Ly49A 基因转染的淋巴细胞对H—2^d小鼠正常和肿瘤细胞杀伤活性的实验研究

目的观察Ly49A基因转染的C57BL/6小鼠的淋巴细胞对BALB/c小鼠正常成纤维细胞和4T1乳腺癌细胞杀伤能力的变化与差异。方法构建逆转录病毒表达载体pLXSN-Ly49A,经由PA317包装细胞包装后转染C57BL/6小鼠淋巴细胞。流式细胞仪检测Ly49A受体在转染后淋巴细胞上的表达率。MTT法检测转染后淋巴细胞对BALB/c小鼠正常成纤维细胞和4T1乳腺癌细胞的杀伤活性,以空载体转染和未转染的淋巴细胞作对照。结果Ly49A基因转染的C57BL/6小鼠的淋巴细胞24?h后Ly49A受体表达率为(46.67±0.35)%,空载体转染组为(18.73±0.85)%,未转染对照组为(19.60±0.27)％,其对BALB/c小鼠正常成纤维细胞的杀伤活性明显降低(抑制率22％～25%),对4T1乳腺癌细胞的杀伤活性无明显改变（P＞0.05）。结论转染Ly49A的C57BL/6小鼠淋巴细胞对BALB/c小鼠正常细胞的杀伤作用明显降低,但仍保留了对肿瘤细胞的杀伤活性,为解决异基因骨髓移植后移植物抗宿主病提供了实验依据。     

Ly49A转基因小鼠脾细胞对半相合异基因骨髓移植后GVHD和GVL的作用

目的　观察Ly4 9A基因转染的C5 7BL 6小鼠脾细胞对半相合异基因骨髓移植 (allo BMT)后移植物抗宿主病 (GVHD)和移植物抗白血病效应 (GVL)的影响。方法　经由逆转录病毒介导将Ly4 9A基因转染至C5 7BL 6小鼠的脾细胞 ;流式细胞仪检测Ly4 9A受体在转染后脾细胞上的表达率 ;以亲代C5 7BL 6H 2 b 小鼠为供者 ,以接种EL96 11红白血病细胞的 (BALB c×C5 7BL 6 )F1H 2 d b(CB6F1)小鼠为受者 ,预处理条件为全身照射 (TBI,6 0 Co照射 10 .5Gy) ,进行脾细胞混合骨髓细胞移植 ,建立半相合异基因急性GVHD模型并在该模型基础上观察Ly4 9A基因转染的脾细胞对GVHD和GVL的作用。结果　Ly4 9A基因转染的C5 7BL 6小鼠的脾细胞 2 4h后蛋白表达率为 (42 .2 0± 4 .87) % ,空载体转染组为(18.6 7± 2 4 8) % ,未转染对照组为 (18.73± 3.82 ) % ,在半相合异基因移植中 (C5 7BL 6 H 2b →CB6F1H 2d b) ,未进行移植的单纯照射组生存期为 (7.80± 3.36 )d ;环磷酰胺治疗组生存期为 (2 1.70±2 87)d ;脾细胞混合骨髓细胞移植组生存期为 (2 9.4 0± 6 .4 3)d ;空载体转染的脾细胞混合骨髓细胞移植组生存期为 (2 9.10± 7.39)d ;Ly4 9A转染的脾细胞混合骨髓细胞移植组生存期为 (45 .0 0± 12 .38)d ,较上述各组生存期明显延长 (P     

CD158b基因转染的淋巴细胞对正常和HL-60细胞杀伤活性的实验研究

移植物抗宿主病 (GVHD)是异基因骨髓移植的严重并发症之一。杀伤细胞抑制性受体 (KIR)是目前发现表达于NK、T细胞膜上的一类受体 ,CD15 8分子是KIR家族重要成员 ,主要包括CD15 8a和CD15 8b。当它们与相应的HLA C分子结合后能传导抑制性信号 ,抑制NK、T细胞对靶细胞的杀伤作用[1] 。我们以 3对进行异基因骨髓移植的供、受者为对象 ,通过逆转录病毒的介导 ,将受者淋巴细胞的CD15 8b基因导入供者淋巴细胞 ,观察其对受者淋巴细胞及HL 6 0细胞的杀伤作用是否有影响 ,为解决GVHD提供理论和实验依据。对象和方法1　研究对象白血病患…     

小鼠Ly49家族与异基因骨髓移植

小鼠Ly49家族是主要表达于NK细胞表面的受体家族,按功能分为激活型受体和抑制型受体,其成员配体均属主要组织相容性复合物Ⅰ类分子。受者Ly49抑制型受体与供者主要组织相容性复合物Ⅰ类分子配体的不相合是导致异基因骨髓细胞移植排斥的原因之一,而供者Ly49与其配体不相合在移植物抗宿主病发生中的影响仍存在争议,对移植物抗白血病效应被认为具有增强作用。本文对近年Ly49家族成员尤其是抑制型受体在异基因骨髓移植中的作用及影响的代表性文献予以综述。     

癌性胸水肿瘤浸润淋巴细胞的杀伤细胞活性研究

用生物技术提取癌性胸水中的肿瘤浸润淋巴细胞和相应的肿瘤细胞,经过一定时间诱导培养后,在7,14,21和28d分别检测TIL对自身肿瘤细胞和K562细胞的杀伤活性。结果显示TIL对自身肿瘤细胞和K562细胞的杀伤活性无显著性差异,三周时杀伤活性最强。提示临床可在TIL诱导培养三周时进行临床应用,并可取得最佳疗效。     

细胞因子诱导的杀伤细胞与肿瘤浸润淋巴细胞体外细胞毒活性比较

目的比较用多种细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与癌性胸水中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的细胞毒活性,为临床应用提供依据.方法用不同的细胞因子分别诱导培养CIK和癌性胸水TIL,按常规法计数细胞增殖量,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测其细胞毒活性.结果诱导培养14 d后,CIK细胞毒活性为(76.65±16.78)%,增殖倍数为520±102;TIL细胞毒活性为(55.31±11.02)%,增殖倍数为182±78.结论CIK细胞对K562细胞的细胞毒活性在14 d时达峰值,而TIL细胞在2l d时才达峰值,且CIK细胞毒活性明显高于TIL细胞,增殖细胞数量也比TIL细胞高.CIK可替代TIL细胞进行胸腔注射治疗癌性胸水.     

细胞因子诱导的杀伤细胞与肿瘤浸润淋巴细胞体外细胞毒活性比较

目的比较用多种细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与癌性胸水中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的细胞毒活性,为临床应用提供依据。方法用不同的细胞因子分别诱导培养CIK和癌性胸水TIL,按常规法计数细胞增殖量,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测其细胞毒活性。结果诱导培养14d后,CIK细胞毒活性为(76.65±16.78)%,增殖倍数为520±102;TIL细胞毒活性为(55.31±11.02)%,增殖倍数为182±78。结论CIK细胞对K562细胞的细胞毒活性在14d时达峰值,而TIL细胞在21d时才达峰值,且CIK细胞毒活性明显高于TIL细胞,增殖细胞数量也比TIL细胞高。CIK可替代TIL细胞进行胸腔注射治疗癌性胸水。     

cbl-b基因转导淋巴细胞对人前列腺癌细胞LNCaP杀伤作用的实验研究

目的观察将cbl-b基因导入淋巴细胞能否增强其对人前列腺癌细胞LNCaP的杀伤作用。方法 cbl-b基因淋巴细胞组采用脂质体法将cbl-b基因导入淋巴细胞,在蛋白印记法证实导入基因成功表达后,再用CCK-8法检测其对前列腺癌的杀伤作用,并与正常人外周血中分离淋巴细胞组比较。结果 12h、24h、48h三个时间段,转基因淋巴细胞的杀伤率在10:1、20:1、40:1三种浓度与单纯淋巴细胞比较,杀伤率明显高于单纯淋巴细胞组,差异均有统计学意义(F分别=74.25、1745.90、1637.45,P均<0.05)。其中转cbl-b基因淋巴细胞组在10:1和40:1浓度时24h杀伤率明显高于12h、48h,差异均有统计学意义(t分别=18.37、36.00、17.25、35.21,P均<0.05),但12h、48h的杀伤率比较,差异无统计学意义(t分别=1.26、2.51,P均>0.05)。在20:1时12h杀伤率明显低于24h、48h,差异均有统计学意义(t分别=16.25、19.12,P均<0.05),但24h、48h的杀伤率比较,差异无统计学意义(t=1.06,P>0.05)。且在40:1转染24h杀伤作用最强,可达(44.16±0.67)%。结论转导入cbl-b基因可增强淋巴细胞对人前列腺癌细胞LNCaP的杀伤作用,且杀伤率最强的比例与时间段为40:1、24h。     

反义核酸封闭H-2Kd基因对鼠淋巴因子激活杀伤细胞活性的影响

目的 观察反义寡核苷酸封闭鼠淋巴细胞H-2Kd基因后,对其表达的影响及淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)的活性改变,探讨淋巴细胞Ⅰ类主要组织相容性抗原(MHC-Ⅰ)在肿瘤免疫中的作用。方法 将人工合成的H-2Kd起始区反义寡核苷酸作用于小鼠脾LAK,流式细胞仪检测作用前后H-2Kd的表达率。噻唑蓝法检测H-2Kd表达降低的LAK对肿瘤杀伤活性。结果 反义寡核苷酸(15μmoL/l)组H-2Kd蛋白的表达率由90.1％±4.4％下降至79.8％±2.5％(P<0.01),H-2Kd降低的LAK杀伤活性明显降低,对K562的杀伤活性由82.3％±3.1％降到60.2％±6.7％(P<0.01),对H22细胞株的杀伤活性由67.4％±2.8％降到53.2％±8.1％(P<0.01)。结论 反义寡核苷酸能够抑制小鼠LAK表面H-2Kd的表达,但不影响LAK增殖活性,因而可导致鼠LAK对同种及异种肿瘤细胞的杀伤活性降低。     

聚焦超声激活血卟啉对H-22肿瘤细胞的杀伤作用

目的 研究声动力学疗法（SDT）杀伤肿瘤细胞的最佳声照处理时间点，探讨不同强度的聚焦超声激活血卟啉对H-22肝癌腹水瘤细胞的杀伤作用。方法采用荧光分光光度法测定血卟啉衍生物（HpD）在H-22肿瘤细胞内的富集时间，选择最佳声照处理时间点。采用频率为1．43MHz，强度分别为1W／cm^2、2W／cm^2和3W／cm^2的聚焦超声结合血卟啉作用于H-22肿瘤细胞，于不同时间段取材，通过扫描电镜观察细胞表面的超微结构变化，并与单纯血卟啉或单纯超声处理后的细胞进行比较。结果加入HpD后45min，肿瘤细胞内药物含量最高，作为最佳声照处理时间点。形态学观察显示：单纯血卟啉处理对H-22肿瘤细胞仅有轻微影响；单纯超声处理对细胞有一定的损伤作用，并且细胞受损程度随着超声强度的增大和取材时间的延迟而逐渐加重；超声结合血卟啉对细胞的协同杀伤效应在同等条件下显著高于单纯超声处理的细胞。结论SDT对H-22肿瘤细胞的损伤效应依赖于超声强度以及声敏剂在细胞内的含量，并且表现出一定的时间相关性变化。     

超声波与微泡声学造影剂增强体外培养肿瘤细胞基因转染实验研究

目的观察超声波与微泡声学造影剂能否增强体外培养肿瘤细胞基因转染及其转染效率,初步摸索适宜的超声辐照条件.方法将培养的HepG2细胞分为3组,第1组为单纯造影剂转染组:加入5 μg绿色荧光蛋白质粒(PEGFP-C1)与微泡声学造影剂混合液进行转染;第2组为脂质体转染组:用相同浓度PEGFP-C1质粒进行常规脂质体转染;第3组为造影剂加超声辐照转染组:加入5 μg PEGFP-C1质粒与微泡声学造影剂混合液,然后分别用0.25 W/cm2、0.5 W/cm2、1.0 W/cm2超声波经培养板底部辐照10 s.24 h后用荧光显微镜观察各转染组细胞荧光蛋白表达情况,计录每高倍视野(400×)荧光蛋白表达阳性细胞数.结果单纯造影剂转染组未见荧光蛋白表达阳性细胞,造影剂加超声辐照转染组可见不同程度荧光蛋白表达,其中以0.5 W/cm2超声辐照组表达最强,每高倍视野绿色荧光蛋白表达阳性细胞数为(20.7±3.2)个/HP,高于0.25 W/cm2与1.0 W/cm2超声辐照组[分别为(4.8±1.9)个/HP;(9.9±2.3)个/HP],与脂质体转染组[(22.1±3.5)个/HP]比较无显著差异(P>0.05).结论微泡声学造影剂加一定强度的超声辐照能显著增强体外培养肿瘤细胞的基因转染与表达,超声辐照条件是影响转染率的重要因素,适宜条件时其转染效率与常规脂质体转染方法无显著差异.     

Quantitative variations in the expression of H-2 antigens on murine leukemia virus-induced tumor cells can affect the H-2 restriction patterns of tumor-specific cytolytic T lymphocytes

Comparative quantitative experiments were designed to study the expression of H-2Kd and H-2Dd antigens on three different leukemia cell lines induced by Gross murine leukemia virus (MuLV)in BALB/c (H-2d) mice. The H-2 restriction patterns of syngeneic cytolytic T lymphocytes (CTL) directed against Gross MuLV-induced tumors were correlated with these quantitations of H-2Kd and H-2Dd antigens, Our results obtained by quantitative absorption of monospecific antisera indicated that the three BALB/c tumor cell lines expressed different amounts of H-2Kd and H-2Dd antigens, with H-2Dd antigen showing the greatest variability in expression because it ranged from barely detectable levels to one- eighth the amount of H-2Dd antigen expressed on normal BALB/c spleen cells. The H-2 restriction patterns of Gross MuLV-specific CTL were directly affected by these quantitative modulations in the expression of H-2Kd and H-2Dd antigens, as revealed by three independent approaches: (a) inhibition of CTL activity by monospecific anti-H-2 sera in the absence of complement; (b)competitive inhibition of CTL- mediated cytotoxicity by the addition of excess tumor cells into the reaction mixture; and (c) analysis of CTL specificities using cloned CTL populations. Our results thus indicate that H-2 restriction of tumor-specific CTL activity can be directed at the target cell level by variations in the expression of H-2 antigens.     

病毒灭活血浆对人CIK细胞功能影响的体外实验研究

目的利用CIK细胞(细胞因子诱导的杀伤细胞)来研究亚甲蓝光化学法病毒灭活血浆是否会对免疫细胞产生影响。方法对10名健康献血者外周血单个核细胞分别采用病毒灭活血浆和新鲜冰冻血浆培养人CIK细胞,观察2组培养体系中CIK细胞的扩增情况;用流式细胞仪(FCM)检测CIK细胞CD3+CD56+表达;检测经白藜芦醇终浓度为0.8μmol/L诱导48 h后的CIK细胞穿孔素和颗粒酶B的含量变化;以及用乳酸脱氢酶法测定CIK细胞杀伤SGC-7901细胞活性。结果新鲜冰冻血浆与病毒灭活血浆比较培养5、10、15 d CIK细胞的增殖倍数,分别为17.62±1.88、26.31±1.95、46.05±2.86与18.10±1.73、25.97±1.55、45.82±1.15,CD3+CD56+的表达分别为(12.37±1.38)%、(17.39±2.81)%、(24.3±1.72)%与(11.46±1.35)%、(18.36±1.96)%、(24.08±2.21)%,在促进CIK细胞的增殖以及CD3+CD56+的表达上,2组无统计学意义(P0.05);经白藜芦醇终浓度为0.8μmol/L诱导培养48 h后,新鲜冰冻血浆与病毒灭活血浆培养的CIK细胞穿孔素、颗粒酶B、杀伤活性分别为(37.17±1.95)%、(38.79±1.91)%、(46.05±2.86)%和(32.04±1.92)%、(33.50±1.17)%、(45.82±1.15)%,2组无统计学意义(P0.05)。结论病毒灭活血浆对人CIK细胞的增殖、细胞穿孔素和颗粒酶B含量变化以及体外杀伤功能均无明显影响。     

ALDH2基因导入对K562细胞增殖和抗氧化损伤的影响

目的 克隆人乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因,研究ALDH2基因导入慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞后对其增殖和抗氧化损伤的影响.方法 从肝细胞中克隆人ALDH2基因,构建真核表达载体,用脂质体法将其导入K562细胞中,用RT-PCR和Western blot法检测ALD-H2基因的表达,锥虫蓝拒染法和MTT法检测转基因组细胞的增殖水平及对氧自由基引起的氧化损伤的反应;在此基础上,利用RT-PCR以及荧光分光光度法进一步检测氧自由基诱导后转基因组细胞中血红素加氧酶-1(HO-1)的表达和细胞内活性氧类(ROS)的产生.结果 成功克隆人ALDH2基因并将构建的真核表达载体转染K562细胞,RT-PCR和Western blot法检测到ALDH2的高表达.锥虫蓝拒染法和MTT结果显示转基因组细胞增殖水平明显高于对照组(P＜0.05),经基因修饰的细胞对H2O2耐受性增高,H2O2的IC50值提高了7.8倍(IC50值分别为12.3μnol/L和1.4 μmol/L,P＜0.01).HO-1的表达和ROS的产生随H2O2浓度的增大而增加,而一定浓度H2O2诱导后HO-1的表达和ROS的产生在转基因组中显著低于对照组(P＜0.05).结论 ALDH2基因导人K562细胞后可增加对氧自由基引起的细胞损伤的耐受性,起到保护作用,该过程伴随着ROS水平以及HO-1表达的降低.     

超声微泡介导转染FKBP12.6基因对小鼠H9c2(2-1)心肌细胞结构和功能的影响

目的探讨超声微泡介导转染FKBP12.6基因后小鼠H9c2(2-1)心肌细胞结构和功能的变化。方法将pcDNA3.1-FKBP12.6质粒与白蛋白包裹微泡造影剂混合,经超声转染H9c2(2-1)细胞后,通过倒置显微镜和透射电镜观察心肌细胞生长状况和超微结构的变化;荧光显微镜检测细胞内Ca2 浓度的变化;分别用RT-PCR、免疫组织化学检测mRNA、蛋白的表达。结果超声触发微泡破裂转染的FKBP12.6基因可在心肌细胞高效表达,细胞生长良好,蛋白合成活跃。高表达FKBP12.6的心肌细胞中,总的钙离子浓度增加。结论超声微泡介导FKBP12.6基因转染心肌细胞,可以明显改善心肌细胞的结构和功能。     

突变的人DHFR肿瘤耐药基因转导脐血干细胞的体外实验研究

目的探讨突变的人二氢叶酸还原酶（ｍＤＨＦＲ）耐药基因在人造血干细胞中抗甲氨蝶呤（ＭＴＸ）的效应。方法应用免疫磁珠分选系统（ＭＡＣＳ）分离纯化脐血ＣＤ３４＋细胞后，用含ｍＤＨＦＲ的逆转录病毒上清转染脐血ＣＤ３４＋细胞，采用造血干细胞集落形成实验进行转导后细胞抗ＭＴＸ分析。结果应用ＭＡＣＳ能高度纯化人ＣＤ３４＋细胞，使分选后的脐血ＣＤ３４＋细胞的纯度平均达９０％，回收率为７１．１％。在ＭＴＸ浓度为２０ｎｍｏｌ／Ｌ的条件下培养１４天，转导ｍＤＨＦＲ耐药基因的脐血干细胞集落形成数明显高于对照组（Ｐ＜０．０１），同时对ＭＴＸ的抗性提高了约２倍。结论突变的人ＤＨＦＲ耐药基因能提高人的造血干细胞对化疗药物ＭＴＸ的抗性。