两种重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白转染大鼠成骨细胞效率的体外研究

目的 比较2种不同重组腺相关病毒(rAAV)介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)对大鼠成骨细胞的转染效率,评价其作为成骨细胞病变基因治疗载体的可行性.方法 采用Ⅰ型胶原酶阶段消化法分离培养大鼠成骨细胞并鉴定,rAAV-EGFP按转染复数(MOI) 1×10~3、1×10~4、1×10~5、5×10~5分为只加rAAV和rAAV与腺病毒(ADV)共同转染组转染成骨细胞,倒置荧光显微镜观察转染后荧光强度随转染时间的变化,流式细胞仪检测rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP对成骨细胞的转染效率及荧光强度,确定转染的较佳MOI值,以此值用MTT法描绘细胞生长曲线,观察rAAV对细胞的毒性.结果 分离培养的细胞具有体内成骨细胞的生物学行为,rAAV对成骨细胞的转染效率随MOI值的增加而提高,ADV(-)组荧光强度在第5 d达到高峰,当MOI为1×10~5时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率分别为90.2%、66.1%,MOI值增到5×10~5时转染效率无显著提高;ADV(+)组荧光强度在第3 d即达高峰,MOI值为5×10~5时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率为47.6%、30.5%.细胞生长正常,rAAV对细胞活性影响小.结论 两种病毒载体对成骨细胞转染效率均较高,其中rAAV2/6高于rAAV2/9,是一种理想的基因治疗载体.     

1型及2型腺相关病毒对视网膜细胞转导效率的比较研究

目的探讨不同血清型的重组腺相关病毒(rAAV)对视网膜细胞的转导效率、基因表达水平以及感染细胞类型的差异,为眼底病基因治疗选择适当的载体提供实验依据。方法采用携带绿色荧光蛋白报告基因的血清型1型(rAAV2/1-EGFP)和2型(rAAV2-EGFP)rAAV感染体外培养的RPE细胞株、原代培养的SD大鼠视网膜神经细胞和原代培养的成人RPE细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和检测EGFP荧光出现的时间、阳性率及荧光强度。分别将二种不同血清型的rAAV注射到SD大鼠视网膜下间隙,通过荧光体视镜观察眼底出现EGFP荧光的时间、范围、强度和分布特点等。最后通过眼组织切片和免疫组织化学染色观察被AAV感染的视网膜细胞的类型,以及是否有炎症反应和免疫反应。结果流式细胞仪检测rAAV2-EGFP转导体外培养的RPE细胞株后第7、14天时EGFP阳性率分别为13.5%±1.7%和15.6%±0.8%,平均亮度为2.75±0.12和3.80±0.72;rAAV2/1-EGFP转导RPE细胞株后第7和14天时EGFP阳性率分别为1.1%±0.5%和2.0%±0.4%,平均亮度为1.12±0.09和1.75±0.20。rAAV2-EGFP感染活体视网膜后7、14、28、75d和4个月时,视网膜内EGFP荧光面积分别为(5389±211)μm2、(9832±364)μm2、(14454±446)μm2、(20528±648)μm2和(20264±683)μm2;rAAV2/1-EGFP感染活体视网膜后在相同时间点测得EGFP荧光面积分别为(9666±348)μm2、(12160±439)μm2、(19794±621)μm2、(26172±923)μm2、(26022±965)μm2。每相同时间点的两组数据间差异具有统计学意义(均P<0.05)。结论2型rAAV能有效转导体外培养的视网膜细胞和活体视网膜细胞;但在活体视网膜内1型rAAV是一种比2型AAV更为有效的基因传递载体。     

1型重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染人脐静脉内皮细胞的体外研究

目的 评价1型重组腺相关病毒(rAAV1)作为新生血管性角膜病变基因治疗载体的可行性.方法 rAAV1-EGFP按转染倍数(MOI)5×103,5×104,5×105转染ECV304细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察ECV304细胞中GFP阳性表达情况和细胞生长形态特点等,流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对EVE304细胞的转染效率.MTT法检测rAAV1-EGFP对EVC304细胞增殖的影响.结果 转染后2 d,MOI=5×105组细胞中的GFP开始表达;表达强度随MOI值的增高而增强,同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强,转染后第7天达到高峰,此时流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对ECV304细胞的转染率分别为45.90％(MOI=5×103),58.56％(MOI=5×104),68.31％(MOI=5×105).AAV1-EGFP转染ECV304细胞后.细胞生长及形态正常.MTT法显示转染后72、96 h各转染组与未转染组之间A值无显著性差异.结论 rAAV1-EGFP对ECV304细胞转染稳定、有效,重组腺相关病毒对细胞增殖无明显抑制,重组腺相关病毒可作为基因治疗角膜新生血管性病变的载体.     

腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因体外转染兔结膜上皮细胞

目的:研究2型重组腺相关病毒( recombinant adeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP) 对体外培养兔结膜上皮细胞的转染和表达情况,为后续研究提供依据。方法:体外培养兔结膜上皮细胞,rAAV2-EGFP 按感染复数(multiplicity of infection ,MOI)为104、105、106 转染第2代兔结膜上皮细胞,转染后第1 、3 、5 、7日倒置荧光显微镜下观察细胞中EGFP表达情况,计算转染率。MTT方法检测rAAV2-EGFP转染对细胞增殖的影响。结果:随着MOI值增大及转染时间延长,EGFP 表达效率逐渐增高,转染后第7～8日达到高峰并维持。MTT检测各MOI组与对照组差别无统计学意义。结论:rAAV2载体可以介导EGFP 基因高效稳定转染兔结膜上皮细胞,并且对细胞增殖无影响。     

rAAV1-EGFP和rAAV2-EGFP转染犬骨髓间充质 干细胞的比较

 【目的】 研究不同血清型腺相关病毒(rAAV)载体介导的增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)对体外培养犬骨髓间充质干细胞(MSC)的转染效率及其毒性作用&#65377;【方法】 应用密度梯度离心法及贴壁筛选法分离培养犬MSC,倒置显微镜及Giemsa染色观察细胞形态,透射电镜观察其超微结构,流式细胞仪鉴定其表面标记物&#65377;取第3代MSC,以MOI为104 ~ 105 v.g./cell 的rAAV1-EGFP 和rAAV2-EGFP进行转染,3 d&#65380;7 d&#65380;21 d后荧光显微镜观察检测转染效率;MTT法检测rAAV1-EGFP 和rAAV2-EGFP对MSC的毒性作用&#65377; 【结果】 原代及传代培养的MSC呈梭形外观,具有较强的增殖能力&#65377;MSC超微结构显示其胞体较小,细胞核/浆比例大,胞浆少,染色质较疏松&#65377;细胞表面抗原CD29&#65380;CD44表达阳性,CD34表达阴性&#65377;随MOI的增加及时间的延长,rAAV1-EGFP&#65380;rAAV2-EGFP对犬MSC的转染效率逐渐增加,rAAV2-EGFP转染效率明显高于rAAV1-EGFP(P < 0.01)&#65377;转染MSC细胞后,细胞生长正常,MTT法显示各转染组与未转染组的OD值无统计学差异(P > 0.05)&#65377; 【结论】 相对犬MSC,rAAV2是一种比rAAV1更优越的转基因载体,而且对细胞生长无明显抑制,做为组织工程种子细胞的载体是安全可行的&#65377;     

携自杀基因微泡转染卵巢癌细胞株SKOV_3的超声参数及转染效率

目的:探究超声介导携Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv1tk)自杀基因微泡转染SKOV3细胞的超声参数及转染效率.方法:超声在不同微泡浓度与辐照时间(8,15,30,60s间隔1s)组合下辐照SKOV3细胞,MTT法筛选最适辐照时间和微泡浓度.将实验分成6组分别进行以下处理:超声辐照组,脂质体+超声辐照组,脂质体+微泡+超声辐照组,微泡+超声辐照组,裸质粒组(阴性对照),脂质体组(阳性对照).用裸质粒及脂质体处理后分别转染pcDNA3.1-EGFP/hsv1tk质粒;采用荧光显微镜、流式细胞技术分别定性和定量检测各组转染效率;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测hsv1tk基因的表达.结果:MTT检测在超声强度0.5W/cm2,频率1MHz,微泡浓度0.56×1011个/L,辐照时间8s间隔1s条件下,超声辐照微泡转染对细胞活性无明显抑制.经此条件转染后荧光显微镜下可观察到脂质体+微泡+超声辐照组的绿色荧光强度最强;流式细胞技术检测表明,微泡+超声辐照组转染效率为(11.74±0.19)%,比超声辐照组(2.19±0.22)%高,而脂质体+微泡+超声辐照组(25.62±0.08)%均高于其他各组(P<...     

对比研究两种腺病毒载体对大鼠骨髓间充质干细胞的转染效率及机制

目的 对比研究两种腺病毒载体Ad5/EGFP和AdF35/EGFP转染SD大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSC)的效率及其机制.方法 用密度梯度法从大鼠骨髓中分离出rBMSC,流式细胞仪检测其表面相关标志抗原(CD90、Cd29、CD44、CD34、CD11b和CD45)以鉴定rBMSC.用不同梯度感染复数(MOI)的Ad5/EGFP和AdF35/EGFP分别转染rBMSC,MTT检测二者对rBMSC生长的影响.转染后第1～9天,荧光显微镜下观察转染情况,同时流式细胞仪检测转染效率及平均荧光强度,实时PCR检测rBMSC表面CAR及CD46的表达水平.结果 rBMSC表达CD90、Cd29、CD44阳性,而CD34、CD11b、CD45表达为阴性.MOI≤1600时,Ad5/EGFP对rBMSC的生长无明显抑制作用(t=3.12,P=0.052);MOI≤1000时,AdF35/EGFP对rBMSC的生长无明显抑制作用(t=2.20,P=0.15)).荧光显微镜下,Ad5/EGFP转染rBMSC 1 d后即可见大量EGFP表达阳性的细胞,第2～3天阳性细胞数最多,随后减少,第9天仍可见少量的阳性细胞.AdF35/EGFP转染rBMSC后1～9 d EGFP阳性细胞数始终很少.Ad5/EGFP的转染效率显著性高于AdF35/EGFP的转染效率(t=2.45,P=0.008).经实时PCR检测,rBMSC高度表达CAR,而极低表达CD46,二者之间差异有统计学意义(t=2.57,P＜0.01).结论 Ad5/EGFP对rBMSC的转染效率明显高于AdF35/EGFP,这可能与rBMSC表面高表达CAR而极低表达CD46有关.AdF35不合适作为目的 基因转染rBMSC的载体,Ad5可作为目的 基因有效转染rBMSC的载体,这为后续目的 基因转染rBMSC治疗各种疾病的实验研究奠定了基础.     

罗格列酮经PPARγ受体介导HL-60细胞成熟分化

目的：研究人过氧化物酶体增殖物激活受体1（PPARγ）在白血病HL-60细胞分化中的作用．方法：采用Li—pofectamine2000脂质体进行HL-60细胞质粒转染．实验分单纯HL-60细胞培养组,空载体pIRES2-EGFP转染组,10μmol／L罗格列酮干预组和10μmol／L罗格列酮联用phPPARγ-IRES2-EGFP质粒转染组．荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光蛋白（GFP）表达．流式细胞仪检测转染效率,并对转染细胞成熟粒．单细胞特异性标志CD11b和CD14的表达进行分析．结果：转染的HL-60细胞可见绿色荧光表达,phPPARγ-IRES2-EGFP质粒转染效率为55％．流式细胞仪检测结果表明,罗格列酮干预组和罗格列酮联用phPPARγ-IRES2-EGFP质粒转染组的CD11b＋和CD14＋细胞检出率均显著高于未转染细胞组与空载体转染组（P〈0．05）,且罗格列酮联用phPPARγ-IRES2-EGFP质粒转染具有协同效应;而未转染细胞组与空载体转染组2种表型细胞百分率差异均无统计学意义（P〉0．05）．结论：罗格列酮可通过激活PPARγ促进HL-60细胞向粒-单细胞成熟分化,有望成为治疗白血病的候选药物．     

Effect of overexpressed Golgi α-mannosidase Ⅱ on proliferation in human gastric cancer cell line BGC-823

目的 探讨过表达高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgiα-mannosidaseⅡ,GMⅡ)对人胃癌细胞株BGC-823增殖活性的影响.方法 构建真核表达载体EX-E2372-M03,通过脂质体Lipofectamine2000转染至人胃癌细胞株BGC-823,筛选稳定细胞株,用免疫荧光观察转染效率.用RT-PCR法检测转染细胞GMⅡ、c-myc、bcl-2 mRNA的表达,用Westem blot 法检测转染细胞GMⅡ、c-myc、bcl-2蛋白表达的变化,用MTT法及流式细胞仪检测过表达GMⅡ后对细胞增殖活性的影响.结果 GMⅡ真核表达质粒构建成功并成功转染,MTT结果示过表达GMⅡ后胃癌细胞增殖活性明显高于对照组(P＜0.05).流式细胞仪检测结果显示,与对照组相比较,GMⅡ过表达组胃癌细胞G1期细胞明显减少,S期细胞比例明显增加.转染后胃癌细胞GMⅡmRNA和蛋白表达水平明显高于对照组(P＜0.05),且可明显上调胃癌细胞BGC-823中c-myc的mRNA和蛋白表达水平(P＜0.05),但对bcl-2的调节作用不明显.结论 过表达GMⅡ能促进胃癌细胞增殖,可能与上调c-myc的表达有关.     

CaMKⅡγ蛋白的过表达及敲低对大鼠肝细胞BRL-3A增殖的影响

目的探究CaMKⅡγ蛋白在肝细胞增殖中的作用。方法分别使用CaMKⅡγ过表达、敲低及相应空载体对照的慢病毒表达体系转染大鼠肝细胞BRL-3A,同时建立正常组形成对照。流式细胞仪检测转染效率,Western blot法检测CaMKⅡγ蛋白的表达水平,CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期。结果 CaMKⅡγ蛋白相对表达量LV-CaMKⅡγ组与CON组有统计学意义(P0.05),LVCaMKⅡγ shRNA组与CON组有统计学意义(P0.05),余间无统计学意义(P0.05)。LV-CaMKⅡγ shRNA组细胞增殖最快,与CON组比较统计学有意义(P0.05);LV-CaMKⅡγ组细胞增殖最慢,与CON组比较统计学有意义(P0.05);余各组间的差异不显著(P0.05);在G0/G1期,LV-CaMKⅡγ组细胞占比明显高于CON组(P0.01),LV-CaMKⅡγ shRNA组细胞占比明显低于CON组(P0.01),余各组间无统计学意义(P0.05)。在S+G2/M期,LV-CaMKⅡγ组细胞占比明显高于CON组(P0.01),LV-CaMKⅡγ shRNA组细胞占比低于CON组(P0.01),余各组间无统计学意义(P0.05)。结论 CaMKⅡγ蛋白表达的敲低可以促进大鼠肝细胞BRL-3A的增殖,而CaMKⅡγ蛋白的过量表达则抑制大鼠肝细胞BRL-3A增殖。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

尿微量白蛋白检测在继发性肾脏疾病中的临床意义

目的探讨尿微量白蛋白（m-Alb）检测在继发性肾脏疾病中的临床意义。方法采用Beckman Immage全自动特种蛋白分析仪对糖尿病组、高血压组、心脏病组患者进行了m-Alb测定,同时与健康组结果作对比。结果m-Alb检测糖尿病组为3.7±5.26mg/dl,高血压组为7.5±8.18mg/dl,心脏病组为7.8±3.76mg/dl,健康组为0.66±0.48mg/dl,各试验组m-Alb增高百分率为糖尿病组48.9%,高血压组37.5%,心脏病组26.9%。结论尿蛋白阴性的糖尿病、高血压、心脏病患者进行m-Alb检测,可以监测病程的进展。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

喉癌主癌灶手术切缘的临床特点分析

目的探讨研究喉癌主癌灶手术的安全切缘在临床上的特点。方法回顾性分析2007年6月—2011年3月已经确诊喉癌的患者100例,随机分成A、B两组,A组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取镜下观察分析;B组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取肉眼观察分析,将结果进行临床特点分析比较。结果早期的喉癌患者和晚期的喉癌患者的阳性切缘例数,差异无统计学意义（P〉0.05）;晚期的阳性切缘发生次数高于早期的阳性切缘发生次数,差异有统计学意义（P〈0.05）。声门上区[SG]2、3和5、10mm;跨声门型[TG]2、3mm和5、10mm的切缘对比,差异有统计学意义（P〈0.05）。SG、G、TG、IG的2mm和3mm,5mm和10mm对,差异无统计学意义（P〉0.05）。肉眼阳性切缘观察39个,镜下阳性切缘观察43,两者差异无统计学意义（P〉0.05）。结论依据原发不同部位、不同分期和不同范围选取适合的切线,就可以有效地减少阳性切缘的发生。     

儿童腹痛328例病因诊断及分析

目的：根据儿童急性腹痛的特点,诊断儿童腹痛应综合临床及相关检查提供的依据,做出准确诊断,给予适当治疗。方法：对临床328例腹痛患儿进行选择性辅助检查和分析。结果：小儿腹痛病因复杂,腹腔内疾病占64．63％,共17种病因;腹腔外疾病占35．37％,共6种病因。结论：仔细询问病史、认真体格检查、密切观察病情、针对性地选择辅助检查,在儿童腹痛的诊断上具有重要的意义。