PCR扩增COI序列,测序建立东亚钳蝎的正品COI数据库,通过比对确定东亚钳蝎正品和伪品的DNA条形码。结果:实验共获取310份东亚钳蝎样本。通过序列分析,确定东亚钳蝎COI序列长度为658 bp。采用MEGA 6.0软件对东亚钳蝎样品及混伪品进行序列比对,构建邻接(NJ)树。结果表明东亚钳蝎COI序列扩增成功,与混伪品COI序列明显区分。结论:本研究运用COI条形码序列可准确鉴定全蝎的基原动物及其混伪品,为后续全蝎药材的分子鉴定提供了新的可行性方法。     

香鳞毛蕨18S rRNA基因片段的克隆与序列分析

目的研究药用植物香鳞毛蕨核糖体18SrRNA基因的序列特征。方法以香鳞毛蕨总RNA为模板,根据蕨类植物18S rRNA保守区域设计引物,对香鳞毛蕨18SrRNA基因进行基因克隆、测序、并进行序列比对和同源性分析。结果克隆获得香鳞毛蕨18S rRNA 1010bp部分片段(Gen Bank登录号GU385474),进行Blast对比发现其与大羽鳞毛蕨的同源性达到99%。结论 DNA测序技术可为香鳞毛蕨的鉴定提供准确而有效的分子鉴定方法,也可为其药用成分相关基因的研究提供基础性资料。     

阳春砂与绿壳砂、海南砂的ITS-1测序鉴别

目的:从分子水平鉴别阳春砂及其伪充品。方法:从阳春砂及其常见伪充品绿壳砂、海南砂中提DNA,以核基因组通用引物ITS-1为引物进行扩增,扩增产物经纯化后,用PCR产物直接测序法进行测序。结果:样品ITS-1序列长度均为248bp,但绿壳砂有7个碱基与阳春砂不同,海南砂有12个碱基与阳春砂不同。结论:1序列可有效地鉴别阳春砂及其伪充品。     

基于荧光测序分型技术的六味地黄丸原料分子鉴别研究

该文选择成药六味地黄丸为研究对象,建立了一种用于中成药原料药材基原鉴定的荧光测序分型技术。首先以原料药材丹皮DNA为模板,筛选最适荧光标记鉴别引物,即通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)分别对5个FAM荧光标记引物psb A-trn H,ITS,trn L-trn F,mat K,rbc L序列进行扩增,并对扩增产物进行测序,所得测序结果使用GeneMarker V1.80进行分析。根据分析结果最终选择psb A-trn H荧光标记引物来鉴别六味地黄丸及其原料药材。结果表明,通过psb A-trn H荧光标记引物扩增分析,可以准确鉴定出六味地黄丸中的丹皮,山药,泽泻3种原料药材。研究结果说明,采用分子荧光测序分型技术鉴定中成药原料具有一定的可行性。     

基于ITS2序列及二级结构对连钱草与其地方习用品及易混品的鉴别研究

目的 利用ITS2(Internal Transcribed Spacer 2)序列及其二级结构对传统中药连钱草与其地方习用品及易混品进行分类鉴定.方法 提取连钱草药材基原植物活血丹基因组DNA,扩增ITS序列并测序;同时从GenBank数据库中下载活血丹等共8个物种42条ITS序列,基于隐马尔可夫模型注释到ITS2序...     

板桥党参基因组DNA提取方法的改进及其18S rRNA基因序列分析

目的:为研究道地药材板桥党参Codonopsis tangshen Oliv.的遗传多样性、种类鉴定等,提取高质量的基因组DNA;探讨板桥党参18S rRNA基因的序列特征,为板桥党参分子鉴定提供分子依据。方法:以板桥党参鲜嫩叶片为材料,采用自行改进的CTAB法提取出基因组DNA;采用PCR直接测序技术测定板桥党参的18S rRNA基因序列,并分析其序列组成。结果:使用改进的CTAB法从鲜叶中提取板桥党参的基因组DNA浓度较高;以其基因组DNA为模板对18S rRNA基因进行PCR克隆并测序,获得了板桥党参18S rRNA基因序列特征。结论:改进的CTAB法提取板桥党参基因组DNA效果较好;DNA测序技术可作为板桥党参基原鉴定准确而有效的分子鉴定方法。     

毛黄堇和石生黄堇的ITS序列差异分析

目的 从分子水平鉴别濒危药用植物毛黄堇和石生黄堇的差异.方法 分别从毛黄堇和石生黄堇的叶片中提取DNA,以核基因组通用引物为引物进行扩增,扩增产物经纯化后对PCR产物采用直接测序法进行测序.结果 获得ITS及5.8 S rDNA完全序列,分别为毛黄堇56l bp、石生黄堇552bp;二者的ITS序列差异呈显著性,其中ITSI差异性达16.28％,ITS2差异性达21.21％.结论 ITS序列可有效地鉴别毛黄堇和石生黄堇,并可广泛应用于中药材的鉴别.     

基于双向位点特异性PCR的金银花真伪鉴别方法研究

目的:筛选获得金银花真伪鉴别SNP位点并建立双向位点特异性PCR方法,用于鉴别金银花和其常见伪品以及两者的混杂品.方法:通过对GenBank收录的忍冬属植物叶绿体trnL-trnF序列进行对比分析,获得金银花真伪鉴别SNP位点;并依据该SNP位点设计特异性引物,对84份金银花基原植物及其市售饮片、伪品进行双向位点特异性PCR扩增,并根据真伪品的特异性条带进行金银花药材鉴别.结果:退火温度为61℃时,正品均出现468 bp的条带,红腺忍冬、华南忍冬、灰毡毛忍冬、黄褐毛忍冬、水忍冬、金银忍冬、郁香忍冬、新疆忍冬、繁果忍冬等9个伪品均出现324 bp的条带,在正品DNA中掺入5％以上伪品时同时出现正品和伪品条带.结论:双向位点特异性PCR可以鉴别金银花真伪品及两者的混杂样品.