人胚胎造血的AGM区基质细胞基因表达谱分析

为了筛选在主动脉-性腺-中肾（AGM）区基质细胞中差异表达的基因，以药物流产的孕30-35天的人胚胎AGM区来源基质细胞为“实验方”，以源自意外而致流产的孕4—5月的水囊引产的胎儿肝组织的基质细胞为“驱动方”，建立了在人AGM区基质细胞中差异表达基因的消减杂交文库。进一步用基因芯片技术对所建立的抑制消减杂交文库进行筛选，并挑选其中明显差异表达的18个克隆进行序列测定和同源性分析。结果表明：在所构建的AGM抑制消减杂交文库中，经过PCR鉴定有特异性扩增带且扩增带分子量在200—700bp的克隆有211个，阳性率高达76.4％。经过基因芯片筛选，挑选出ratio值大于5的克隆共18个进行序列测定显示，在测序的18个明显差异表达的阳性克隆中，4个为未知基因，14个为已知基因，其中这些已知基因分别参与了细胞迁移、分化、生长、细胞周期、信号转导及血管发生等细胞重要生命过程。这些基因大多数在胚胎分化造血发育中的作用尚未见报道。结论 筛选AGM区基质细胞中差异表达的基因为进一步研究胚胎造血发育的分化调控的分子机理提供了重要的理论基础。     

AGM区基质细胞对异基因骨髓移植后造血重建及GVHD的影响

目的探讨AGM区基质细胞对异基因骨髓移植后造血重建及GVHD的影响。方法以7．5Gy60Co γ射线照射的BALB／ C小鼠为骨髓移植模型,将小鼠分为四组,A:正常对照组、B:空白对照组、C:异基因骨髓单个核细胞单纯移植组、 D:异基因AGM区基质细胞和骨髓单个核细胞联合移植组,计数并比较各组小鼠骨髓移植后第4、11、18d的WBC及BMMNC 数目,观察并记录比较C、D两组小鼠的一般情况和存活时间及存活率等各项GVHD指标。结果联合移植组在照射后第 11、18d的白细胞及骨髓单个核细胞计数均高于单纯移植组,至第18d已趋近于正常。且联合移植组GVHD发生时间较晚, 存活率显著高于单纯移植组。结论 AGM区基质细胞不仅能加快造血重建,还能延缓移植后GVHD的发生,降低死亡率, 提高移植成功率。     

人胚胎AGM区基质细胞在体外培养中对脐血CD34+细胞的支持作用

目的探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对脐血CD34+细胞的造血支持作用.方法采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+细胞,接种于底层已制备好的人AGM区基质细胞S1～S5饲养层的24孔板中,同时设无饲养层组及取自同期胚胎的躯干成纤维(hFT)细胞为对照,体外培养28 d,每7 d收获细胞并检测总数,流式细胞术检测CD34+、CD34+CD38细胞含量,并行造血细胞集落培养.结果在未加外源性造血生长因子的条件下,5株人AGM区基质细胞hAGMS1～S5对造血细胞总数、CD34+及CD34+CD38细胞、造血细胞集落均有不同程度的扩增及维持作用,与无饲养层组、hFT细胞组比较差异有统计学意义(P＜0.05).细胞总数在21 d达到峰值[扩增(25.13±4.83)倍],CD34+、CD34+CD38-细胞在扩增14 d达到峰值[(2.68±0.51)倍、(2.38±0.45)倍],高增殖潜能集落形成单位(HPP-CFU)亦在14 d达到峰值[(2.62±0.85)倍].hAGMS1～S5的造血支持作用组间比较差异亦有统计学意义(P＜0.05),其中hAGMS3、S4优于S1、S2及S5.结论人AGM区基质细胞对脐血CD34+细胞具有维持及扩增作用,特别是hAGMS3、S4两株细胞具有更好的维持作用,为胚胎早期造血发生机制和诱导胚胎干细胞造血分化研究提供了重要的模式细胞和基础资料.     

人骨髓基质细胞支持脐血造血细胞扩增后脐血归巢相关特性变化的研究

目的探讨人骨髓基质细胞（HBMSC）联合细胞因子对脐血（CB）单个核细胞（MNC）体外培养后造血细胞归巢相关特性的变化以评价HBMSC及细胞因子支持的体外扩增对脐血归巢相关功能的影响。方法将从新鲜CB标本中分离出的MNC分别接种于已建立的无血清培养体系：A组：对照组；B组：单用HBMSC支持；C组：单用细胞因子支持；D组：细胞因子和HBMSC联合支持。分别在0d（d0）、10d（d10）及14d（d14）用流式细胞仪检测CD34^＋CXCR4细胞、CD34^＋VLA-4^＋细胞的变化情况。结果①在体外培养过程中，各时间点D组CD34^＋CXCR4^＋细胞扩增倍数均高于A、B、C组（P〈0.05）；②B、C和D组与A组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论HBMSC联合外源性细胞因子对脐血MNC进行体外培养，能有效扩增具归巢能力的造血干祖细胞数目。     

人脐血源基质细胞与骨髓基质细胞对造血功能损伤修复作用的比较研究

目的比较人脐血源基质细胞(hUCBDSCs)与骨髓基质细胞(hBMSCs)对造血功能损伤的修复作用。方法取63只BALB/c小鼠均给予6.0 Gy60Co射线全身照射,随机分为hUCBDSCs组(n=21)、hBMSCs组(n=21)和对照组(生理盐水组)(n=21),分别于移植后1、3、5、7、10、14、21 d检测1次外周血细胞,于照射后7和21 d分别制备股骨骨髓涂片观察骨髓细胞形态学改变,收集小鼠骨髓细胞并作集落培养。结果 3组小鼠移植后白细胞、血小板、红细胞在3～5 d降至最低,hUCBDSCs组白细胞和血小板均从7 d开始回升,10 d后回升速度与程度提高,21 d时回升接近未照射水平,hBMSCs组从7 d开始回升,回升趋势与hUCBDSCs组相似,21 d后回升程度低于未照射水平,对照组从7 d后开始回升,回升较慢,21 d回升程度低于实验组(P<0.05);hUCBDSCs组,hBMSCs组及对照组红细胞均在3 d时降至最低,21 d后恢复,但实验组较对照组回升更快,(P<0.05),hUCBDSCs组与hBM-SCs无甚差异(P>0.05)。集落培养CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-GMEM,hUCBDSCs组21 d为(113±6)、(167±6)、(131±6)、(14±4)个,hBMSCs组(46±6)、(141±11)、(118±18)、(10±1)个,对照组为(87±3)、(122±4)、(84±7)、(5±1)个(P<0.05)。hUCBDSCs组所有小鼠均存活。结论 hUCBDSCs较hBMSCs修复造血功能损伤和血小板恢复的作用更佳,hUCBDSCs移植是1种安全有效的促进造血损伤修复的方法。     

人脐血基质细胞的体外培养及向成骨细胞诱导分化

背景:研究证实婴儿脐带血里含有类似骨髓间充质细胞的细胞,但在培养过程中其成功率很低且难度高.目的:拟在体外分离培养人脐血基质细胞,并观察其分化潜能.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-03/2008-06在辽宁医学院中心实验室完成.材料:健康足月新生儿脐带血12份,每份30～60 mL,由锦州市妇婴医院提供.方法:取采集的脐带血,使用淋巴细胞分离液离心后取界面上的白色混浊状细胞层,加入含体积分数为10%胎牛血清、20 μ g/L碱性成纤维细胞生长因子、0.3 g/L L-谷胺酰胺、100 U/mL青霉素和100 g/L链霉素的L-DMEM培养液悬浮细胞,按2×109L-1密度接种于25cm2培养瓶中,待细胞达70%汇合时消化传代.取处于对数生长期的脐血基质细胞,将其培养基更换为含有地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基成骨诱导21～30 d.主要观察指标:倒置显微镜观察细胞形态学特征,描绘生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,碱性磷酸酶染色和Von-Kossa染色检测成骨能力.结果:原代培养的人脐血基质细胞呈长梭形,需21～30 d长满瓶底,传代后细胞增殖缓慢并逐渐死亡,细胞平均倍增时间为42 h,处于G0/G1期的细胞达(86.54±2.31)%.在成骨诱导培养基里,脐血基质细胞增殖速度减慢,细胞形态无明显变化,成骨诱导14 d后碱性磷酸酶阳性率为(46.0±2.1)%,成骨诱导21 d形成钙化结节.结论:应用体积分数为10%胎牛血清、20 μ g/L碱性成纤维细胞生长因子的L-DMEM培养液可在体外成功分离培养出入脐血基质细胞,但细胞增殖能力有限,诱导后可向成骨细胞方向分化.     

不同培养体系培养人脐血源基质细胞的探索性研究

目的 探索不同培养体系对人脐血源基质细胞原代培养的影响，并观察人脐血源基质细胞的生物学特性。方法 取产科胎儿脐带血，采用经典和改良Dexter培养体系培养人脐血源基质细胞。倒置显微镜动态观察细胞生长情况，瑞氏染色观察细胞形态特征，采用细胞化学和免疫细胞化学进行鉴定。结果 改良Dexter培养体系在48 h细胞贴壁数、细胞开始伸展时间及原代培养时间明显优于经典Dexter培养体系。原代培养9-14天(平均12.1天)时贴壁细胞集落开始形成，15-21天(平均19.4天)时集落数量最多，培养28天贴壁细胞铺满培养皿底，细胞类型以成纤维样细胞、巨噬样细胞、“小圆”类细胞为主。细胞化学染色显示：非特异性酯酶染色法(NSE)显示阳性，阳性率100％；过氧化物酶染色法(POX)显示阴性；糖原染色(PAS)显示阳性，阳性率为100％；碱性磷酸酶(ALP)染色显示部分阳性，阳性率26％。免疫细胞化学染色显示：CD31显示阳性率为96％，CD68显示阳性率为95％，CD45阴性，Fn显示阳性率94％。结论 改良Dexter培养体系是一种理想人脐血源基质细胞培养体系，人脐血源基质细胞在体外的成功培养为从一新的角度进一步研究其在临床的早日应用提供理论基础。     

转基因骨髓基质细胞对人脐血CD34+细胞体外扩增作用的研究

为探讨转染FL基因的人原代骨髓基质细胞对脐血CD34+ 细胞的体外扩增效应 ,建立了转基因骨髓基质细胞与人脐血CD34+ 细胞共培养体系。采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+ 细胞 ,在不同的体外培养体系中进行培养并取样检测细胞总数 ,CFC和CD34+ 细胞百分率。结果表明 ,在不同组合的培养体系中 ,转基因骨髓基质细胞培养体系较骨髓基质细胞培养体系和无滋养层培养体系对有核细胞总数 ,CFC含量和CD34+ 细胞含量均具有明显的扩增作用 ,分别扩增了 12 2 .5± 4 .3,39.6± 2 .7和 11.8± 0 5 2倍 (P <0 .0 5 )。结论 :转染FL基因的人骨髓基质细胞协同其它细胞因子可增强对人脐血CD34+ 细胞的体外扩增作用。     

BMP-4在人AGM区基质细胞的表达

本研究旨在观察BMP-4在人胚胎主动脉-性腺-中肾（AGM）区基质细胞的表达,为建立含AGM区基质细胞的诱导胚胎干细胞造血分化培养体系提供理论和实验依据。体外传代培养人胚胎AGM区基质细胞（hAGM S1-S5）及取自同期胚胎的躯干成纤维细胞（hFT）,采用RT-PCR方法在mRNA水平分析BMP-4在hAGM S1-S5的表达情况,并应用ELISA方法测定BMP-4在hAGM S1-S5细胞培养上清液中的分泌水平,同时以hFT细胞作为对照。结果表明：体外培养中的hAGM S1-S5细胞形态学表现主要为成纤维间质细胞样,少量呈内皮样,是早期胚胎AGM区来源的异质细胞群。hAGM S1-S5细胞均表达BMP-4 mRNA,hFT不表达BMP-4 mRNA。hAGM S1-S5细胞培养上清液中可测得分泌的BMP-4,其分泌水平（pg/ml）分别为55.98±11.20、61.16±9.39、76.26±11.31、86.38±18.34、85.39±21.22,与hFT对照组（16.76±7.04pg/ml）相比有显著性差异（p〈0.05）,hAGM S1-S5组间比较BMP-4水平无显著性差异（p〉0.05）。结论：体外培养中的人AGM区基质细胞表达BMP-4,与AGM区基质细胞支持造血干细胞原始发生的功能相关。     

骨髓基质细胞对多细胞因子介导人脐血单个核细胞体外扩增的影响

背景:体外扩增脐血造血细胞的目的是促进脐血造血细胞的植入能力,细胞因子介导的脐血造血细胞能使细胞数有效扩增,但同时也耗竭了具有分化潜能的造血干细胞.目的:观察骨髓基质细胞对多细胞因子组合介导人脐血单个核细胞体外扩增及扩增后黏附分子和CXCR4表达的影响.方法:将分离的人脐血单个核细胞接种在预先建立的人骨髓基质细胞层上,分组培养:对照组仅含有脐血单个核细胞;多种细胞因子+脐血单个核细胞组;骨髓基质细胞+脐血单个核细胞组;骨髓基质细胞+多种细胞因子+脐血单个核细胞组.培养0,7 d检测有核细胞数, CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数.结果与结论:单纯骨髓基质细胞和单用细胞因子组均可有效地扩增脐血造血细胞,并提高造血细胞上CD49d,CD62L及 CXCR4表达.而单用细胞因子组促进脐血造血细胞扩增能力较单纯骨髓基质细胞强,提高造血细胞CD49d,CD62L及 CXCR4表达能力较单纯骨髓基质细胞差.提示骨髓基质细胞虽可支持脐血造血细胞扩增,但难以实现造血细胞的大量扩增,但在骨髓基质细胞层的支持下,多细胞因子可有效地促进脐血造血细胞的扩增,并优于单用细胞因子及骨髓基质细胞,证实骨髓基质细胞可协同多细胞因子有效地促进脐血单个核细胞的扩增,促进造血干细胞的黏附和趋化能力.     

人脐血贴壁细胞生物学特点的观察

为了探讨人脐血贴壁细胞分离培养的可行性，分离人脐血CD34^ 细胞进行Dexter培养，观察贴壁细胞的生物学特点结果表明：Dexter培养9—14天(平均112天)时贴壁细胞集落开始形成。1522天(平均19．6天)时集落数量最多，培养28天贴壁细胞铺满培养皿底。细胞类型以成纤维样细胞、巨噬样细胞、“小圆”类细胞为主。细胞化学染色显示：非特异性酯酶染色(NSE)、糖原染色(PAS)100％为阳性，过氧化物酶染色(POX)为阴性，碱性磷酸酶(ALP)28％为阳性。免疫组织化学染色显示：CD106阳性达96％，CD29阳性为93％。CD44阳性为98％，CD45为阴性，CD50％阳性为62％。纤维粘连蛋白(Fn)：92％阳性；层粘连蛋白(Ln)：74％阳性；胶原Ⅳ：83％阳性。结论：人脐血CD34^ 细胞群中存在造血基质细胞的前体细胞，人脐血贴壁细胞具有造血基质细胞的某些生物学特点。     

过氧化氢酶在人脐带间充质干细胞中作用的研究

本研究通过携带过氧化氢酶(catalase,CAT)基因的逆转录病毒载体转染人脐带组织源间充质干细胞(UC-MSC),探讨CAT对人UC-MSC增殖以及多向分化潜能的影响。将携带绿色荧光蛋白(GFP)空载体质粒pMSCV-GFP和携带CAT基因的pMSCV-GFP-CAT逆转录病毒载体分别转染体外培养的人UC-MSC,用流式细胞仪分析并分选获得MSC-GFP、MSC-GFP-CAT两种细胞株;用过氧化氢酶检测试剂盒检测上述细胞株和UC-MSC中过氧化氢酶活力;用cell counting kit-8检测转染后细胞的增殖能力;用von Kossa和油红O染色观察成骨和成脂定向诱导分化。结果表明:转染48小时后即可观察到UC-MSC发出绿色荧光,3天后达到稳定状态,随着细胞的传代荧光强度不会减弱。流式细胞仪检测GFP+转染率显示,MSC-GFP为(25.54±8.65)%,MSC-GFP-CAT为(35.4±18.57)%;体外传代培养后检测UC-MSC、MSC-GFP、MSC-GFP-CAT细胞CAT活性分别为:19.5、20.3、67.2U;MSC-GFP-CAT能被诱导分化为成骨和脂肪细胞;携带CAT基因载体转染对UC-MSC的增殖无显著影响(p0.05)。结论:成功获得高表达CAT的UC-MSC,其CAT的表达水平为对照组的3.4倍,转染对UC-MSC的增殖和分化能力无显著影响,基因转移使UC-MSC保留了成骨和成脂的能力。     

人脐血树突状细胞体外无血清培养

树突状细胞(dendritic cell,DC)作为体内功能最强的抗原递呈细胞,已试用于肿瘤的免疫治疗,但多数实验室培养DC的体系中包含血清,使其临床应用受到限制。本研究以人脐血为来源,建立了无血清培养DC体系,以期将来用于临床。首先,用rhGM-CSF加rhTNF-α,进行有血清液体悬浮培养,14天后,从(1±0.5)×10~4/ml CD34~ 细胞或(5±2)×10~5/ml单个核细胞中,总细胞数扩增5倍,DC分别占(25±5)％和(17±5)％。第二,以无血清培养基代替有血清培养基,培养21天,(2±1)×10~6/ml单个核细胞没有数量的扩增,DC占(7±2)％。最后,对上述培养体系,在第5天(有血清培养基)或第12天(无血清培养基)后加入rhIL-4,DC产率及细胞总数均未增加。本研究结论:①根据液体悬浮培养中观察到粒、巨噬细胞和DC的混合集落及DC小丛,证实DC与粒、巨噬细胞有共同祖先,均来源于CD34~ 造血干/祖细胞;②脐血单个核细胞虽较CD34~ 细胞产生DC的比率稍低,但分离方便,花费少;③无血清体系的培养效果不如有血清体系,培养所需时间也长,细胞产率也低,有待进一步完善;④未证实rhIL-4能增加DC产率。     

胎儿骨髓基质细胞协同外源性细胞因子对脐带血CD34^＋细胞的体外扩增作用

SCF和FL可促进造血干 祖细胞的增殖 ,是强有力的共刺激因子 ,而骨髓基质细胞所产生的c kit及Flk 2水平很低 ,因此基质细胞培养结合含有SCF或FL的细胞因子组合可提高造血干 祖细胞的扩增效率[1 ] 。SCF IL 3 IL 6 G CSF EPO和SCF IL 3 IL 6 FL EPO二种组合可高效扩增造血干 祖细胞[2 ] ,因此我们拟以上述二种细胞因子组合结合胎儿骨髓基质细胞培养以观察对脐带血CD3 4 细胞的体外扩增作用。材料与方法脐带血样品采自本院妇产科 ,胎儿骨髓采自 5 - 6月水囊引产的健康胎儿的四肢骨。胎儿骨髓基质细胞贴壁层的建立采用…     

阿司匹林对人脐血晚期内皮祖细胞功能的影响

本研究旨在观察阿司匹林对人脐血晚期内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)功能的影响。采用密度梯度离心法及免疫磁珠分选法从脐血获得CD34+的单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板上,培养2周后收集贴壁细胞,通过流式细胞术、免疫荧光、RT-PCR、DiI-Ac-LDL的摄取及体外血管形成能力等方法对其进行鉴定。用不同浓度阿司匹林(终浓度分别为0.1,1,10,100,1 000,10 000μmol/L)处理EPC 24 h,然后分别采用CCK-8比色法、Transwell小室、黏附能力测定实验来观察EPC的增殖能力、迁移能力和黏附能力的变化。结果表明:低浓度的阿司匹林(0.1-1 000μmol/L)对脐血晚期EPC的增殖无明显影响,但可增强晚期EPC的黏附及迁移能力,而高浓度的阿司匹林(10 000μmol/L)显著抑制晚期EPC的增殖和迁移,但对其黏附能力无明显影响。结论:低浓度的阿司匹林可增强晚期EPC的黏附及迁移能力,而高浓度的阿司匹林抑制晚期EPC的增殖、黏附及迁移能力,从而抑制内皮细胞的生成。     

胎儿骨髓基质细胞与细胞因子支持人脐血单个核细胞体外扩增的研究

为了探讨胎儿骨髓基质细胞(FBMSC)联合细胞因子对脐血单个核细胞(MNC)体外扩增作用的影响及比较扩增前后脐血(CB)CD34 细胞上细胞表面趋化因子受体CXCR4和黏附分子CD49d (VLA4)的表达情况,将从新鲜CB标本中分离出的MNC分别接种于已建立的无血清培养体系,该体系分4组:A组为培养过程中不加细胞因子和基质细胞;B组为单用胚胎骨髓基质细胞支持;C组为单用细胞因子支持;D组为细胞因子和胚胎骨髓基质细胞联合支持。在0、6、10及14天检测细胞总数、CD34 细胞数及集落形成单位(CFU)数,同时检测CD34 细胞上CD49d 及CXCR4的表达数。结果表明:在体外14天培养过程中,各时间点D组CD34 细胞、CFU数及CD34 CXCR4 细胞和CD34 CD49d 细胞扩增数均高于A、B、C组(P<0.05);B、C和D组在各时间点各测量指标与A组比较具显著性差异(P<0.05);6天后,B组各测量指标与C组比较具显著性差异(P<0.05)。结论:胚胎骨髓基质细胞联合外源性细胞因子不仅可以支持脐血MNC的有效扩增,而且扩增后与趋化作用和与粘附作用相关的造血细胞亦较扩增前明显增加。单用细胞因子扩增会造成造血细胞的耗竭,单用基质细胞支持可扩增或维持造血细胞的量,但难以实现造血细胞的大量扩增,FBMSC联合外源性细胞因子可能是扩增造血干祖细胞的较理想方案。     

脐带血中长期培养启动细胞在转染FL和／或TPO基因骨髓基质细胞层上的生长

检测长期培养启动细胞(LTC-IC)含量可反映造血干细胞的存在和变化.用正常人骨髓基质细胞、人骨髓基质细胞系和转基因骨髓基质细胞系做培养底层,接种CD34+细胞,进行连续8周的长期体外培养.研究结果表明,在共转染FL和TPO基因的基质细胞系HFT为培养底层所产生的LTC-IC为3.65±0.58/1 000 CD34+细胞,在原代骨髓基质细胞层上所产生的LTC-IC为2.65±0.76/1000CD34+细胞,二者在统计学上无显著性意义.结论转染FL/TPO基因的HFT细胞系可作为LTC-IC培养的培养底层细胞.     

人脐血清代替胎牛血清培养树突状细胞

为探讨血清（umbilica cord serum,UCS)取代胎牛血清（fetal calf serum,FCS)对体体培养体系中树突状细胞分化和功能的影响，用脐血清代替FCS培养树突状细胞。通过流式细胞术检测细胞表型和MTT法检测混合淋巴细胞反应的能力。结果表明，脐血清培养的DC（UCS－DC）表面CD83，CD86和HLA－DR的表达率明显高于FCS组DC；而CD1a表达率低于FCS－DC；对混合淋巴细胞反应的刺激能力UCS－DC与FCS－DC均较对照组明显增强，但UCS－DC与FCS－DC间无明显差别，结论：脐血清代替FCS可以产生完全不含异种蛋白，表型比含FCS体系培养的DC更成熟，具有较强的刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力的DC。