多重巢式聚合酶链反应在疟疾混合感染检测与分型中的应用

目的:应用能够同时检测恶性疟(P.falciparum)、间日疟(P.vivax)、卵形疟(P.ovale)、三日疟(P.malarie)及其混合感染的多重巢式PCR方法,对疑似疟疾混合感染样本进行检测,评价其在疟原虫混合感染及分型中的应用价值,旨在为疟疾流行病学调查、疟疾混合感染的确诊提供一种快速高效、特异性强、灵敏度高的实验室诊断方法,为传统的镜检法提供有效的补充。方法:根据恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫的18SSU rRNA基因序列设计5对引物(1对通用引物、4对特异性引物),以等比例混合的4种疟原虫核酸为模板,建立疟疾多重巢式PCR检测方法,并应用该法对28份疑似疟疾混合感染样本进行检测及测序验证,将其结果与镜检法比较。结果:28份疑似混合感染样本中混合感染样品数为6例,其中恶性疟和间日疟混合感染样品5例,恶性疟和卵形疟混合感染样品1例。结论:本研究建立的多重巢式PCR检测方法能够同时用于恶性疟、间日疟、卵形疟、三日疟及其混合感染样本的检测,在疟疾混合感染的确诊与分型上较镜检法有明显的优势和更高的应用价值。     

江苏省南通市疟疾诊断参比实验室病例复核结果分析

目的 分析南通市疟疾诊断参比实验室对2014—2021年国家传染病报告系统疟疾病例的实验室镜检复核结果,评价南通市疟疾诊断参比实验室疟疾诊断能力。方法 收集南通市2014—2021年国家传染病报告系统的疟疾病例的血涂片和全血样本,南通市与江苏省血吸虫病防治研究所疟疾诊断参比实验室开展市、省两级实验室复核,以省级疟疾诊断参比实验室镜检和核酸检测（PCR）复核结果一致为标准,比较分析南通市疟疾诊断参比实验室复核结果。结果 2014—2021年,南通市与江苏省两级实验室复核297例病例血涂片和血样。省级镜检和PCR复核结果一致,复核结果定性为292例阳性,5例阴性。南通市镜检复核结果与省级复核结果定性符合率100%(297/297),无错判和漏判;阳性血片虫种符合率96.23%(281/292),恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫符合率分别为99.57%(234/235)、62.50%(5/8)、89.47%(34/38)、72.73%(8/11)。经一致性检验,市、省两级实验室虫种分型Kappa值为0.89;恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫分型Kappa值分别为0...     

聚合酶链反应用于恶性疟疾诊断初步研究

合成一对恶性疟原虫特异引物，用聚合酶链的反应（PCR）技术检测海南岛恶性疟病人滤纸血滴30例，结果28例阳性，在206bp处可见一条清晰易辨的扩增条带，2例阴性经血片复查，其中1例为间日疟原虫；同时检测间日疟病人血滴和未发现原虫的发热病人血滴各16例，均为阴性，与镜检符合率达98．4％（61／62例）。初步表明PCR法具有准确、敏感、特异、简捷等优点，采用滤纸血滴方便现场采样、保存和送检，且易批量检测，在疟疾临床诊断和流行病学调查方面，将可替代血片镜检法，逐步扩大应用。     

应用双重PCR检测海南疟区发热病人的效果

目的 评价双重PCR检测疟区发热病人的效果。方法 对疟区求诊发热病人，手指取血分别制作厚薄血膜片和滤纸血斑作为检测血样。参照献用恶性疟原虫PF1－2和间日疟原虫PV3－5为特异性引物，同在一个反应体系常规进行PCR，扩增片段分别为206bp和431bp。同时镜检厚血膜作对照。结果 该反应体系最低可检出原虫血症为1个恶性疟原虫／μl血和10个间日疟原虫／μl血的感染；检测132例疟区发热病人血样的阳性率为65．1％，而镜检法为64．4％，且有1例漏诊和3例误诊，两法符合率为97％。结论 双重PCR用于疟区发热病人检测，较镜检敏感、特异，适合我国恶性疟与间日疟混合流行区的疟疾诊断，还可用于血检质量的监控。     

BinaxNOW 疟原虫检测试剂卡临床应用效果观察

目的评价美国Inverness medical professional diagnostics公司生产的疟原虫检测试剂卡的临床应用效果。方法以镜检方法作为金标准比较BinaxNOW疟原虫检测试剂卡临床应用效果。结果 400份样本用镜检方法和BinaxNOW疟原虫检测试剂卡诊断,镜检法检出阳性138份,其中恶性疟77份、间日疟61份;疟原虫检测试剂卡检出阳性139例,其中恶性疟71份,间日疟68份。试剂卡检测疟疾的敏感度为98.55%,特异度为98.85%,检测恶性疟的灵敏度为87.01%、特异度为98.76%,检测间日疟的敏感度为93.44%、特异度为96.76%。存在交叉反应。结论BinaxNOW疟原虫检测试剂卡诊断疟疾敏感性与特异性高,操作简单,结果显示直观、快速,适合边远疟区无镜检能力的个体、乡村医生开展疟疾筛查。     

云南省昭通市疟疾的实验室诊断研究

目的通过多种实验室方法综合诊断昭通市疟原虫疑似病例,为疟疾防治提供参考。方法用疟原虫检测试纸条(immune colloidal gold technique,ICGT)先做快速检测,然后按照镜检标准制作厚、薄血涂片,经常规吉氏染色后在油镜下(×1 000)的薄血膜观察疟原虫形态,鉴定虫种。最后针对间日疟原虫(Plasmodium vivax)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)和卵形疟原虫(Plasmodium ovale)4种疟原虫的18s rRNA基因进行巢式PCR扩增。结果 10份县区采集的疑似病例,快速试纸条1532未做,3份可诊断为恶性疟,其它6例皆不能明确诊断;显微镜下4份可明确诊断为恶性疟,其中1201为高密度恶性疟,3份可明确诊断为间日疟,1649县级初次镜检误诊为间日疟,省级镜检确诊为卵形疟,1532县级初次镜检误诊为恶性疟,省级镜检未发现疟原虫;所有病例皆经省级采用巢式PCR扩增,4份确诊为恶性疟,3份确诊为间日疟,1649确诊为卵形疟,1532和A无条带。经快速检测、镜检、巢式PCR,证实昭通市2013年9月以来报告的10例疟疾病例分别为3例间日疟、4例恶性疟、1例卵形疟、2例阴性。结论基层镜检技术不稳定;胶体金法诊断结果不能作为确诊依据,镜检准确性依赖于镜检人员技术水平,剿式PCR法诊断最为准确;疟疾确诊需逐级复核和多种实验室方法综合判断。     

BinaxNOW(R)疟原虫检测试剂卡临床应用效果观察

目的 评价美国Inverness medical professional diagnostics公司生产的疟原虫检测试剂卡的临床应用效果.方法 以镜检方法作为金标准比较BinaxNOV 疟原虫检测试剂卡临床应用效果.结果 400份样本用镜检方法和BinaxNOW 疟原虫检测试剂卡诊断,镜检法检出阳性138份.其中恶性疟77份、间日疟61份;疟原虫检测试剂卡捡出阳性139例,其中恶性疟71份,间日疟68份.试剂卡检测疟疾的敏感度为98.55%,特异度为98.85%,检测恶性疟的灵敏度为87.01%、特异度为98.76%,检测间日疟的敏感度为93.44%、特异度为96.76%.存在交叉反应.结论 BinaxNOW 疟原虫检测试剂卡诊断疟疾敏感性与特异性高,操作简单,结果显示直观、快速,适合边远疟区无镜检能力的个体、乡村医生开展疟疾筛查.     

聚合酶链反应检测间日疟原虫感染的探讨

研究一种适用于流行式人群聚合酶链反应检测间日疟原虫感染的方法。方法：用滤纸片与毛细管两种方法收集血样本，１％Ｔｒｉｏｎｘ－１００裂解，煮沸法处理血样，对全部血样进行ＰＣＲ检测，并与常规镜检作比较。结果２００例血样ＰＣＲ法阳性８．０％高于镜检阳性率３．５％，滤纸血样与毛细管血样ＰＣＲ扩增取得相同的效果。结论ＰＣＲ检测间日疟原虫方法具有快速，敏感，实用性强等优点，有一定的推广应用价值。     

2018-2019年湖北省疟疾镜检结果分析

目的 了解湖北省发热患者疟原虫血涂片制作质量和实验室人员疟原虫镜检能力,为制定和调整本省消除疟疾后监测策略和措施提供科学依据。方法 对2018-2019年湖北省全部网络报告疟疾病例血涂片和从各市(州)疾控中心抽检的疟原虫阴性血涂片进行镜检复核,从血涂片制作、染色、清洁度、镜检结果及虫种符合情况进行综合分析。结果 2018-2019年湖北省共复核疟原虫血涂片2 136张,血涂片制作、染色、清洁度合格率分别为82.77%、81.88%、85.25%,不同地区血涂片质量差异有统计学意义(χ²=157.702、113.984、60.519,P均<0.05)。血涂片质量主要存在的问题是厚血膜脱落、厚薄血膜过大或过小、厚血膜溶血不全和染色过浅。2018-2019年湖北省网络报告病例285例,实验室镜检复核285例样本,疟疾镜检阳性病例258例,总体疟疾镜检阳性率为90.53%(258/285),虫种符合率为89.92%(232/258),恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫镜检虫种符合率分别为93.85%、100.0%、80.00%、50.00%,差异有统计学...     

贵州省首例输入性卵形疟病例的鉴定

目的对1例输入性疟疾病例进行鉴定。方法采集病例外周血制作滤纸血样和血涂片。血涂片染色后镜检,同时进行疟疾快速诊断试剂盒(RDT)检测,滤纸血样进行PCR,PCR扩增片段测序后在GenBank中进行Blast分析。结果 RDT检测提示非恶性疟的疟原虫阳性,血涂片镜检可见卵形疟原虫。PCR扩增出大小为880 bp的卵形疟特异条带,Blast分析显示与卵形疟原虫wallikeri亚种的cox3部分基因序列同源性为99.4%。结论依据RDT、镜检、PCR和序列分析等实验室检测结果,结合其流行病学资料,该例输入性疟疾病例确诊为贵州省首次由境外输入的卵形疟病例,且感染的疟原虫虫种是卵形疟原虫wallikeri亚种。     

环介导等温扩增技术检测间日疟原虫方法的建立及应用分析

目的建立一种快速、简便的检测间日疟原虫的环介导等温扩增方法(LAMP)并与常规PCR方法作比较。方法根据间日疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因序列合成2对特异性LAMP引物,优化Mg2+浓度、dNTPs浓度、BstDNA聚合酶添加量、反应温度、时间以及设计引物缺省试验。评估优化后的LAMP反应的特异性和灵敏性。检测133份患者血样,以显微镜检方法为金标准,比较LAMP和多重PCR法检测间日疟原虫的敏感性和特异性。结果 LAMP法检测重组质粒DNA(Pv-rDNA)的灵敏度达到10-10,为传统PCR方法的100倍。镜检确诊的68例间日疟、43例恶性疟和22例非疟疾患者中,LAMP法和多重PCR检测间日疟原虫的敏感性为98.53%和97.06%,两法基本相当(χ2=0.34,P>0.05);特异性为86.15%和100%,LAMP法低于多重PCR法,差异有统计学意义(χ2=9.67,P<0.05)。LAMP法的阳性预测值和阴性预测值分别为88.16%和98.25%,多重PCR的阳性预测值和阴性预测值分别为100%和97.01%。结论 LAMP法检测间日疟原虫具有快速简便、敏感性高、设备要求低的特点,具有较好的应用前景。     

聚合酶链反应检测疟疾的研究

目的 建立能鉴别诊断恶性疟原虫间和日疟原虫的PCR检测方法。方法 根据红内期疟原虫SSUr-RNA基因序列,设计合成两对引物,采用PCR技术,检测89份门诊“四热”病人血样,并与镜检法进行比较研究。结果 恶性疟原虫血样能扩增出205bp的特异带,间日疟原虫血样能扩增出120bp的特异带,PCR检测的阳性率为74.16%,镜检法为68.54%,PCR法与镜检法的符合率为94.38%。结论 PCR检测的敏感性和特异性均优于镜检法,对于诊断恶性疟原虫和间日疟原虫以及恶性疟原虫的间日疟原虫的混合感染具有一定的应用价值。     

武汉市两种输入性卵形疟巢式PCR检测

目的 了解巢式PCR鉴别卵形疟curtisi及变种wallikeri效果。方法 收集武汉市2008—2015年疟疾患者血样和流行病学资料。提取患者血样中的疟原虫DNA,进行巢式 PCR 检测。结果 采用巢式PCR检测疟疾患者282例,其中恶性疟原虫206例、间日疟原虫62例、三日疟原虫6例、卵形疟原虫19例。巢式PCR结果显示,卵形疟原虫经典型curtisi 和变种型wallikeri 分别扩增出800 bp和780 bp目的 条带。2012—2015年卵形疟占当年疟疾患者分别为4.1%（2/49）、12.2%（9/74）、8.2%（4/49）、11.4%（4/35）,卵形疟总数占全部病例的6.74%,其中,经典型curtisi 14例,变种型wallikeri 3例,混合感染2例,变种型wallikeri检出率占卵形疟26.3%。19例卵形疟病例全部为男性,感染输入地主要分布在撒哈拉沙漠以南地区,2例卵形疟混合感染分别来自安哥拉和尼日利亚。其中有2例卵形疟原虫curtisi型镜检 结果分别为间日疟和恶性疟,1例血片重新复核后为卵形疟,另1例巢式PCR检测为间日疟和卵形疟混合感染型。结论 分子生物学技术可以减少卵形疟误诊的情况;加强卵形疟curtisi及变种wallikeri的巢式PCR 检测,避免误诊。     

用乳酸脱氢酶为靶分子的免疫层析技术检测恶性疟原虫

目的 建立一种免疫胶体金层析(GICA)法用于恶性疟原虫的检测。方法 采用杂交瘤技术制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDHpf)单抗,利用筛选出来的单抗制成诊断恶性疟原虫的免疫层析条,以镜检和PCR法为对照,用GICA条检测门诊"四热"病人血样,评价其敏感性和特异性,并对其稳定性进行了初步研究。结果 筛选出4株抗LDHpf单抗,间接ELISA表明4株单抗仅与恶性疟原虫发生反应,而与间日疟原虫、红细胞蛋白、刚地弓形虫和日本血吸虫不发生交叉反应。Western-blot结果显示4株单抗能识别恶性疟原虫相对分子质量约为33000处的虫源蛋白。以镜检法和PCR法为标准,GICA条检测恶性疟原虫的敏感性分别为88.37%和86.67%,GICA与镜检法的符合率均为91.55%。结论 GICA检测恶性疟原虫简易快速、灵敏度高,无需特殊仪器设备,有望成为一种恶性疟原虫快速免疫诊断试剂盒。     

用乳酸脱氢酶为靶分子的免疫层析技术检测恶性疟原虫

目的建立一种免疫胶体金层析(GICA)法用于恶性疟原虫的检测。方法采用杂交瘤技术制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDHpf)单抗，利用筛选出来的单抗制成诊断恶性疟原虫的免疫层析条，以镜检和PCR法为对照，用GICA条检测门诊“四热”病人血样，评价其敏感性和特异性，并对其稳定性进行了初步研究。结果筛选出4株抗LDHpf单抗．间接ELISA表明4株单抗仅与恶性疟原虫发生反应，而与间日疟原虫、红细胞蛋白、刚地弓形虫和日本血吸虫不发生交叉反应。Western—blot结果显示4株单抗能识别恶性疟原虫相对分子质量约为33000处的虫源蛋白。以镜检法和PCR法为标准，CICA条检测恶性疟原虫的敏感性分别为88.37％和86．67％．DICA与镜检法的符合率均为91．55％。结论GICA检测恶性疟原虫简易快速、灵敏度高，无需特殊仪器设备，有望成为一种恶性疟原虫快速免疫诊断试剂盒。     

应用套式PCR技术检测我国西南部分疟区疟原虫的感染状况

目的　建立鉴别人体四种疟原虫的套式 PCR技术 ,检测我国西南部分疟区疟原虫的感染情况。方法　选用两组疟原虫引物 ,扩增 SSU r DNA特定片段 ,经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色 ,紫外检测凝胶分析仪观察并摄像。结果　采用上述方法扩增出间日疟、恶性疟和三日疟分别为 10 4bp、10 2 bp和 115 bp特异片段。所检测的 138份疟疾患者血样中 ,四川名山县 95份均为间日疟单纯感染 ,筠连县 37份中 10份为与间日疟和 /或恶性疟呈混合感染的三日疟 ,云南金平县的 6份均为合并恶性疟的两种或两种以上疟原虫混合感染。结论　所建立的套式PCR检测系统具有敏感性高、特异性好和稳定可靠等优点 ,在疟疾诊断、虫种鉴别、混合感染的判定、大规模流行病学研究和疫情监控预测等方面具有实际应用价值。     

干血滤纸片试剂盒和水煮法提取间日疟原虫DNA用于PCR检测的比较

目的：比较水煮法和干血滤纸片基因组DNA分离试剂盒提取间日疟原虫DNA用于PCR检测及克隆研究的差异。方法：采集间日疟患者末梢血制备干血滤纸片,分别用水煮法和QIAamp DNAmini kit试剂盒提取间日疟原虫基因组DNA10份。PCR扩增LDH基因,并克隆质粒pGEM-PvLDH。分析比较2种提取方法的差异。结果：水煮法和试剂盒法提取的间日疟原虫gDNA,均扩增出LDH基因特异条带,但试剂盒提取的gDNA目的条带亮于水煮法。结论：水煮法操作简便、快速、经济,在等量血源条件下,所得DNA量较少、纯度较低;试剂盒提取可获得较高的得率,在定量检测和复合扩增时受到的影响因素较少,成功率较高。     

荧光重组酶聚合酶扩增技术快速检测田鼠巴贝虫方法建立及初步评价

目的 建立一类荧光重组酶聚合酶（recombinase polymerase amplification, RPA）扩增的田鼠巴贝虫快速检测方法并对该方法进行评价。方法 选择细胞色素B基因为靶序列,设计3组引物及荧光探针建立田鼠巴贝虫的检测方法并优化引物。设置37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃等6个温度梯度进行反应温度条件优化。将基因组DNA稀释至1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL等7个浓度梯度进行该方法的敏感性评价,采集恶性疟及间日疟患者血液样本进行特异性评价。取445 200、89 040、17 808、3 561.6、712.32、142.46、28.49、5.7、1.14、0.23不同田鼠巴贝虫载量的样本进行虫密度最低检测限实验。选取16例临床发热患者的血液样本进行荧光RPA与巢式PCR检测,评价结果一致性。结果 建立的荧光RPA法可特异扩增出150 bp的田鼠巴贝虫目的片段,最佳反应温度为39℃。该方法针对基因组DNA的检测敏感性最低可达10 fg/μL,不同田鼠巴贝虫密度样本...