黄花石蒜的组织培养研究

目的探讨黄花石蒜的最佳组织培养条件。方法以黄花石蒜的鳞茎为外植体,接种于不同激素组合的培养基上,开展组织培养研究。结果(1)MS BA 10mg.L-1 N AA0.5mg.L-1培养基对小鳞茎的诱导有明显的促进作用,诱导率为68.7%;(2)M S IBA2mg.L-1为诱导小鳞茎生根的最佳培养基;(3)暗培养效果整体优于光培养。结论通过组织培养方法快速繁殖黄花石蒜是可行的。     

黄花石蒜不定根的离体诱导与培养研究

目的摸索黄花石蒜不定根的离体诱导与培养条件,并对其有效成分加兰他敏进行初步检测。方法以黄花石蒜双鳞片为外植体,接种于不同培养基上,观察长根情况;以离体培养的不定根为材料,检测其是否含有有效成分加兰他敏。结果双鳞片在MS 2,4-D2mg/L培养基中能诱导出愈伤组织;愈伤组织在MS IBA1mg/L BA0.1 mg/L中诱导生根最佳;薄层色谱显示黄花石蒜不定根的培养品中含加兰他敏。结论离体培养黄花石蒜的不定根,可能成为加兰他敏的一个新来源。     

HPLC法测定黄花石蒜不同部位的加兰他敏含量

目的测定黄花石蒜不同部位加兰他敏的含量。方法采用HPLC法。色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm,5μm）,流动相为0.1%磷酸-甲醇（94∶6）,流速为1.0 mL/min,检测波长为238 nm,柱温为30℃,进样量为20μL。结果加兰他敏在10.4-124μg/mL范围内线性关系良好（r=0.999 7）,加样回收率102.8%,RSD为5.2%。黄花石蒜的花中加兰他敏含量最高,根次之,鳞茎和茎中含量最少。结论黄花石蒜不同部位中加兰他敏含量存在差异。     

mRNA差异显示法筛选黄花石蒜中加兰他敏合成相关基因

目的筛选和克隆黄花石蒜加兰他敏相关基因。方法采用mRNA差异显示法(mRNA differential displayPCR,DD-PCR),对7月份黄花石蒜产加兰他敏含量最高的部位花蕊和含量最低的部位花葶进行基因表达差异的研究,筛选其差异片段,再对差异片段进行回收、克隆、测序及序列分析和同源性比较。结果黄花石蒜花蕊和花葶中存在明显的基因表达差异,发现差异条带44条,经序列分析和同源性比较,确认其中2个条带与黄花石蒜加兰他敏合成相关,另一条可能与加兰他敏运输代谢调控有关。结论通过DD-PCR得到的3个同源序列为研究黄花石蒜中加兰他敏的合成途径提供了有力依据。     

不同产地人工栽培黄花石蒜不同器官中加兰他敏含量测定

目的 探索人工栽培黄花石蒜中加兰他敏的最佳采收器官及最适产地,寻找高含量的药材原料.方法 采用HPLC法测定人工栽培黄花石蒜不同器官及不同产地中加兰他敏含量.结果 采用SPSS 17.0软件Corrected Model(模型检验)进行统计学分析表明:黄花石蒜不同器官加兰他敏的含量差别具有显著统计学意义(P＜0.001),其含量由高到低各产地均依次为:花＞根＞花葶＞鳞茎,其3个产地加兰他敏平均含量依次为花(0.135％)＞根(0.080％)＞花葶(0.020％)＞鳞茎(0.017％);不同产地黄花石蒜中加兰他敏含量差别无统计学意义(P＞0.05).结论 黄花石蒜花中含量远远高于鳞茎中含量,每年都可采收,花可作为提取加兰他敏的药材原料,代替传统上使用的一次性采挖的鳞茎;3个产地人工栽培黄花石蒜中加兰他敏含量有细微差别,若以花作为药材原料,则大围山可作为最适种植区.     

不同RNA提取及反转录方法对环状RNA聚合酶链反应的影响

［摘要］ 目的 比较不同总RNA提取方法及不同反转录引物对喉鳞状细胞癌细胞株Hep2细胞环状RAN扩增的影响,进一步为环状RNA鉴定与扩增提供可靠的实验方法。 方法 使用Trizol抽提法和miRNeasy Mini试剂盒提取Hep2细胞中的总RNA;Nanodrop 2000对总RNA进行定量及纯度测定;使用随机引物和通用引物分别对总RNA进步反转录;实时定量聚合酶链反应检测Hep2细胞中环状RNA-circHIPK3及circFLNA的表达。 结果 Trizol抽提法提取的RNA浓度和RNA总量高于miRNeasy Mini试剂盒提取的RNA总浓度结果（P＜0.01）,但应用miRNeasy Mini试剂盒提取的RNA纯度要高于Trizol抽提法（P＜0.05）,应用随机引物反转录,能扩增出circHIPK3和circFLNA,而利用通用引物进行反转录,circHIPK3及circFLNA不能被扩增;另外,利用miRNeasy Mini试剂盒法提取总RNA后所扩增出circHIPK3及circFLNA的相对表达量明显高于Trizol抽提法（P＜0.01）。 结论 miRNeasy Mini试剂盒提取总RNA纯度更高,更有利于环状RNA的扩增,利用随机引物进行反转录而非通用引物,可顺利扩增出环状RNA。     

微波辅助提取石蒜属植物忽地笑中加兰他敏的研究

目的运用微波辅助提取法(MAE)提取石蒜属植物忽地笑中的加兰他敏(Galanthamine)。方法在微波功率和萃取时间一定的条件下,分别选用有机溶剂甲醇、乙醇、甲苯、丙酮及环己烷为提取剂,进行间歇性提取。结果在微波功率为450 W,以甲醇为提取剂,提取时间为6 min时加兰他敏的提取效果最佳。结论微波提取法适合于石蒜属植物中加兰他敏的提取。      

石蒜属植物遗传多样性的ISSR和RAPD标记比较研究

目的研究石蒜属4种植物的种间亲缘关系和同一种内不同采集地材料的遗传多样性,为其种质资源评价和合理开发利用提供分子佐证。方法用ISSR和RAPD标记分别对不同采集地的37份石蒜属植物(石蒜18份、中国石蒜10份、换锦花5份、忽地笑4份)的基因组DNA的遗传多样性进行检测。结果(1)16条ISSR和17条RAPD引物分别扩增出229和215条带,多态比率分别为85.59%和69.77%,显然,ISSR检测出的多态性条带的能力优于RAPD;(2)ISSR和RAPD标记检测同组供试材料种间或种内的Nei′s遗传相似系数范围分别为0.5459～0.9345,0.6419～1.0000,平均为0.6836,0.7428。两者相关系数r=0.8582,达极显著水平。(3)ISSR和RAPD标记的分子聚类结果相近,两种标记均能准确地把不同来源的材料先按种聚类,种间的分子分类结果与传统经典分类相符;种内不同采集地材料间存在一定的遗传差异,其遗传多样性较为丰富。(4)用POPGENE3.2分析的种间基因分化系数(Gst)与用AMOVA进行的遗传变异巢式方差分析所得结果基本一致。结论两种标记均可用于石蒜属植物种间亲缘关系与种内的遗传多样性研究,虽然ISSR标记在种间遗传多样性检测上分辨力较RAPD标记低,但ISSR标记能检测到更高的种内遗传差异性,更适合种下水平的遗传多样性研究。     

一种椎间盘组织总RNA提取的改良方法

目的改进传统常规法在椎间盘组织中总RNA提取,获得高质量的椎间盘组织总RNA。方法健康成年Newsland白兔,完整取出椎间盘组织,随机分RNA传统方法组和酶消化改良组。传统组,按Trizol法提取总RNA;酶消化改良组,加入0.2%Ⅱ型胶原酶,置于细胞培养箱消化数小时,加入含小牛血清的PBS液终止,离心收集细胞。余步骤同传统组。结果传统组,电泳结果未见28S和18S条带,5S条带部分可见;A260/280比值在1.5左右,蛋白多糖污染重。而酶消化组,电泳结果可见清晰的28S、18S和5S条带,且28S条带的亮度约是18S的两倍;A260/280比值在1.8～2.0之间,无蛋白污染,此法提取的RNA,逆转录后可用于扩增β-actin基因。结论酶消化改良法可望成为椎间盘组织总RNA提取的好方法。RNA片断完整,纯度高,无蛋白污染,不影响后续基因表达（RT-PCR）的分析,并且重复性好,可以推广。     

粪肠球菌总RNA提取方法的比较研究

目的:建立一种简易有效的粪肠球菌总RNA提取方法。方法:用3种不同的方法提取粪肠球菌RNA,用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度仪检测提取物的取得率及质量并比较结果。结果:在RNA提取之前加入70%乙醇可有效处理细菌细胞,增加细胞对裂解液的敏感性,再用溶菌酶处理能很好地被消化,获得一种快速、简洁和有效的提取方法。结论:本研究成功的得到一种简易的、改良的粪肠球菌RNA提取方法(方法3)。这是一种适用于粪肠球菌和其它革兰阳性菌的有效提取方法,可用于粪肠球菌和其它革兰阳性菌的分子生物学操作和快速诊断技术。     

石蒜属植物分类鉴别、药用成分及生物技术应用研究进展

介绍了当前石蒜属植物在形态学、细胞学、遗传学等不同水平上的分类方法并对石蒜属植物特有的生物学特性造成其分类鉴定的困难进行了总结。此外,还介绍了石蒜属植物生物碱,并且着重介绍了用于治疗老年性痴呆症的特效药石蒜属次生代谢产物加兰他敏生物代谢合成、提取分离和有机合成、半合成的研究进展情况;并就运用组织培养与无性繁殖等技术对石蒜属植物进行快繁,以满足市场需求进行了总结。最后对运用现代生物技术,通过基因改造,构建转基因植物进行了展望。     

真核细胞RNA的提取和mRNA纯化方法探讨

为采取简便、快速、经济的方法获得高质量的RNA和mRNA，本实验比较了氯化铯超速高心、胍盐／热酚法和“一步法”提取总RNA以及采用Oligo（dT）玻璃柱或离心柱分离纯化mRNA的方法.结果表明:“一步法”与任一种纯化mRNA的方法合用均能获得高纯度、未被降解的RNA和mRNA而可被用于多种实验研究。     

白花蛇舌草总RNA提取方法比较与优化

目的 探索白花蛇舌草总RNA最佳提取方法.方法 以广东产白花蛇舌草为材料,选用Trizol法、多糖多酚总RNA提取试剂盒(RNA prep Pure Plant Kit)、植物总RNA提取试剂盒、改良CTAB法、RNAiso Plus法提取蛇舌草根和叶总RNA,经琼脂糖凝胶电泳及Aligent 2100检测,比较5种提取方法所得总RNA的完整性、纯度及产率.结果 RNA prep Pure Plant Kit及植物总RNA提取试剂盒均能提取到总RNA,1.5％琼脂糖凝胶电泳显示28S、18S条带清晰,前者亮度高于后者.RNA prep Pure Plant Kit中D(γ)260nm/D(γ)280nm和D(γ)260nm/D(γ)230nm值均在2.0左右,叶片组织RNA质量浓度为390.35 mg/L,经Aligent 2100检测,28S条带亮度是18S的2倍.改良CTAB法所得RNA 28S和18S条带稳定清晰,但受基因组污染严重.RNAiso Plus和Trizol法无法完成蛇舌草总RNA的提取.结论 不同植物、不同品种或同一植物不同部位皆存在属性差异,要根据植物特性选择合适的RNA提取方法.RNA prep PurePlant Kit提取蛇舌草根、叶片RNA效果较优,可满足后续试验要求.     

适用于转录组测序的人参根总RNA提取方法的筛选

目的 筛选适用于转录组测序的人参根组织总RNA提取方法.方法 以15年生长白山人参为研究对象,比较RNAiso Plus法、Trizol法、改良CTAB法、植物总RNA提取试剂盒、多糖多酚总RNA提取试剂盒(RNA prep Pure Plant Kit)提取人参根组织总RNA,利用琼脂糖凝胶电泳、Aligent 2100 Bioanalyzer对5种方法提取的总RNA进行质量检测.结果 Trizol法和RNAiso Plus法均能提取到总RNA,1%琼脂糖凝胶电泳显示28S、18S条带清晰稳定,D(γ)260 nm/D(γ)280 nm和D(γ)260 nm/D(γ)230 nm值均在2.0左右.Trizol试剂法提取总RNA的28S条带亮度明显高于18S,所得RNA浓度达485.66 ng/μL,经Aligent 2100 Bioanalyzer检测,28S条带亮度是18S的2倍.RNA prep Pure Plant Kit试剂盒及植物总RNA提取试剂盒提取RNA的条带模糊、弥散,RNA降解严重.改良CTAB法无法完成人参根组织总RNA的提取.结论 Trizol试剂法提取的人参根组织总RNA浓度、纯度及完整性与其他方法相比效果最佳,能满足转录组测序的要求,是人参根组织总RNA提取的首选方法.