沉默Tcf3对大鼠骨髓间充质干细胞伤口愈合作用的影响

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)在伤口愈合过程中的作用及其机制。方法:体外培养分离的BMSC,采用表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)诱导BMSC分化为促进伤口愈合的上皮样细胞,通过Western blot和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Tcf3、细胞角蛋白-18(CK-18)、CK...     

NT-3真核过表达载体的构建及其在大鼠MSCs中的表达

目的构建p CDNA3.1-NT-3真核过表达载体,鉴定其在大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达。方法从SD大鼠脑中提取并扩增NT-3基因,并将其克隆入p CDNA3.1中,构建p CDNA3.1-NT-3真核载体;原代培养大鼠间充质干细胞,将p CDNA3.1-NT-3通过Lip2000介导转染至大鼠MSCs;用RT-PCR、免疫荧光法、Western blot法检测NT-3在MSCs中的表达。结果扩增的NT-3基因序列正确,并成功连接到真核载体p CDNA3.1中;转染MSCs后,RT-PCR、免疫荧光、Western blot结果显示MSCs中过表达NT-3的m RNA和蛋白。结论 p CDNA3.1-NT-3真核载体构建成功,转染MSCs后能在细胞中正确过表达,为进一步NT-3基因修饰的MSCs治疗癫痫的研究奠定了实验基础。     

肾上腺髓质素基因腺病毒表达载体的构建及其对骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的:构建表达大鼠AM基因的重组腺病毒载体,探讨其对MSCs增殖的影响.方法:设计AM基因上下游引物,以大鼠肾脏组织总RNA为模板,经RT-PCR扩增获得AM基因全部序列.片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒,获得重组质粒pshuttle-CMV-AM.经双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183菌.同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,将重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化,用脂质体转染293细胞.制备病毒上清并测定其滴度,并感染大鼠骨髓间充质干细胞,用MTT方法评估其对MSCs增殖的影响.结果:完成构建含有AM基因的重组腺病毒,RT-PCR及Western blot检测证实AM在MSCs中表达,并能够促进其增殖(缺氧组与缺氧 AM组相比,P＜0.01).结论:构建重组腺病毒载体,并在MSCs表达AM蛋白.     

含热休克蛋白70和绿色荧光蛋白双顺反子慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定人热休克蛋白70(Hsp70)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子慢病毒表达载体,以探索Hsp70对细胞保护作用的影响。方法通过基因重组技术将人Hsp70连接到含EGFP的慢病毒载体中,包装并收集病毒,感染人胰腺癌细胞系Aspc-1细胞后,通过荧光显微镜观察EGFP的表达,同时利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Westernblot)技术检测Hsp70基因的表达情况。结果酶切和测序鉴定Hsp70-IRES-EGFP双顺反子慢病毒载体构建正确,包装病毒感染细胞后荧光显微镜观察到细胞发绿色荧光,RT-PCR和western blot检测均表明感染病毒后细胞Hsp70的表达量明显增加。结论成功构建了Hsp70-IRES-EGFP双顺反子慢病毒载体,为后续研究Hsp70的功能和作用机制奠定了一定的基础。     

骨髓间充质干细胞在脑血管疾病中的应用

骨髓间充质干细胞具有来源广泛、易采取、易移植和低免疫原性等特性。通过移植间充质干细胞可望修复或替代由于脑血管疾病而受损的神经细胞或重要环路。本文综述近年来各国对骨髓间充质干细胞的生物学特性及其可塑性研究。提示其在体外能够定向分化为神经细胞,在脑内能够成活并增殖分化迁移。这无疑将成为脑血管疾病治疗方法的重要进展。     

骨髓间充质干细胞在肝纤维化中的作用

探讨骨髓间充质干细胞在肝纤维化中的作用。骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)在不同诱导条件下可分化成软骨、脂肪、神经等多种细胞,易分离,遗传背景相对稳定,可在体外大量扩增,体内植入反应较弱,为肝硬化的治疗开辟了新的途径,随着BM-MSCs定向分化条件和纯化技术等研究的不断深入,BM-MSCs作为基因和细胞治疗将在临床安全有效的应用。本组探究则通过对骨髓间充质干细胞的临床应用价值进行简要分析,以此为提高肝脏疾病临床治疗效果提供有效依据。     

骨髓间充质干细胞在消化道疾病中的应用

干细胞具有持久的自我增殖和分化能力,在特定的条件下,可以分化成不同功能的细胞,形成多种组织和器官。干细胞按照细胞起源的阶段可分为胚胎干细胞和成体干细胞,按照其分化潜能分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞3类。骨髓干细胞（BMDCs）包括骨髓间充质干细胞（BMSCs）、造血干细胞和内皮祖细胞。     

小鼠 Tox3 基因重组慢病毒载体的构建及其在卵巢颗粒细胞中的表达

目的：构建重组慢病毒载体pCDH—Tox3-Flag,并检测其转染小鼠原代卵泡颗粒细胞后的表达情况。方法：利用DNA重组技术将小鼠Tox3~N克隆人慢病毒表达载体pCDH—MCS—T2A—copGFP—MSCV中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pCDH—Tox3-Flag、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2．G共转染HEK293FF细胞,包装重组慢病毒LV—Tox3-Flag,并感染小鼠原代颗粒细胞,用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测Tox3mRNA的转录水平,蛋白质印迹（Westernblot）法检测T0x3-Flag蛋白的表达情况。结果：经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体LV—Tox3;RT—PCR及Westernblot结果显示慢病毒感染小鼠原代颗粒细胞后,Tox3基因能在细胞内正确转录、翻译并稳定表达TOX3蛋白。结论：成功建立Tox3基因慢病毒表达载体LV—Tox3-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠原代颗粒细胞,并使Tox3基因得到稳定表达,为后续研究Tox3基因在生殖相关疾病的生理与病理作用奠定了基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

[目的]建立分离纯化、培养、扩增骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSCs)鉴定的方法.[方法]采用密度梯度离心及贴壁培养相结合的方法分离、培养、扩增MSCs,并用流式细胞仪检测其表面标志CD34、CD44、CD105. [结果]培养48 h后即可见呈集落生长的细胞,72 h后可见少量贴壁MSCs细胞,7 d后贴壁细胞明显增多,梭形栅栏样分布,融合度达70%以上.第3代原代培养细胞表面标志CD44+、CD105+在95%左右,CD34的表达率甚低.[结论]联合应用密度梯度离心法及贴壁筛选法,可以获得纯度较高的骨髓MSCs     

小鼠Tox3基因重组慢病毒载体的构建及其在卵巢颗粒细胞中的表达

目的：构建重组慢病毒载体pCDH-Tox3-Flag,并检测其转染小鼠原代卵泡颗粒细胞后的表达情况。方法：利用DNA重组技术将小鼠Tox3基因克隆入慢病毒表达载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pCDH-Tox3-Flag、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染HEK293FT细胞,包装重组慢病毒LV-Tox3-Flag,并感染小鼠原代颗粒细胞,用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Tox3 mRNA的转录水平,蛋白质印迹（Western blot）法检测TOX3-Flag蛋白的表达情况。结果：经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体LV-Tox3;RT-PCR及Western blot 结果显示慢病毒感染小鼠原代颗粒细胞后,Tox3基因能在细胞内正确转录、翻译并稳定表达TOX3蛋白。结论：成功建立Tox3基因慢病毒表达载体LV-Tox3-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠原代颗粒细胞,并使Tox3基因得到稳定表达,为后续研究Tox3基因在生殖相关疾病的生理与病理作用奠定了基础。     

神经干细胞的体外培养及增强型绿色荧光蛋白基因转染研究

目的探索大鼠胚胎神经干细胞(NSCs)的体外培养,探讨NSCs作为基因靶细胞,以及逆转录病毒介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记NSCs的可行性.方法胚胎大鼠脑组织分离神经干细胞,无血清培养,免疫组织化学技术鉴定.用Lipofectin将pLEGFP-N1逆转录病毒载体导入PA317包装细胞,用G418筛选获得抗性细胞克隆,扩增抗性细胞并收集病毒上清;病毒上清感染神经干细胞,用G418筛选,荧光显微镜下观察并挑选EGFP表达最强的克隆,并做免疫组化鉴定;进一步培养扩增,做传代细胞的分化鉴定.结果培养出大鼠胚胎神经干细胞.荧光显微镜下检测感染逆转录病毒的神经干细胞,以及免疫组化鉴定,均显示EGFP获得良好表达;而且感染细胞能够被诱导分化为神经元和神经胶质细胞.结论大鼠胚胎神经干细胞能够在体外适宜的条件下进行长期培养;神经干细胞可直接作为基因靶细胞;利用逆转录病毒载体,建立稳定表达EGFP的神经干细胞系具有可行性,为进一步做标记细胞移植研究奠定基础.     

HBV核心抗原EGFP融合蛋白表达质粒的构建及在Hep G2细胞中的表达

目的探讨采用构建的质粒pHBc-EGFP转染HepG2细胞,瞬时表达HBV核心抗原和增强型绿荧光蛋白的可行性.方法克隆HBV核心抗原基因进入真核表达载体pEGFP-N1中,脂质体法转染HepG2细胞后在荧光显微镜下观察增强型绿荧光蛋白表达,并行RT-PCR及细胞免疫组化分析融合蛋白的表达.结果重组pHBc-EGFP质粒可在HepG2细胞内瞬时表达HBV核心抗原和增强型绿荧光蛋白融合蛋白.结论pHBc-EGFP质粒构建成功,增强型绿荧光蛋白的表达可报告HBV核心抗原表达.     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组体的构建及其表达鉴定

目的构建含幽门螺杆菌（Hp）Lpp20基因的真核表达重组体,并鉴定其在Hela细胞中能否有效表达,为进一步开展Lpp20核酸疫苗与该蛋白的生物学功能的研究打下基础。方法抽提Hp标准菌株26695基因组DNA,应用聚合酶链式反应（PCR）技术从基因组DNA扩增Lpp20基因,经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pcD-NA3.1（＋）,转入大肠杆菌,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应鉴定;用脂质体法将构建好的重组载体pcDNA3.1（＋）-Lpp20转染Hela细胞,通过免疫细胞化学法及Western印迹法检测其在Hela细胞中表达的Lpp20蛋白。结果成功扩增出长约528 bp的Lpp20基因,测序结果表明扩增出的Lpp20基因与Hp Lpp20序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实Lpp20基因正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,并经免疫细胞化学法和Western印迹法检测到重组体可在Hela细胞中有效表达。结论成功构建了Lpp20基因的Hp真核表达重组体,并检测到其在Hela细胞中可表达出免疫反应性良好的蛋白,为进一步探索其免疫作用及生物学功能奠定了基础。     

变应性鼻炎大鼠TNFAIP3基因在鼻腔上皮细胞的表达

目的 研究致敏-治疗过程中肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(tumor necrosis factor alpha-induced protein 3,TNFAIP3)基因在大鼠鼻腔黏膜上皮的表达,探讨TNFAIP3基因在变应性鼻炎免疫进程中的作用。方法 本实验于在2019年1月—2020年1月开展,将24只Wistar大鼠,随机分为对照组、模型组、治疗组各8只。卵清蛋白构建变应性鼻炎（allergic rhinitis,AR）大鼠模型并评价造模效果;免疫组化法检测大鼠鼻腔黏膜组织中促炎因子核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)、TNFAIP3的表达情况;采用qRT-PCR检测鼻黏膜中NF-κB和TNFAIP3基因表达的情况。结果 AR大鼠模型构建成功,模型组鼻腔黏膜组织中可见大量嗜酸性粒细胞浸润,NF-κB阳性显色密集,TNFAIP3阳性显色罕见。鼻黏膜中NF-κB基因表达在模型组中高于治疗组与对照组（P <0.05）。TNFAIP3基因表达在模型组中低于治疗组与对照组（P <0.05）。结论 锌指蛋白TNFAIP3作为炎症触发因子NF-κB的负调...     

RyR2-shRNA重组慢病毒载体的构建及其对离体心肌细胞RyR2基因表达的影响

目的构建携带RyR2-shRNA的慢病毒载体,并检测其对小鼠离体心肌细胞中RyR2的基因沉默效果。方法设计并合成针对小鼠RyR2基因的shDNA,克隆入含U6启动子和EGFP报告基因的慢病毒载体psiHIV-U6-eGFP,构建表达RyR2-shRNA的慢病毒载体,通过将慢病毒转移质粒和包装质粒共转染293T细胞,得到重组慢病毒载体颗粒,然后离体感染小鼠心肌细胞,采用Real-timePCR检测RyR2在mRNA水平的沉默效应。结果经测序证实RNAi慢病毒载体构建成功并成功包装。流式细胞仪测得重组慢病毒感染小鼠心肌细胞的阳性率达80%以上。Real-timePCR证实,重组慢病毒Lenti-siRyR2感染的小鼠心肌细胞中RyR2在mRNA水平基因抑制率达90%以上。结论成功构建了表达RyR2-shRNA的重组慢病毒表达载体,并在小鼠心肌细胞中实现有效的基因沉默效应。     

雌性SD大鼠围产期铅染毒对仔鼠脑细胞Brn-3a表达及凋亡的影响

目的探讨铅对中枢神经系统神经细胞内转录因子Brn-3a表达的影响及诱导细胞凋亡的作用.方法20只受孕SD大鼠随机分为4组,经围产期饮水染铅(0、0.5、1.0、2.0g/L)后,对其21日龄仔鼠不同脑区的Brn-3a蛋白表达水平进行观察,采用流式细胞仪测定细胞凋亡率及应用间接免疫荧光反应测定Bcl-2蛋白的表达情况.结果染铅组大鼠大脑皮层、海马及小脑的Brn-3a蛋白表达的阳性面积比、平均灰度与对照组比较,其差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01),并呈剂量依赖性的变化,Brn-3a表达低于对照组;染铅组大鼠海马组织细胞凋亡率高于对照组(P＜0.01);染铅组大脑皮层、海马、小脑部位Bcl-2蛋白表达下降(P＜0.05或P＜0.01).结论铅对发育期神经组织的损害可能与其诱导的神经细胞凋亡相关联,铅致Brn-3a蛋白表达下降可能是铅致神经细胞凋亡的途径之一.     

Expression of Recombinant pET22b-LysK-Cysteine/Histidine-Dependent Amidohydrolase/Peptidase Bacteriophage Therapeutic Protein in Escherichia coli BL21 (DE3)

Objectives

Bacteriophage-encoded endolysins are a group of enzymes that act by digesting the peptidoglycan of bacterial cell walls. LysK has been reported to lyse live staphylococcal cultures. LysK proteins containing only the cysteine/histidine-dependent amidohydrolase/peptidase (CHAP) domain has the capability to show lytic activity against live clinical staphylococcal isolates, including methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). The aim of this study was to clone and express LysK-CHAP domain in Escherichia coli BL21 (DE3) using pET22b as a secretion vector. The pET22b plasmid was used, which encoded a pelB secretion signal under the control of the strong bacteriophage T7 promoter.

Methods

The E. coli cloning strains DH5α and BL21 (DE3) were grown at 37°C with aeration in the Luria-Bertani medium. A plasmid encoding LysK-CHAP in a pET22b backbone was constructed. The pET22b vector containing LysK-CHAP sequences were digested with NcoI and HindIII restriction enzymes. Cloning accuracy was confirmed by electrophoresis. The pET22b-LysK plasmid was used to transform the E. coli strain BL21. Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to a final concentration of 1mM to induce T7 RNA polymerase-based expression. Finally, western blot confirmed the expression of target protein.

Results

In this study, after double digestion of pEX and pET22b vectors with HindIII and NcoI, LysK gene was cloned into two HindIII and NcoI sites in pET22b vector, and then transformed to E. coli DH5α. Cloning was confirmed with double digestion and analyzed with agarose gel. The recombinant pET22b-LysK plasmid was transformed to E. coli BL21 and the expression was induced by IPTG. The expression was confirmed by Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting method. Observation of a 28.5 kDa band confirmed LysK protein expression.

Conclusion

In the present study, LysK-CHAP domain was successfully cloned and expressed at the pET22b vector and E. coli BL21 (DE3).