人乳腺珠蛋白基因真核表达载体的构建及其表达

[目的]构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础.[方法]利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序分析后,克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM.将重组载体用脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达.[结果]成功扩增hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达.[结论]hMAM基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据.     

hMAM与人HSP70融合基因真核表达载体的构建与表达

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)与人热休克蛋白70(hHSP70)融合基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,经酶切测序分析后,与人HSP70基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建了融合基因真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70。将重组载体电穿孔法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达。结果:成功扩增了人HSP70基因与hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM与人HSP70的融合基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM与人HSP70融合基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

单纯疱疹病毒II型gD糖蛋白在真核细胞中的表达

目的:构建真核表达质粒pcDNA3/gD,并在体外COS-7细胞中进行表达。方法:体外PCR扩增出gD糖蛋白基因,克隆入真核表达质粒pcDNA3中。PCR、酶切和测序证实插入的gD基因正确后,转染COS-7细胞,用原位ELISA鉴定表达蛋白。结果:构建了pcDNA3/gD真核表达质粒,经原位ELISA证实,转染COS-7细胞表达的gD蛋白能和gD单克隆抗体ID3和DL11结合,证明该蛋白具有天然gD蛋白的抗原性。结论:构建的重组真核表达质粒pcDNA3/gD能够在COS-7细胞中表达。     

潜伏活性的人可溶性TNFⅠ型受体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的:采用基因工程技术,将转化生长因子β前体相关蛋白(LAP)通过基质金属蛋白酶(MMP)水解部位与人可溶性TNFⅠ型受体(hsTNFRⅠ)连接,构建pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ融合蛋白真核表达载体,获得LAP-MMP-hsTNFRⅠ融合蛋白。方法:将编码MMP水解部位氨基酸的正反义DNA序列退火形成互补双链后定向克隆插入真核表达载体pcDNA3.1( ),得到pcDNA3.1/MMP重组体;将TGF-β1的LAP段和hsTNFRⅠ与MMP水解部位连接,获得pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ真核表达载体。测序鉴定后,脂质体介导重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR检测融合基因的表达。结果:酶切及测序结果证实pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ重组载体构建成功,转染后RT-PCR结果表明重组质粒在COS-7细胞中得到有效表达。结论:成功构建了融合蛋白真核表达载体pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ,并获得融合基因的瞬时表达,为进一步研究融合蛋白在子宫内膜异位症中的靶向治疗奠定了实验基础。     

人类免疫缺陷病毒I型Tat真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人类免疫缺陷病毒Tat基因真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞中的有效表达。方法以含有HIV-1全长基因的质粒pNL4-3为模板,通过PCR扩增HIV-1 Tat第一外显子,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-tat,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入huh-7细胞。RT-PCR检测其基因转录情况,Western Blot鉴定其是否能够表达相应的目的蛋白质。结果成功扩增了Tat基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1-tat,RT-PCR和Western blot方法证实该质粒能在huh-7真核细胞中有效表达HIV-1 Tat目的蛋白质。结论成功构建了HIV-1 Tat基因的真核表达质粒载体,并在huh-7中表达,为在huh-7细胞模型中研究Tat的功能奠定了基础。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型gD糖蛋白在真核细胞中的表达

目的：构建真核表达质粒pcDNA3／gD，并在体外COS-7细胞中进行表达。方法：体外PCR扩增出gD糖蛋白基因，克隆入真核表达质粒pcDNA3中。PCR、酶切和测序证实插入的gD基因正确后，转染COS-7细胞，用原位ELISA鉴定表达蛋白。结果：构建了pcDNA3／gD真核表达质粒，经原位ELISA证实，转染，COS-7细胞表达的gD蛋白能和gD单克隆抗体ID3和DL11结合，证明该蛋白具有天然gD蛋白的抗原性。结论：柯建的重组真核表达质粒pcDNA3／gD能够在COS-7细胞中表达。     

卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒构建与表达

[目的]构建大鼠源卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒,进行表达。[方法]以卡氏肺孢子虫DNA为模板,应用PCR扩增MSG基因片段,连接至pGEM-T Easy载体,再克隆至PCDNA3.1( )载体。构建的重组表达质粒经酶切、PCR鉴定后转染至COS-7细胞,并进行大量增殖。RT-PCR验证转染基因的表达。[结果]重组表达质粒PCDNA3.1( )/MSG经酶切及PCR鉴定结果表明构建成功。RT-PCR结果显示MSG基因片段成功转染至COS-7细胞,并在其中进行基因表达。[结论]成功构建了PCDNA3.1( )/MSG重组质粒,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究打下基础。     

周期型马来丝虫GAPDH部分编码基因原核及真核表达载体的构建

[目的]构建我国流行的周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶(BmGAPDH)部分编码基因原核和真核表达质粒以及基因序列分析,为进一步的研究奠定基础。[方法]根据GeneBank中马来丝虫GAPDH基因的已知序列设计引物,以周期型马来丝虫总RNA为模板,反转录PCR(RT-PCR)扩增目的编码基因。扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pGEM-T载体,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆,进行双酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性重组质粒pGEM-BmGAPDH,经测序验证,并进行同源性比较。亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcD-NA3.1(+)-BmGAPDH,转染COS-7细胞后进行RT-PCR验证。[结果]RT-PCR扩增出一条约877 bp大小的特异性条带,重组质粒双酶切的PCR结果与预期相符,DNA序列分析与GeneBank已知的基因序列同源性为99%。转染的COS-7细胞高水平表达BmGAPDH的mRNA,根据克隆的目的基因序列推导的氨基酸序列与GenBank登录的一致。[结论]成功构建了周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶部分编码基因原核及真核表达载体,为进一步功能研究提供了条件。     

幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体构建及鉴定

目的构建幽门螺杆菌热休克蛋白GroEL基因的真核表达载体pcDNA3.0-GroEL,为幽门螺杆菌的基因疫苗研制提供参考依据。方法提取幽门螺杆菌基因组DNA,PCR扩增GroEL基因,克隆至pMD19-T载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将GroEL基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-GroEL重组质粒;采用PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-GroEL进行鉴定。结果扩增出幽门螺杆菌GroEL基因片段约1 640 bp;pcDNA3.0-GroEL重组质粒经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,产生1个与GroEL基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-GroEL重组质粒的大片段,表明GroEL基因已成功插入pcDNA3.0质粒中。结论成功构建幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体pcDNA3.0-GroEL。     

结核杆菌含信号肽的Mtb8.4真核表达质粒的构建及在COS-7细胞中的表达

目的：克隆结核杆菌含信号肽的Mtb8．4(MS)基因，导入真核表达载体pcDNA3．1( )，构建成重组质粒pcDNA3．1( )-MS，并在真核细胞中进行表达。方法：提取人结核杆菌H37Rv株的基因组作为模板，进行PCR圹增，获得含信号肽的Mtb8．4(MS)基因后，与pcDNA3．1( )载体进行连接重组，用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定；重组质粒转染COS-7细胞48h后，用RT—PCR方法鉴定MS在转录水平的表达情况。结果：pcDNA3．1( )-MS真核表达载体构建成功；转染COS-7细胞后，MS在转录水平成功表达。结论：pcDNA3．1( )-MS真核表达质粒的构建以及MS在COS-7细胞中的成功表达，为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备结核病pcDNA3．1( )-MSDNA疫苗奠定了基础。     

人乳头瘤病毒11型E7与共刺激分子CD80嵌合DNA疫苗质粒的构建及鉴定

目的:构建人乳头瘤病毒11型(HPV ll)E7与共刺激分子CDS0嵌合DNA疫苗质粒。方法:从尖锐湿疣病变组织中提取DNA制备模板,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增HPV ll-E7基因,经双酶切后定向克隆到pcDNA3.1(+)中,获得pcDNA3.1(+)/HPV llE7,测序鉴定后,再用PCR方法扩增去除终止密码子的E7基因片段,按上述方法插入质粒pcD-NA3.1(+)/CD80中CD80上游,构建pcDNA3.1(+)/HPV llE7-CD80融合基因真核表达质粒。结果:去除终止子的E7基因片段成功正向插入CD80上游,双向测序分析显示序列无误,pcDNA3.1(+)/HPV llE7-CD80嵌合真核表达质粒构建成功。结论:HPV ll-E7/CD80嵌合DNA疫苗质粒构建成功,为研究该疫苗在尖锐湿疣防治中的作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因真核表达载体的构建及鉴定

[目的]构建结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因的真核表达载体pcDNA3-Rv3873，并对其进行鉴定。[方法]利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因，并将其定向克隆至原核载体pGEx-4T-1中，经测序鉴定后，将重组质粒pGEX-4T-1-Rv3873中的目的基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建重组子pcDNA3．1-Rv3873，通过限制性内切酶切酶及PCR进行鉴定。[结果]克隆的Rv3873基因序列与GenBank公布的一致性为100％，限制性内切酶酶切及PCR分析表明Rv3873已成功插入pcDNA3．1（＋）中。[结论]成功构建了Rv3873基因真核表达载体，为进—步研究新型结核杆菌DNA疫苗奠定了基础。     

帕金森病PINK1蛋白真核表达载体pcDNA3．1-myc／PINK1的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的构建帕金森病PINK1基因真核表达载体pcDNA3．1-mye／PINK1,检测其转染COS-7细胞后的表达。方法用PCR方法从人cDNA文库DNA中扩增PINK1全长cDNA,该基因片段两端设计了EcoR I和BamH I限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将PINK1的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3．1-myc—his（-）B上,酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术将所构建的载体导入COS-7细胞中,体外培养,于转染48h后利用RT—PCR和Western Blotting方法检测目的基因的表达情况。主要观察指标：（1）PINK1基因cDNA扩增产物检测。（2）pcDNA3．1-myc／PINK1重组体酶切鉴定。（3）Western—blotting。结果经琼脂糖凝胶电泳及测序证实,PCR获得的片段与GenBank中登记的PINK1序列完全相同;pcDNA3．1-myc／CHIP酶切片段的长度与理论大小相符;转染48h后的COS-7细胞可检测到PINK1蛋白的表达。结论PINK1蛋白真核表达载体构建成功,在COS-7细胞中可获得表达。     

人乳头瘤病毒11型L1 DNA疫苗质粒的构建和鉴定

目的:构建人乳头瘤病毒11型(HPV11)L1DNA疫苗质粒。方法:从尖锐湿疣病变组织中提取DNA制备模板,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增HPV11-L1基因,将L1基因经双酶切后克隆到pcDNA3 1(+)中,测序鉴定。结果:从病变组织中扩增出了全长HPV11-L1基因,并正向插入表达载体pcDNA3 1(+)中,转化JM109扩增后经酶切和测序鉴定,证实克隆成功。结论:HPV11-L1DNA疫苗质粒的构建为今后进行防治尖锐湿疣的动物实验和临床实验奠定了基础。     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组体的构建及其表达鉴定

目的构建含幽门螺杆菌（Hp）Lpp20基因的真核表达重组体,并鉴定其在Hela细胞中能否有效表达,为进一步开展Lpp20核酸疫苗与该蛋白的生物学功能的研究打下基础。方法抽提Hp标准菌株26695基因组DNA,应用聚合酶链式反应（PCR）技术从基因组DNA扩增Lpp20基因,经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pcD-NA3.1（＋）,转入大肠杆菌,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应鉴定;用脂质体法将构建好的重组载体pcDNA3.1（＋）-Lpp20转染Hela细胞,通过免疫细胞化学法及Western印迹法检测其在Hela细胞中表达的Lpp20蛋白。结果成功扩增出长约528 bp的Lpp20基因,测序结果表明扩增出的Lpp20基因与Hp Lpp20序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实Lpp20基因正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,并经免疫细胞化学法和Western印迹法检测到重组体可在Hela细胞中有效表达。结论成功构建了Lpp20基因的Hp真核表达重组体,并检测到其在Hela细胞中可表达出免疫反应性良好的蛋白,为进一步探索其免疫作用及生物学功能奠定了基础。     

pcDNA3．1（＋）／NspA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建pcDNA3.1( )淋病奈瑟菌外膜蛋白—奈瑟菌表面蛋白A(Neisseria surface Protein A,NspA)基因真核表达载体,为研制淋病奈瑟菌核酸疫苗奠定基础。方法根据淋病奈瑟菌NspA基因序列,设计合成一对引物,用PCR方法从淋病奈瑟菌基因组DNA中扩增出NspA基因片段,将扩增的产物连接于测序载体pUCm-T上,并构建重组体pcDNA3.1( )/NspA,进行酶切、PCR及测序鉴定。结果NspA基因体外扩增产物大小约为525 bp。所构建的pcDNA3.1( )/NspA重组体经双酶切及PCR鉴定,与预期片断的大小相符;测序结果与GenBank中收录的NspA全长序列一致,表明pcDNA3.1( )/NspA真核表达载体构建正确。结论成功地构建了淋病奈瑟菌真核重组表达载体pcD-NA3.1( )/NspA,为NspA蛋白的功能研究和淋病奈瑟菌核酸疫苗的研制提供了物质基础。     

结核分支杆菌抗原ESAT-6真核表达质粒在COS-7中的表达

目的 探讨结核分支杆菌早期分泌性抗原靶ESAT—6基因真核表达重组质粒在真核细胞(COS—7)中的表达。方法 用LipofectAMINE^TM2000介导真核表达重组质粒pcDNA3．1( )—ESAT—6转染真核细胞COS—7，72h后，通过RT—PCR和Western Blotting试验鉴定ESAT—6基因在COS—7中的表达。结果 通过RT—PCR从转染了pcDNA3．1( )—ESAT—6的006—7中检测到目的基因mRNA的转录；Western Blotting试验鉴定在转染pcDNA3．1( )—ESAT—6的COS—7的细胞裂解上清液中有ESAT—6基因的表达蛋白。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ES—AT—6真核表达重组质粒能够在真核细胞COS—7中表达ESAT—6蛋白，为进一步研究其特性及为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下了基础。