人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2) 是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。 目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。 设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07/2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。 材料：pcDNA3.1(+)载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。 方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录-聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM-T- hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T- hBMP-2质粒和pcDNA3.1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3.1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP-2的表达。 主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA 反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM-T-hBMP-2 和pcDNA3.1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。 结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1.2 kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3.1- hBMP-2构建正确;该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

Der p 2基因真核表达载体构建及其在小鼠树突状细胞中的表达

背景：树突状细胞是目前已知的最强大的抗原提呈细胞，已经被应用于免疫治疗的研究中。 目的：构建Der p 2真核表达载体，并证明能在小鼠骨髓来源的树突状细胞中表达。 设计、时间及地点：单一样本观察，实验于2005-05/12在解放军第三军医大学新桥医院全军呼吸疾病研究所完成。 材料：C57BL/6小鼠；plambd-Der p 2购自美国HESKA公司；pCI-neo质粒为解放军第三军医大学新桥医院全军呼吸疾病研究所保存。 方法：体外分离，培养小鼠骨髓来源树突状细胞。将原核表达质粒plambdDer p 2携带的Der p 2全长cDNA切下，重组到真核表达质粒pCI-neo中，然后在脂质体介导下，将重组质粒转染到小鼠骨髓来源的树突状细胞，以未转染质粒和转染空白载体pCI-neo的树突状细胞为对照。 主要观察指标：①pCI-neoDer p 2重组质粒结构鉴定。②并用反转录-聚合酶链反应、Western Blot检测Der p 2mRNA和蛋白表达。 结果：测序证实构建的重组质粒中携带了Der p 2的全长cDNA序列，且与Gene Bank序列完全一致。反转录-聚合酶链反应和Western Blot检测结果提示，重组质粒转染的树突状细胞能表达Der p 2 mRNA和Der p 2蛋白。 结论：成功构建重组Der p 2基因真核表达载体，其转染树突状细胞后，能有效地表达于树突状细胞中。     

转化生长因子β1基因克隆及重组真核表达质粒的构建*★

背景：通过基因转移方法研究某一外源性基因在细胞中的作用是目前分子生物学常用的技术手段，与病毒载体相比，应用pcDNA4.0-TGF-β1真核表达质粒的转染方法无遗传毒性和细胞毒性，有更高的安全性。 目的：通过克隆转化生长因子β1基因，观察构建重组转化生长因子β1基因真核表达质粒的可行性。 设计、时间及地点：以细胞为观察对象的体外实验，于2007-03/2008-02在河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室完成。 材料：2月龄清洁级健康SD大鼠，雌雄不拘，用于分离细胞中RNA。 方法：从大鼠骨髓细胞中分离提取转化生长因子β1的mRNA，反转录-聚合酶链反应扩增后，克隆入pGEM-T载体，PCR鉴定重组子；酶切下目的基因转化生长因子β1，再亚克隆入载体pcDNA4.0质粒，酶切鉴定亚克隆重组子并进行DNA序列分析。 主要观察指标：TGF-β1cDNA、pGEM-T-TGF-β1和重组子pcDNA4.0-TGF-β1的表达。 结果：经过反转录-聚合酶链反应扩增得到TGF-β1 cDNA条带；PCR扩增鉴定得到pGEM-T-TGF-β1。酶切鉴定得到亚克隆重组子pcDNA4.0-TGF-β1，经测序鉴定证实插入DNA序列与设计完全一致。 结论：成功克隆大鼠转化生长因子β1基因，并构建出重组转化生长因子β1真核表达载体。     

NOV基因真核表达载体的构建及在大鼠真皮多能干细胞中的表达

目的 构建肾母细胞瘤过度表达(NOV)基因真核表达载体并检测其在真皮多能干细胞中的表达. 方法 利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,以新生大鼠大脑组织总RNA为模板,扩增出1 178bp的NOV基因的cDNA编码区序列,然后用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切后定向克隆入真核表达载体pEGFP-N1质粒中,用脂质体法将重组质粒转染入大鼠真皮多能干细胞中,荧光显微镜观察转染产物,RT-PCR法检测转染细胞中NOV基因表达. 结果 NOV基因cDNA正确克隆到真核表达载体pEGFP-N1质粒中;重组质粒体外转染入大鼠真皮多能干细胞后,可见转染细胞有绿色荧光表达.转染细胞中检测到NOV基因. 结论 构建成功NOV基因重组质粒,并能在大鼠真皮多能干细胞中稳定表达,为NOV基因及真皮多能干细胞的作用研究提供了有利的分子工具.     

起搏通道HCN2基因和增强型绿色荧光蛋白双基因载体在人胚胎肾细胞的共转染表达*★

背景：获得高效、安全的基因转移载体是目前研究的目标。 目的：构建携带起搏通道(HCN2)基因和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）双基因真核表达载体，并观察在人胚胎肾细胞（HEK293）表达情况。 设计、时间及地点：单一样本观察，实验于2006-07/2007-08在全军重点实验室解放军总医院老年心血管病研究所完成。 材料：质粒pIRES-EGFP为Clontech公司产品，PCI-HCN2质粒，含有人全长HCN2基因为解放军总医院老年心血管病研究所惠赠。 方法：利用脑炎心肌炎病毒的内部核糖进入位点(IRES),构建HCN2与增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体pIRES-EGFP-HCN2。将脂质体和pIRES-EGFP-HCN2基因混合后转染人胚胎肾细胞,用反转录-聚合酶链反应检测HCN2 mRNA表达。 主要观察指标：①重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2的构建。②起搏通道基因HCN2 cDNA的克隆。③增强型绿色荧光蛋白表达的荧光检测。 结果：构建的pIRES-EGFP-HCN2在转染8 h后开始表达，48 h达到最高。经酶切鉴定含有增强型绿色荧光蛋白和HCN2基因。 结论：实验成功地构建了pIRES-EGFP-HCN2真核共表达载体，具有HCN2、增强型绿色荧光蛋白的双重活性，IRES能够介导外源基因HCN2在人胚胎肾细胞表达。     

大鼠κ—HA—pIRES2-EGFP的构建及表达

目的 构建带HA标签的大鼠κ型阿片受体的pIRES2-EGFP表达质粒(κ-HA-pIRES2-EGFP),并实现其在HEK293细胞中的表达.方法 提取大鼠脑组织总RNA,通过巢式RT-PCR扩增κ型阿片受体全长cDNA,将其克隆至pMD20-T载体中并进行测序鉴定,通过PCR引入HA标签,经酶切连接克隆入pIRES2-EGFP中,将获得的κ-HA-pIRES2-EGFP转染入HEK293细胞中,应用荧光显微镜观察EGFP表达情况,并采用细胞免疫荧光和蛋白印迹检测κ-HA表达.结果 测序及酶切结果表明成功获得带HA标签的κ基因,并构建入pIRES2-EGFP表达质粒中,在荧光显微镜下可观察到转染细胞内有绿色荧光,应用免疫荧光和蛋白印迹法可观察到目的 基因表达.结论 利用巢式RT-PCR等技术成功构建了κ-HA-pIRES2-EGFP表达质粒,并在HEK293细胞中实现了高效表达.     

心脏转录因子GATA结合蛋白4真核表达质粒的构建*☆

背景：有研究表明心脏转录因子GATA结合蛋白4(GATA4)与先天性心脏病的发生有密切的关系,但其机制不明,而目前尚未查及GATA4真核表达质粒构建类的报道。 目的：构建人类心脏特殊转录因子GATA4的真核表达质粒。 方法：对重组质粒pUC57-GATA4进行酶切获得GATA4基因编码区序列,将真核表达载体pCMV-Myc和GATA4基因在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pCMV-Myc-GATA4,转化至大肠杆菌,提取质粒后经聚合酶链反应、双酶切及测序鉴定。 结果与结论：实验成功酶切重组质粒获得GATA4基因编码区约1.3 kb的目的片段,聚合酶链反应和酶切鉴定以及基因测序结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的GATA4基因序列,证实成功构建了含有GATA4基因的真核表达重组质粒。     

人野生型parkin基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的 克隆人野生型parkin基因并构建真核表达载体pCDNA3．1—parkin，将重组质粒转染PC12细胞获得高表达人野生型parkin基因的PC12细胞克隆。方法 从胎脑组织中提取总RNA，用RT—PCR方法获得人野生型parkin基因的全长cDNA，插入pCR2．1—TA克隆载体中进行序列测定，测序正确后将其亚克隆至表达载体pCD—NA3．1，利用脂质体将重组质粒转染PC12细胞，经G418筛选获得抗性细胞克隆，采用RT—PCR和Western Blot方法鉴定人野生型parkin基因在PC12细胞中的过表达。结果 经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒，RT—PCR和Western Blot证明经G418筛选得到的转基因PC12细胞克隆中存在人野生型parkin基因的表达。结论 成功构建了人野生型parkin基因的真核表达载体，获得了稳定表达人野生型parkin基因的PC12细胞克隆，为进一步研究parkin的生物学功能以及parkin在帕金森病发病机制中的作用奠定了良好的基础。     

pEGFP-ING4真核表达载体的构建及在人脐静脉内皮细胞中的表达

目的构建携带生长抑制因子4(ING4)基因的真核表达载体pEGFP-ING4并转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC),为进一步研究ING4对胶质瘤血管生成影响提供基础。方法提取人胎盘细胞中总RNA,RT-PCR扩增ING4并克隆至pEGFP-C2载体,酶切电泳鉴定出阳性克隆送测序,利用靶向转染试剂jetPEI-HUVEC转染HUVEC,通过免疫组化检测转染细胞中ING4的表达。结果 成功扩增ING4基因,基因全长747 bp。重组质粒pEGFP-ING4的酶切鉴定及测序结果均证明ING4基因成功克隆到真核表达载体中。酶切片段电泳结果表明:目的条带与ING4的开放读码框大小相符;测序结果和ING4的开放读码框比对相似性为100%。转染重组质粒后的HUVEC中ING4蛋白表达水平增强。结论本实验成功构建携带ING4基因的真核表达载体pEGFP-ING4,并可在HUVEC中获得ING4蛋白的增强表达。     

人可溶性血管内皮生长因子受体1基因克隆及真核表达载体的构建

背景：血管内皮生长因子在肿瘤新生血管的形成中发挥着关键的作用,可溶性血管内皮生长因子受体1能竞争性地抑制血管内皮生长因子诱导新生血管形成的生物学功能。 目的：克隆人可溶性血管内皮生长因子受体基因1,尝试构建可溶性血管内皮生长因子受体1基因的真核表达载体。 设计、时间及地点：基因表达载体构建实验,于2006-10/2007-11在中山大学附属第一医院外科实验室完成。 材料：人脐静脉内皮细胞、pMD-18T载体及pcDNA3载体。 方法：提取人脐静脉内皮细胞总RNA,使用反转录-聚合酶链反应的方法扩增获得到可溶性血管内皮生长因子受体1基因cDNA,并将其克隆至pMD-18T载体中,经酶切及测序证实。然后应用聚合酶链反应的方法从pMD-18T可溶性血管内皮生长因子受体1重组载体中克隆可溶性血管内皮生长因子受体1基因,再将其定向亚克隆至真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达重组体pcDNA3-可溶性血管内皮生长因子受体1,提取质粒进行双酶切、聚合酶链反应及测序鉴定。 主要观察指标：可溶性血管内皮生长因子受体1基因反转录-聚合酶链反应情况及pcDNA3-可溶性血管内皮生长因子受体1真核重组体的构建与鉴定结果。 结果：构建的真核表达重组体pcDNA3-可溶性血管内皮生长因子受体1经过双酶切及聚合酶链反应鉴定,证实其中含有目的可溶性血管内皮生长因子受体1基因;测序结果经比对分析,证实与预期设计的编码区cDNA一致。 结论：应用反转录-聚合酶链反应方法成功从人脐静脉内皮细胞中克隆出可溶性血管内皮生长因子受体1基因,成功构建出了可溶性血管内皮生长因子受体1基因真核表达载体。     

LRRK2 expression linked to dopamine-innervated areas

OBJECTIVE: Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) has been linked to Parkinson's disease. Our study explores the expression of LRRK2 in human and rodent brain tissue. METHODS: We analyzed LRRK2 gene activity at the cellular level using in situ hybridization. RESULTS: We found a high and strikingly specific expression of LRRK2 mRNA in rodent striatum and parts of cortex and no signals in dopamine neurons. In human tissue, LRRK2 mRNA was found in the corresponding brain areas caudatus and putamen at lower levels and dopamine neurons were also devoid of LRRK2 mRNA. Expression levels in striatal tissue did not differ between Parkinson's disease patients and control subjects. INTERPRETATION: Unlike all other genes so far linked to Parkinson's disease, our results demonstrate that LRRK2 expression is particularly high in brain dopaminoceptive areas.     

Vagal complex monocarboxylate transporter-2 expression during hypoglycemia

Astrocytic provision of lactate provision to neurons may be a critical indicator of substrate fuel availability in metabolic sensing sites in the brain, including the hindbrain dorsal vagal complex. We examined the hypothesis that vagal complex monocarboxylate transporter protein levels are gender dependent and estrogen dependent, and that estrogen influences adaptation of these protein responses during repeated insulin-induced hypoglycemia. Western blot analyses showed that male and estrogen-treated ovariectomized female rats exhibit opposite changes in monocarboxylate transporter-2 levels after one insulin injection, as well as divergent patterns of adaptation to this metabolic challenge. The data suggest that sex differences in hypoglycemic patterns in vagal complex lactate transport may underlie disparate signaling of cellular energy imbalance.     

胶质瘤中MMP-2和TIMP-2的表达及意义

目的探讨MMP-2和TIMP-2与胶质瘤侵袭性及恶性表型之间的关系及其意义。方法采用Elivision二步免疫组织化学法染色观察MMP-2和TIMP-2在46例不同恶性度胶质瘤及10例正常脑组织中的表达并用德国LeicaQ550cw图像分析系统测其灰度值作为表达强度的量化指标。结果在对照组、低度及高度恶性胶质瘤中,MMP-2的阳性表达率分别为10%、63.6%和95.8%;在对照组、低度及高度恶性胶质瘤中,TIMP-2的阳性表达率分别为10%、36.3%和37.5%。MMP-2在Ⅰ、Ⅱ级和Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中平均灰度值分别为173.27±13.26和98.63±18.20;TIMP-2在Ⅰ、Ⅱ级和Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中平均灰度值分别为210.44±12.95和205.65±9.75。结论MMP-2表达随胶质瘤恶性程度增加而增强,可作为胶质瘤恶性表型及侵袭性指标之一。TIMP-2表达在正常脑组织及不同级别胶质瘤中无明显差异。MMP-2/TIMP-2的比值与胶质瘤侵袭性密切相关。     

Differential expression of Bcl-2-related proteins in differentiating NT2 cells

Although the role of Bcl-2-related proteins as regulators of the apoptotic process has been well documented, recent studies suggest that they might also be implicated in neuronal differentiation. We have studied by immunocytochemistry, Western blotting and RT-PCR the expression pattern of Bcl-xL, Bcl-2 and BAX in the in vitro model of neuronal differentiation constituted by retinoic acid (RA)-treated NTera-2/D1 (NT2/D1) cells. Whereas BAX level did not change significantly during the RA treatment, Bcl-xL level increased markedly during the first week, before returning to basal level during the second week. Bcl-2 expression, undetectable in undifferentiated cells, increased progressively from the first week. From our results, we suggest that, at least in our model, Bcl-2-related proteins might be involved in neuronal differentiation.     

EphA2在人脑胶质瘤中的表达及意义

目的：探讨EphA2在人脑胶质瘤组织中的表达水平及其意义。方法：采用反转录PCR和免疫组化法检测EphA2 mRNA和蛋白在126例人脑胶质瘤组织中的表达水平;采用ki67免疫组化染色检测肿瘤组织的增殖水平;采用TUNEL染色检测肿瘤组织的凋亡水平;利用统计学方法分析EphA2表达与肿瘤病理分级、增殖和凋亡之间的相互关系。结果：126例肿瘤标本中,51.6%表达EphA2 mRNA,46.8%表达EphA2蛋白。随着肿瘤分级的升高,EphA2 mRNA和蛋白的阳性表达率显著升高。此外,肿瘤细胞增殖水平与EphA2蛋白表达呈正相关,而其凋亡水平与EphA2蛋白表达呈负相关。结论：EphA2表达水平在人脑胶质瘤组织中显著升高,EphA2表达可能影响胶质瘤细胞的增殖和凋亡。     

Increased expression of presenilin 2 inhibits protein synthesis

Mutations in the presenilin genes PS1 and PS2 are a major cause of early onset familial Alzheimer's disease (AD). Previous studies have suggested that presenilins have several functions, including gamma-secretase activity. It was also shown that presenilin expression is increased in the brains of some AD patients and ischemic rodents. The present study examines the effect of increased presenilin expression on protein synthesis. We show here that overexpression of wild-type PS2 (PS2wt) or PS2 mutant containing the FAD mutation N141I (PS2mut) in various cell lines inhibits the synthesis of coexpressed reporter and endogenous proteins. Furthermore, endogenous PS2 seems to be needed for translation inhibition since PS2 null fibroblasts were translationally more active than PS2(+/+) fibroblasts under conditions known to inhibit translation. Overexpression of PS1 also appeared to cause inhibition of protein synthesis, but its effect was much weaker than that of PS2. Taken together, the results suggest that increased expression of PS2 and possibly also of PS1 inhibits translation and that presenilins may function as regulators of protein synthesis.     

基质金属蛋白酶-2在侵袭性垂体腺瘤中的表达

目的　探讨基质金属蛋白酶 2 (matrixmetalloproteinase 2 ,MMP 2 )的表达与侵袭性垂体腺瘤的关系。方法　用免疫组化的方法对 5 4例垂体瘤患者组织标本中MMP 2的表达进行检测。并对其中 16例患者采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)的方法检测了MMP 2mRNA的表达。免疫组化结果用半定量的方法进行分析。结果　 5 4例垂体瘤患者中 ,有 32例女性 ,2 2例男性。其中 ,12例为侵袭性垂体腺瘤 ,4 2例为非侵袭性垂体腺瘤。免疫组化显示 ,侵袭性垂体腺瘤的MMP 2的表达明显高于非侵袭性垂体腺瘤 (分别为 4 .3± 0 .5 ;2 .3± 0 .2 ;P <0 .0 1)。大型垂体腺瘤和微垂体腺瘤 ,以及功能性和非功能性垂体腺瘤的MMP 2的表达则无明显差别。MMP 2的表达与Ki 6 7的表达无明显相关性 (r =$C 0 .0 5 ,P >0 .0 5 )。侵袭性垂体腺瘤MMP 2mRNA的表达 ,明显高于非侵袭性垂体腺瘤 (6 8.3± 15 .3;2 1.8± 8.2 ;P <0 .0 5 )。结论　MMP 2的高表达与肿瘤的侵袭性密切相关。但与肿瘤的大小及分泌功能无明显关系。MMP 2可以作为肿瘤侵袭性一项有效的指标