变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因转基因黄瓜植株的获得及鉴定

目的:经农杆菌介导将变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因导入黄瓜,获得转基因黄瓜植株,为转基因可食防龋疫苗的研究提供实验基础。方法:利用双元载体pCAMBIA2301构建变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合质粒(PAcA-ctxB)的植物表达载体p2355-PAcA-CTB;电转化法导入农杆菌EHA105;采用叶盘转化法转化黄瓜,转基因植物经过卡那霉素抗性筛选、GUS基因染色、PCR及Southern blot杂交分析检测目的基因鉴定。结果:成功得到转基因黄瓜植株,卡那霉素抗性筛选、GUS基因染色、PCR及Southern blot杂交分析检测证实目的基因PAcA-ctxB已整合至黄瓜基因组中。结论:获得了含有变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因的转基因黄瓜植株,为转基因可食防龋疫苗的进一步研究提供了实验基础。     

变异链球菌表面蛋白PAcP与霍乱毒素B亚单位融合基因在转基因番茄中的表达

目的:在获得含编码变异链球菌表面蛋白PAcP和霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄原代种子的基础上,应用分子生物学技术检测外源基因在转基因植株中的表达,测定目的蛋白的含量。方法:PCR筛选含编码变异链球菌表面蛋白PAcP与霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄植株;提取番茄果实总蛋白,用BCA试剂盒测定番茄果实总蛋白含量;通过Western印迹检测外源蛋白的表达情况,并用ELISA法对外源目的蛋白含量进行测定。结果:PCR扩增分析可见1.6 kb特异性扩增条带,出现特异性条带的植株占总检测植株的55.6%;转基因番茄总蛋白含量为3.93 mg/mL,Western印迹结果显示,在PVDF膜上,约60 kD处出现特异性条带;ELISA测得表达的目的蛋白占番茄可溶性总蛋白的0.18%。结论:含编码变异链球菌表面蛋白PAcP和霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄子代植株能有效表达外源蛋白。     

霍乱毒素B亚单位嵌合体防龋疫苗研究进展

霍乱毒素B亚单位嵌合体防龋疫苗能诱导机体产生显著的免疫抗龋反应,尤其是唾液腺的IgA抗体反应,能有效地阻止致龋菌在牙面的聚集和龋坏的发生,可望成为一种安全、高效的防龋疫苗。     

霍乱毒素B亚单位嵌合体防龋疫苗研究进展

霍毛毒素Ｂ亚单位嵌合体防龋疫苗能诱导机体产生显著的免疫抗龄反应，尤其是唾液腺的ＩｇＡ抗体反应，能有效地阻止致龋菌在牙面的聚集和龋坏的发生，可望成为一种安全，高效的防龋疫苗。     

变形链球菌乳酸脱氢酶的结构和应用

乳酸脱氢酶是变形链球菌的重要毒力因子之一,通过酶促反应合成乳酸引起牙齿损害而成为龋病发生发展的关键环节.本文对变链菌乳酸脱氢酶分子和基因结构、龋病防治的应用探索以及研究前景作一综述.     

变形链球菌表面蛋白P1粘膜免疫动物模型的建立及霍乱毒素的免疫增强作用

用共价偶联的方法 ,将变形链球菌表面蛋白 P1与霍乱毒素 B亚单位或前霍乱原类毒素进行偶联后 ,用灌胃的方法将不同的免疫剂进行大鼠免疫实验 ,检查不同时间大鼠体内特异抗体的产生情况。结果证实了霍乱毒素 B亚单位的佐剂效果 ,同时发现前霍乱原类毒素具有强的胃肠免疫增强作用。     

变形链球菌乳酸脱氢酶的结构和应用

乳酸脱氢酶是变形链球菌的重要毒力因子之一，通过酶促反应合成乳酸引起牙齿损害而成为龋病发生发展的关键环节。本文对变链菌乳酸脱氮酶分子和基因结构、龋病防治的应用探索以及研究前景作一综述。     

柠檬提取物对变形链球菌乳酸脱氢酶和蔗糖酶活性的影响

目的 观察柠檬提取物对变形链球菌(Streptococcus mutans,Sm)乳酸脱氢酶、蔗糖酶活性的影响,探讨柠檬酸提取物抑制Sm致龋活力的相关机制.方法 采用二倍稀释法,用含2%蔗糖的胰蛋白胨大豆肉汤将柠檬提取物的抑菌浓度稀释为0.64、0.32、0.16、0.08及0.04 g/L共5个质量浓度的溶液(5个实验组),以胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基作为空白对照组.加入Sm菌液,厌氧培养6、18、24及48 h,采用还原性辅酶Ⅰ氧化法测定乳酸脱氢酶活性、用pH计测定培养液的pH变化值(△pH),同时采用3,5-二硝基水杨酸显色法测定蔗糖酶的活性.结果 随着柠檬提取物浓度的升高(0.04～0.64 g/L),乳酸脱氢酶、蔗糖酶活性和△pH均逐渐降低(P＜0.01):加入Sm厌氧培养24 h后,Sm乳酸脱氢酶活性从(0.8025±0.0913)×103 U/L降至(0.2099±0.0283)×103 U/L,Sm蔗糖酶活性从(-0.0107±0.0003)×103U/L降至(-0.0078±0.0002)×103 U/L,Sm △pH从2.8067±0.0404降至2.5033±0.0416(24 h).各实验组之间及与空白对照组之间差异有统计学意义(P＜0.01);柠檬提取物对Sm产酸的抑制作用与对乳酸脱氢酶活性的抑制作用之间呈正相关(r=0.8120～0.9918,P＜0.01).结论 低于抑菌浓度的柠檬提取物对Sm乳酸脱氢酶活性和蔗糖酶活性及产酸能力都具有显著抑制作用,作用强度具有浓度依赖性,对对数期细菌抑制作用强于其他生长周期,具有防龋药物的潜能.     

变异链球菌葡糖基转移酶植物表达质粒p2355-gtfB的构建

目的构建含变异链球菌葡糖基转移酶多个免疫显性抗原表位的植物表达质粒p2355-gtfB,为其转化植物研究奠定物质基础,为可食防龋疫苗研究提供条件。方法以真核表达质粒pcDNA3-gtfB为模板,通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增含编码变异链球菌葡糖基转移酶抗原表位的目的基因gtfB。将回收纯化的PCR产物经T-A克隆技术克隆于中间载体pMD18-T,双酶切鉴定插入方向后,将目的基因从中间载体释放,再克隆至高效的植物表达载体p2355,用电转化法转化根癌农杆菌EHA105,对重组质粒阳性克隆株进行筛选与鉴定。结果通过对重组质粒T-gtfB进行酶切图谱分析,获得2.9 kb和3.7 kb的2个片断,将重组质粒p2355-gtfB进行酶切、PCR及测序分析,显示p2355-gtfB中插入基因长度为3 675 bp,基因序列与双脱氧链终止法的测定结果相同,证明植物表达质粒p2355-gtfB构建成功,开放阅读框架正确。结论本研究成功构建了含变异链球菌多个葡糖基转移酶免疫显性抗原表位编码基因的植物表达质粒p2355-gtfB,为可食性防龋疫苗的研究奠定了基础。     

寡发酵链球菌乳酸脱氢酶蛋白质结构的预测

目的 探讨寡发酵链球菌和口腔中不同产酸能力的细菌乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)基因序列和蛋白质各级结构的差异,为进一步研究寡发酵链球菌糖代谢的生化机制提供依据.方法 寡发酵链球菌LDH的基因序列由中科院微生物所测出.通过美国国家生物技术信息中心的Genbank数据库查找变形链球菌、血链球菌和干酪乳杆菌LDH的基因序列,用BLAST软件对各细菌LDH的基因序列和氨基酸序列进行比对.采用蛋白分析专家系统(Expert Protein Analysis System,ExPASy)对寡发酵链球菌、变形链球菌、血链球菌和干酪乳杆菌LDH蛋白质的理化性质、二级结构、结构域和空间结构进行预测并比较.结果 寡发酵链球菌LDH的基因序列共987个碱基对,与血链球菌相似性最高(89％),与变形链球菌的相似性为81％,与干酪乳杆菌相似性最低(70％);寡发酵链球菌LDH氨基酸序列与血链球菌的相似性高达96％,与变形链球菌相似性较低(86％),与干酪乳杆菌的相似性仅为66％;寡发酵链球菌LDH蛋白质的理化性质、跨膜区数目、二级结构的比例、结构域位置与其他3种细菌均相近,LDH的空间结构与变形链球菌、干酪乳杆菌明显不同,与血链球菌也有差异.结论 寡发酵链球菌LDH在基因序列、氨基酸序列及空间结构上与变形链球菌和干酪乳杆菌的差异,可能是导致其LDH生物学功能改变,不能产生乳酸的一个内在原因.     

Induction of immune responses and prevention of alveolar bone loss by intranasal administration of mice with Porphyromonas gingivalis fimbriae and recombinant cholera toxin B subunit

INTRODUCTION: Adult periodontitis is initiated by specific periodontal pathogens represented by Porphyromonas gingivalis; however, an effective measure for preventing the disease has not yet been established. In this study, the effectiveness of a vaccine composed of fimbriae of P. gingivalis and recombinant cholera toxin B subunit (rCTB) was evaluated using BALB/c mice. METHODS: Fimbriae and rCTB were co-administered intranasally to BALB/c mice on days 0, 14, 21, and 28. On day 35, mice were sacrificed to determine immunoglobulin levels in serum, saliva, and nasal and lung extracts by enzyme-linked immunosorbent assay. The prevention effect of the vaccine on P. gingivalis-induced periodontitis in mice was evaluated by measuring alveolar bone loss. RESULTS: The rCTB significantly increased serum immunoglobulin (Ig)A levels when mice were administered with a minimal amount (0.5 microg) of the fimbrial antigen. The adjuvant effect on serum IgG production was indistinct because the minimal amount of the antigen still induced a large amount of IgG. In contrast to systemic responses, a fimbria-specific secretory IgA response was strongly induced by co-administration of rCTB and 0.5 microg fimbriae; the same amount of the antigen alone scarcely induced a response. Histopathological examination revealed IgA-positive plasma cells in the nasal mucosal tissue but no observable mast cells in the area. In addition, nasal administration of the fimbrial vaccine significantly protected the mice from P. gingivalis-mediated alveolar bone loss. CONCLUSION: Nasal vaccination with a combination of fimbriae and rCTB can be an effective means of preventing P. gingivalis-mediated periodontitis.     

变形链球菌gcp基因突变菌株的构建及鉴定

目的:构建变形链球菌gcp基因突变菌株,以便研究变形链球菌gcp基因功能。方法:厌氧培养变形链球菌UA159,以前期研究中pMD19T-gcp为模板,PCR扩增gcp基因内部序列,连接自杀载体pVA8912,酶切鉴定;将鉴定正确的质粒转化变形链球菌UA159,挑取阳性克隆,提取基因组DNA,用PCR结合酶切鉴定。结果:发现PCR产物及插入片段大小与预期值相符,表明成功构建了重组质粒pVA8912/gcp;经PCR鉴定:gcp基因失活株基因组中gcp基因内部成功插入了重组载体片段。结论:成功构建了变形链球菌gcp基因失活株,为该基因功能的研究奠定了基础。     

变形链球菌乳酸脱氢酶基因及同源区的克隆和序列分析

目的：克隆变形链球菌乳酸脱氢酶基因(ldh)及其两侧同源区基因片段。方法：应用PCR技术扩增乳酸脱氢酶及其两端同源区序列片段，插入克隆载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α，Amp^ 抗性挑选阳性克隆，经酶切及PCR鉴定后进行序列测定。结果：PCR扩增产物特异；抗性筛选的4株菌落均为阳性克隆；用DNASIS将序列测定的结果与基因Bank中报道的序列对比分析，同源性为99．1％。结论：根据同源性分析的结果，可确定该克隆片段为变形链球菌乳酸脱氢酶及其两侧同源区序列。     

运动发酵单胞菌adhB基因置换变形链球菌1dh基因重组质粒的构建

目的 保留重组质粒pMDl8-T-ldh中变形链球菌ldh基因上下游同源区，用运动发酵单胞菌adhB基因置换胁基因构建重组质粒。方法 PCR法扩增adhB基因，克隆到PGEM-T载体，构建pGEMA重组质粒，以pMD18-T-1dh重组质粒为模板，反向PCR法缺失ldh，NcoI和XhoI酶产物片段和pGEMA质粒，连接得到重组质粒pMDLA。结果成功克隆adhB基因，并用该基因置换ldh基因构建重组质粒pMDLA。结论 本实验成功将反向PCR法引入缺失突变诱导，丰富了运动发酵单胞菌在医学领域的应用。     

没食子鞣质及联合氟化钠对不同状态下变形链球菌乳酸脱氢酶活性影响的研究

目的 采用析因实验设计研究天然维药没食子鞣质及没食子鞣质联合氟化钠对变形链球菌浮游及生物膜状态下乳酸脱氢酶活性的影响。方法 用含2%蔗糖的脑心浸液液体培养基分别培养浮游和生物膜状态下的变形链球菌,根据析因实验的分组将配置好的没食子鞣质、氟化钠、没食子鞣质联合氟化钠加入相应的菌液中厌氧培养18 h。通过还原性辅酶Ⅰ氧化法测定乳酸脱氢酶活性。使用SPSS 17.0软件包对实验结果进行析因分析,对药物抑制率进行单因素方差分析。结果 生物膜状态下乳酸脱氢酶的活性较浮游状态下高;没食子鞣质、氟化钠、没食子鞣质联合氟化钠对浮游和生物膜状态下的乳酸脱氢酶活性均有抑制作用,浮游状态下乳酸脱氢酶对药物作用更敏感;没食子鞣质对乳酸脱氢酶活性的抑制作用最为显著,抑制率没食子鞣质>氟化钠>没食子鞣质联合氟化钠。结论 没食子鞣质可能是通过抑制乳酸脱氢酶活性抑制变形链球菌产酸,从而达到防龋的作用。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段的克隆和在大肠杆菌中的表达

目的：克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因（Glucan-binding protein C gene,gbpC）编码序列的特异片段,并在大肠杆菌中实现原核表达。方法：根据gbpC序列设计并合成一对寡核苷酸引物,PCR扩增位于gbpC编码序列1342bp～1794bp间的一段特异片段,扩增产物经回收、酶切后,定向插入克隆载体puc18中,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a,挑选阳性克隆,鉴定后进行序列测定。将克隆获得的约0．45kb的gbpC基因特异片段经EcoRI／SalI双酶切后,定向插入pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1／gbpCE原核融合表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,酶切及PCR鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）诱导表达融合蛋白GST-GbpC^E,SDS-PAGE检测表达产物。结果：测序结果与Sato等报道的序列一致;原核表达后,在SDS-PAGE凝胶上出现一条新生蛋白条带,其相对分子量约43000,与预计大小相符合。结论：成功克隆并表达gbpC特异片段,获得了融合蛋白GST-GbpC^E,为制备GbpC抗体打下了基础。     

重组变异链球菌表面蛋白的可溶性表达及抗体制备

目的探讨重组变异链球菌表面蛋白（rPAc）在大肠杆菌中可溶性表达的最佳诱导条件并制备其多克隆抗体。方法通过改变pET20b（+）-AP/BL21（DE3）plysS工程菌的培养条件,提高rPAc可溶性表达水平。用纯化的rPAc免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过酶联免疫吸附测定（ELISA）和Western blot法鉴定抗体的免疫学活性。结果pET20b（+）-AP/BL21（DE3）plysS工程菌在Luria-Bertani（LB）培养基（pH值为7.2）上培养,至表示菌体密度的光密度值OD600 nm=0.6时加入1.0 mmol·L-1异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）,30 ℃诱导培养4 h,rPAc的可溶性表达量最高。以纯化的rPAc免疫BALB/c小鼠,制备抗rPAc多克隆抗体,ELISA法测定抗体效价为1∶6 000,Western blot法鉴定出该抗体可特异性识别rPAc。结论rPAc高效可溶性表达和抗rPAc多克隆抗体的制备为DNA初次免疫-蛋白质加强免疫策略的深入研究奠定了必要的物质基础。     

变形链球菌葡糖基转移酶过表达株粘附模式的扫描电镜观察

通过对变形链球菌野生ＭＴ８１４８及其ＧＴＦＩ过度表达株作蔗糖依赖性粘附实验，发现其起始接种菌量的增，所构建的变链ＧＴＦＩ过度表达株蔗糖依赖性粘附能力明显下降，而ＭＴ８１４８无显著变化。扫描电镜揭示，这是由于ＧＴＦＩ过表达株的粘附模式发生了改变，即由错落有序的立体网状结构转变成片层状结构所致。作者推测这可能与葡聚合成的增加有关。