超声和微泡造影剂介导细胞基因转染的实验研究

目的 探讨低频超声对细胞基因转染的作用。方法 超声治疗仪频率1MHz，脉冲重复频率100Hz，占空系数20％。质粒DNA为含编码绿荧光蛋白的pEGFP。应用荧光显微镜和流式细胞仪评价细胞基因转染率，台盼蓝染色计算细胞成活率。选用C2C12、3T3-MDEI和CHO3种细胞系为研究对象，加入DNA后辐照不同声强、时间或加入超声造影剂，观察各条件下的细胞基因转染率和成活率。结果 ①超声介导的基因转染与声强和辐射时间有关，最佳剂量为1w／cm^2 20s；②同样超声剂量，较高的声强较早达到最大基因转染率；③较低剂量时，微泡造影剂可使超声介导的基因转染提高2～3倍并可显著提高最高基因转染率。结论 低频超声可介导细胞基因转染，基因转染率不但与超声辐射剂量有关，而且同样剂量时，高声强较早达到最大基因转染率，最佳剂量是1w／cm^2 20s。同时，微泡造影剂可提高超声介导基因转染的最高转染率。     

一种载基因脂质超声造影剂的制备及特性的实验研究

目的制备一种可作为基因载体的脂质超声造影剂,对其理化性质和兔肾显影效果及载基因的能力进行研究。方法采用机械振荡法制备一种可作为基因载体脂质超声微泡造影剂,观察60Coγ射线灭菌前后造影剂外观、形态、浓度、平均粒径和电位改变,并观察其对正常兔肾显影效果,检测其结合基因的能力。结果自制脂质微泡的平均粒径范围为2.11~6.43μm,平均粒径2.79μm,粒径分布均匀,浓度约为(3.16±0.29)×109/ml;经60Coγ射线灭菌后在显微镜下观察微泡形态,粒径大小无明显变化;体内造影显示该造影剂能够有效增强兔肾实质回声;基因结合量效优化结果显示,造影剂的最大基因结合的效率为22%,最大基因结合量为0.45μg/ml。结论自制脂质超声造影剂符合理想超声造影剂的要求,性质稳定,制备简易,载基因效率高,可望成为一种新型的超声微泡造影剂以及基因或药物治疗的载体。     

穿膜肽与P-选择素抗体修饰的载基因超声造影剂的制备及体外靶向实验研究

目的制备穿膜肽与P-选择素抗体修饰的载基因超声造影剂,并在体外评价其靶向结合能力。方法采用机械振荡法制备载基因及穿膜肽超声造影剂,激光共聚焦显微镜观察质粒DNA和穿膜肽的分布,并用碳二亚胺法制备P-选择素靶向超声造影剂,通过免疫荧光法检测其与抗体的连接情况。制备人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧模型,光镜及流式细胞仪检测该靶向超声造影剂与缺氧HUVEC的结合情况。结果激光共聚焦显微镜可以观察到穿膜肽和质粒DNA均匀地分布在超声造影剂壁上。通过免疫荧光法在荧光显微镜下观察到靶向超声造影剂表面呈红色荧光。体外寻靶实验显示,光镜下靶向组超声造影剂牢固地结合在缺氧HUVEC周围,而非靶向组未见超声造影剂结合;流式细胞仪检测靶向组大约有73.80%的细胞表面结合有该靶向超声造影剂。结论成功制备了穿膜肽与P一选择素抗体修饰的载基因超声造影剂,并具有较强的靶向结合能力。     

一种载基因及多聚赖氨酸的脂质超声微泡造影剂制备的实验研究

目的 制备一种能高效载基因的脂质超声微泡造影剂,评价其物理性质、载基因和体内显影能力.方法 采用层-层吸附(LbL)法将基因和多聚赖氨酸(PLL)分层吸附在自制的脂质超声微泡造影剂上,检测微泡造影剂的形态、分布、浓度、粒径、表面电位、载基因和体内显影能力.结果 载PLL、载PLL+基因及载PLL+基因+PLL的微泡与空白微泡相比,其形态、浓度、粒径没有显著差异;随着载PLL和基因层数增加,其表面电位向正或负反转;载基因超声微泡造影剂其外壳吸附基因的层数增加,载基因量也随之增加;载PLL+基因的微泡可增强兔肝实质显像,持续20 min以上.结论 自制的载基因及PLL脂质超声微泡造影剂制备方法简单,载基因的效率高,可作为携带基因等生物活性物质的载体材料.     

超声造影剂介导PTEN基因影响卵巢癌侵袭的实验研究

目的 研究超声介导造影剂增效PTEN基因在卵巢癌细胞中的转染，探讨该基因抑制肿瘤细胞侵袭的机制。方法分别于接种人卵巢黏液性囊腺癌细胞（SKOV3）的6孔板中每孔加入200μl造影剂和5μl脂质体，以诊断超声剂量辐照60s，细胞转化48h后，采用重组基底膜侵袭模型，观察转染前后SKOV3细胞侵袭力的变化。结果转染PTEN基因可以明显抑制肿瘤细胞的侵袭力。结论PTEN基因可以通过抑制肿瘤细胞侵袭力而抑制卵巢肿瘤的生长；超声介导造影剂增效基因转染，可望成为临床基因治疗的新手段。     

超声微泡造影剂介导pEGFP-N1转染小鼠角膜的实验研究

目的 探讨微泡造影剂声诺维联合超声介导绿色荧光蛋白质粒转染小鼠角膜的转染效率和安全性.方法 小鼠眼前房分别注射生理盐水、质粒+生理盐水、质粒+造影剂、脂质体+质粒等,以50 Hz,2 W/cm2的脉冲波超声辐照质粒+生理盐水和质粒+造影剂眼10 min.术后第1 d、第3 d、第7 d、第14 d和第21 d荧光体视镜观察眼表EGFP表达出现情况,冰冻切片荧光显微镜观察阳性细胞的分布,病理切片观察组织有无损伤.结果 造影剂联合超声辐照组小鼠眼表出现绿色荧光蛋白的弥漫性表达,明显高于单纯超声辐照组和脂质体转染组,其余对照各组眼表均未见绿色荧光.第3 d时的病理切片各组均无异常.结论 声诺维联合超声辐照在体能安全、有效地介导基因转染眼组织.     

超声造影剂SonoVue介导质粒绿色荧光蛋白转染小鼠骨骼肌细胞的实验研究

目的 探讨微泡造影剂SonoVue介导基因转染小鼠骨骼肌细胞的作用。方法 采用质粒绿色荧光蛋白（GFP）作为目的基因，超声结合SonoVue作用于小鼠H2K成肌细胞，照射时间分别为10s、20s、30s、40s、50s、60s，流式细胞仪测定GFP阳性细胞率，台盼蓝染色测定细胞生存率。SonoVue结合或不结合超声作用于小鼠胫前肌，1周后处死小鼠，荧光显微镜测定GFP阳性肌纤维数，HE染色估计肌肉破坏面积。结果 加入SonoVue后，GFP阳性细胞率与细胞生存率总体显著低于阳性对照组；动物实验显示，SonoVue结合或不结合超声均显著增强GFP基因表达水平作用。结论 体外细胞培养SonoVue无增强GFP基因转染的作用，却增加细胞损伤；活体小鼠实验显示SonoVue具有良好的增强骨骼肌细胞基因表达作用。     

超声介导SonoVue增效Survivin基因转染脐血来源树突状细胞的实验研究

目的探讨超声联合微泡造影剂Sono Vue增效脂质体介导的Survivin基因体外转染脐血来源树突状细胞的方法。方法体外培养扩增脐血来源的树突状细胞,在不同强度超声波和不同剂量造影剂Sono Vue作用下,观察脂质体介导的凋亡抑制因子Survivin基因与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的融合重组质粒pEGFP-C1-Survivin在树突状细胞的定向转染。激光共聚焦显微镜定性观察细胞转化情况,流式细胞仪观察树突状细胞的表型变化及定量观察细胞转化效率,台盼蓝染色检测超声作用于细胞的安全性。结果脐血来源的树突状细胞以超声机械指数1.0、作用时间60s基因转染时对细胞比较安全,Sono Vue浓度为10%时达到最佳的基因转染效率。流式细胞仪检测转染前后树突状细胞的表型无明显变化,平均转化阳性率可达(51.4±2.5)%,高于单纯脂质体转染的效率(P<0.05)。结论超声联合微泡造影剂Sono Vue可提高脂质体介导的Survivin基因体外转染树突状细胞的效率,为肿瘤的基因及免疫治疗研究提供了新的思路。     

一种载基因阳离子微泡超声造影剂的制备及特性研究

目的 制备一种新型的阳离子超声造影剂,评价其理化性质,载基因及体内显影能力.方法 采用水浴机械震荡法,加入DC-胆固醇制备一种阳离子脂质微泡;观察其形态、粒径、表面电位等物理特性,并考察平均粒径及浓度在一定条件下随时间变化情况;检测其载基因量,评价其体内显像效果及对细胞的毒性作用. 结果 所制备的阳离子微泡形态规则,稳定性好,马尔文电位仪测得平均表面电位为(29.02±1.30) mV.与普通脂质微泡比较,阳离子微泡载基因量明显增加,最大基因结合量达4 μg/108个微泡,最大基因结合率为39.2％.对细胞无明显毒性,且体内实验阳离子微泡持续增强兔肝脏显影超过15 min.结论 自制的新型阳离子微泡是一种理想的超声造影剂,并能显著增加基因携带量,可望提高超声靶向微泡破坏技术介导的基因转染效率.     

超声声学造影剂介导肝细胞生长因子基因转染的体外实验

目的 研究超声声学造影剂促进肝细胞生长因子(HGF)基因在大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)中的转染效果.方法 将HSC-T6接种在24孔板中,随机分为5组:①空白对照组(C);②单纯质粒组(P);③载基因超声声学造影剂组(M);④质粒+超声组(P+U);⑤载基因超声声学造影剂+超声组(M+U).荧光显微镜及流式细胞仪检测pIRES2-EGFP/HGF在细胞内的表达及转染效率;MTT法检测该方法 对HSC-T6生长活性的影响;Western Blotting检测HGF蛋白的表达.结果 M+U组的绿色荧光强度及转染率均高于其他各组,并对细胞活性无明显影响,且HGF蛋白的表达均高于其他各组(P＜0.05).结论 超声声学造影剂可提高基因在体外培养HSC-T6的转染效率,并对细胞活性无明显影响,为提高非病毒载体的转染效率提供一个新策略.     

超声微气泡介导cy5ODN转染大鼠肾的研究

目的：探讨超声联合脂质体微气泡介导寡核苷酸cy5ODN靶向转染肾的有效性和安全性。方法：健康雄性Wistar大鼠30只，分为对照组、单纯cy5ODN组、造影剂＋cy5ODN组、超声＋cy5ODN组和超声＋造影剂＋cy5ODN组。予以实验刺激后，7d取肾组织检测荧光表达，光镜下观察肾组织病理改变，以评价该方法的副作用。结果：超声＋造影剂＋cy5ODN组cy5ODN基因转染率显著高于其余各组，实验各组均未见到明显肾小球损害。结论：超声联合类脂质体微泡能显著增强基因在肾组织的转染效率，可望为肾疾病的基因治疗提供一种新的安全、有效的转导方法。     

超声微泡介导转染FKBP12.6基因对小鼠H9c2(2-1)心肌细胞结构和功能的影响

目的探讨超声微泡介导转染FKBP12.6基因后小鼠H9c2(2-1)心肌细胞结构和功能的变化。方法将pcDNA3.1-FKBP12.6质粒与白蛋白包裹微泡造影剂混合,经超声转染H9c2(2-1)细胞后,通过倒置显微镜和透射电镜观察心肌细胞生长状况和超微结构的变化;荧光显微镜检测细胞内Ca2 浓度的变化;分别用RT-PCR、免疫组织化学检测mRNA、蛋白的表达。结果超声触发微泡破裂转染的FKBP12.6基因可在心肌细胞高效表达,细胞生长良好,蛋白合成活跃。高表达FKBP12.6的心肌细胞中,总的钙离子浓度增加。结论超声微泡介导FKBP12.6基因转染心肌细胞,可以明显改善心肌细胞的结构和功能。     

超声微泡携基因治疗肝脏疾病应用进展

超声靶向微泡破坏技术通过空化效应有效促进外源基因在目的组织中的转染,可通过抑制细胞某些基因的表达或抑制其信号通路而进行基因治疗,使基因治疗各类肝脏疾病逐渐成为可能。本文主要就超声微泡携基因在肝脏疾病中的应用进展进行综述。     

携带cRGD肽的靶向纳米粒超声造影剂的制备以及体外寻靶实验研究

目的 制备携带精-甘-天冬氨酸（cRGD）肽的聚乳酸/羟基乙酸（PLGA）纳米粒超声造影剂,观察其在体外对大鼠肝星状细胞（HSC）的靶向能力。方法 以PLGA-COOH和全氟新溴烷（PFOB）为原料,采用双步乳化法制备PLGA-PFOB纳米粒,采用光学显微镜、扫描电镜以及透射电镜观察其表面以及内部结构;采用马尔文粒径分析仪测量其粒径大小、分布以及表面电位;通过碳二亚胺法连接cRGD肽制备靶向纳米粒超声造影剂（cRGD-NPs）,用激光共聚焦显微镜以及流式细胞仪检测PLGA-PFOB纳米粒造影剂与cRGD肽的连接情况;在大鼠HSC中验证该造影剂的靶向性能。结果 所得样品为乳白色混悬液,纳米粒大小均匀,粒径分布较窄,平均粒径（255.3±66.8）nm,多分散指数为0.025,Zeta电位为（-16.4±5.1）mV;扫描电镜示纳米粒表面光滑规则、透射电镜示PLGA外壳里包裹液氮氟碳PFOB;共聚焦显微镜观察到连接FITC-cRGD显示为绿色,与显示红色的纳米粒共同融合成橙色,靶向纳米粒超声造影剂大量向大鼠HSC聚集并被其吞噬,红色荧光强度明显多于普通非靶向造影剂。结论 成功制备的携带cRGD肽的纳米粒超声造影剂,在体外实验中对大鼠HSC有较强的特异性亲和力。     

超声造影剂联合超声介导耐药基因反义寡脱氧核苷酸转染肝癌细胞逆转多药耐药效应的研究

目的 探讨超声造影剂联合超声介导mdr1、mrp基因反义寡脱氧核苷酸(ASODN)转染QGY耐药肝癌细胞对多药耐药(MDR)的逆转.方法 分别将mdr1、mrp-ASODN+超声造影剂+超声辐照转染QGY/CDDP肝癌细胞,检测转染后细胞贴壁率、药物敏感性、耐药基因mRNA表达和相应耐药蛋白表达变化.结果 mdr1-ASODN转染后,细胞贴壁率和耐药基因mRNA表达变化大(P＜0.05),细胞药物敏感性和耐药蛋白P-gp、MRP表达变化小(P＞0.05).实验组(2组)作用更大(P＜0.05).mrp ASODN转染后,细胞贴壁率、药物敏感性、耐药基因的mRNA表达和耐药蛋白P-gp、MRP表达均变化明显(P＜0.05),实验组(2组)作用更大(P＜0.05).结论 mdr1、mrp-ASODN+超声造影剂+超声辐照能够低毒部分逆转肝癌细胞MDR,是潜在肿瘤基因治疗方法.     

超声联合阳离子微泡造影剂体外增强基因转染

目的探讨超声介导自制阳离子微泡破坏、增强基因转染的效果,并与普通脂质微泡对比,寻找一种更可靠、完善的基因载体工具。方法采用水浴机械震荡法,加入DC-胆固醇制备阳离子微泡,观察其物理特性并检测其体外载基因能力。将微泡和质粒DNA加入人脐静脉血管内皮细胞后分为6组,观测不同微泡浓度对细胞存活率的影响,应用荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪检测基因转染率,MTT法分析细胞存活率。结果自制阳离子微泡形态规整、分散度好,最大载基因率为39.7%。超声联合阳离子微泡能够增强基因转染,与普通脂质微泡组相比差异有统计学意义;随着微泡浓度增加,细胞损伤增大。结论采用自制阳离子微泡可在体外实现较高效率的基因转染。     

超声微泡造影剂携基因抑制肾间质纤维化的研究进展

随着超声微泡造影剂制备技术的提高,以及对肾间质纤维化分子机制的进一步深入研究,微泡介导基因抑制肾间质纤维化已取得了一定成效,且比其他基因转染方法更为高效和安全。本文就超声微泡携相关基因抗肾间质纤维化的研究进展进行综述。     

低频超声照射SonoVue对绿色荧光蛋白质粒在小鼠肝癌移植瘤中表达的作用

目的 研究物理参数对体内基因转染率的影响,确定最佳剂量-效应关系.方法 建立小鼠(C57BL/6J)肝癌皮下移植瘤模型,经尾静脉注入绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)和SonoVue混合物,给予不同辐照声强(1 W/cm2、2 W/cm2、3 W/cm2)、辐照时间(1 min、5 min、10 min)以及不同剂量SonoVue(30μl、60μl、90μl).流式细胞仪和荧光显微镜检测肿瘤细胞内绿色荧光蛋白表达.结果 pEGFP在肿瘤组织内的表达随辐照时间、辐照声强、造影剂剂量的增加而增多,持续增加辐照时间、声强和造影剂剂量并不能有效增加其转染率,2 W/cm2[(21.02±1.45)%]、5 min(23.22±1.91)%]、60μl SonoVue[(21.02±1.45)%]时,pEGFP在肿瘤组织内的表达达到最大.结论 不同物理参数对体内基因转染率有明显影响,2 W/cm2、5 min、60μl SonoVue的参数条件下,可达到最佳剂量-效应关系.     

比较两种制备载紫杉醇超声微泡的方法

目的 比较能被超声击破的两种载紫杉醇超声微泡的制备方法,并评价其理化性质以及超声散射强度.方法 用单纯紫杉醇法Ⅰ号和三醋酸甘油酯溶解法Ⅱ号分别制备载紫杉醇脂质超声微气泡,测定其包封率、载药量、粒径大小、分布和Zeta电位、pH值,并行超声击破试验及兔VX2皮下肿瘤显像试验. 结果两种微泡显像无明显差异,可被低能量超声击破,但Ⅱ号(加入三醋酸甘油酯)脂质微泡较Ⅰ号(常规冷冻干燥法制备)载药微泡粒径显著减小[(1.07±0.38)μm vs(2.79±0.41)μm,P<0.01],表面电位增高[(19.10±0.32)mV vs (-5.90±0.21)mV,P<0.01],包封率和载药量显著增高[(95.00±1.22)% vs (36.10±4.74)%,P<0.01;(5.60±0.11)% vs (0.50±0.04)%, P<0.01]. 结论 三醋酸甘油酯溶解法制备的Ⅱ号微泡在局部药物释放中具有更大的应用价值.