可溶性白细胞介素6受体β亚基拮抗IL—6信号的研究

ｇｐ１３０是白细胞介素６（ＩＬ－６）受体的β亚基和信号转导子。ＩＬ－６介导的信号转导起始于ｇｐ１３０与ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒα形成的复合体。为了研究ｇｐ１３０胞外区的结构与功能，我们克隆并表达了其胞外区全长及氨基端３０４个氨基酸残基的片段，并在白血病Ｒ２细胞、杂交瘤细胞和肝癌细胞中观察其生物学效应。结果发现，两个片段均拮抗ＩＬ－６信号，从而，证明了含细胞因子结合区的可溶性小片段和大片段都能与膜结合型     

重组CHO细胞高效表达人IL—2Rα链的研究

将人IL-2Ra cDNA导入CHOdhfr~-细胞,经ELISA对180个重组克隆的鉴定,筛选出13株高产克隆,其OD值均大于0.80。再经MTX扩增基因试验,获得了3株更高表达水平的克隆,其OD值分别为1.95、1.86及1.66。稳定性试验表明:MTX诱导前的高效表达水平在30代次时未见改变,MTX的扩增基因效果可维持15—20代次,rIL-2Ra的分子量为50—55kd,具有Tac抗原性和结合IL-2的能力。Southern分析证实:MTX是通过扩增外源基因的份额来提高重组产物的表达水平。本试验为发酵培养重组CHO细胞、大量制备IL-2Ra蛋白奠定了坚实基础。     

gp130胸外区近膜端缺失的突变体介导IL—6信号的研究

研究ｇｐ１３０胸外区远膜端和近膜端在ＩＬ－６信号转导的作用，方法用分子克隆手段构建全长的膜结合型ｇｐ１３０分子和胸外区第３０１－５８２位氨基酸残 的突变体分子，并通过阻滞电泳方法比较突变体与野生型分子在传导信号方面的差异。     

人IL—6在CHO细胞表达及其实验室生产工艺的建立

本文以PKCR6质粒为载体,构建了人IL-6的次级克隆PKCR6-IL-6,并成功地转染了CHO细胞,获得高表达、稳定分泌人IL-6的转基因细胞,由此建立了实验室生产IL-6的基本工艺,即从方瓶过渡到转瓶,经转瓶高密度培养,CHO上清中IL-6含量可以提高近6倍,这为扩大规模生产奠定了一定的基础。     

人可溶性IL-6R及其突变体基因在COS7细胞中的表达及活性分析

目的 研究人可溶性ＩＬ－６Ｒ（ｈｓＩＬ－６Ｒ）的空间构效关系，为小分子拮抗设计提供理论依据。方法：首先利用ＰＣＲ技术扩增天然人ｓＩＬ－６Ｒ基因片段，然后将第２８０位Ｈｉｓ残基突变成Ｉｌｅ。天然基因和突变体基因分别转染ＣＯＳ７细胞，经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｂｌｏｔ检测证实转染细胞上清中的表达产物，并利用ＢｉｎｄｉｎｇａｓｓａｙＥＬＩＳＡ和生物学功能分析法检测表达产物与ＩＬ－６的结合能力以及它们所介     

肝炎肝硬化患者血清sIL—6R和sgp130变化的研究

为了探讨肝炎肝硬化（ＨＣ）患者血清可溶性白介素６受体（ｓＩＬ－６Ｒ）和可溶性ｇｐ１３０（ｓｇｐ１３０）含量的变化及其临床意义，运用酶联免疫吸附法检测了３４例ＨＣ患者血清ｓＩＬ－６Ｒ和ｓｇｐｌ３０含量。结果表明：①活动性和静止性ＨＣ患者血清ｓＩＬ－６Ｒ和ｓｇｐ１３０水平均高于正常对照（Ｐ＜０．０１），ｓＩＬ－６Ｒ／ｓｇｐ１３０比值ＨＣ患者低于正常人，活动性ＨＣ患者低于静止性ＨＣ患者（Ｐ＜０．０１）；②血清ｓＩＬ－６Ｒ和ｓｇｐ１３０水平之间呈正相关（ｒ＝０．４１７，Ｐ＜０．０５），ｓＩＬ－６Ｒ、ｓｇｐｌ３０水平与血清Ｂｉｌ－Ｔ水平间亦呈正相关（分别为ｒ＝０．４７４，ｒ＝０．４８２，Ｐ＜０．０１），而与血清ＡＬＴ水平无明显相关性（分别为ｒ＝０．１９３，ｒ＝０．１５２，Ｐ＞０．０５）。提示：血清ｓＩＬ－６Ｒ、ｓｇｐ１３０与ＨＣ的病情演变有关     

人IL—6和CHO细胞表达及其实验室生产工艺的建立

本文以ＰＫＣＲ６质粒为载体，构建了ＩＬ－６的次级克隆ＰＫＣＲ６－ＩＬ－６，并成功地转染了ＣＨＯ细胞，获得高表达，稳定分泌人ＩＬ－６的转基因细胞，由此建立了实验室生产的ＩＬ－６的基本工艺，即从方瓶过渡到转瓶，经转瓶高密度培养，ＣＨＯ上清中ＩＬ－６含量可以提高近６倍，这为扩大规模生产奠定了一定的基础。     

gp130胞外区近膜端缺失的突变体介导IL-6信号的研究

目的研究ｇｐ１３０胞外区远膜端和近膜端在ＩＬ－６信号转导中的作用。方法用分子克隆手段构建全长的膜结合型ｇｐ１３０分子和胞外区第３０１～５８２位氨基酸残基缺失的突变体分子，并通过阻滞电泳方法比较突变体与野生型分子在传导信号方面的差异。结果通过酶切鉴定、序列分析和表达检测，证明野生型和突变体ｃＤＮＡ表达载体构建正确，并有效表达；阻滞电泳结果表明，在ＳＫＯ－００７细胞和Ｍｏｌｔ－４细胞中，突变体分子与野生型ｇｐ１３０都能介导ＩＬ－６信号。结论ｇｐ１３０分子胞外区远膜端在ＩＬ－６信号转导中发挥重要作用；而近膜端并非ＩＬ－６信号转导所必需。     

人可溶性IL-6R基因在COS7细胞中的表达及活性分析

目的在ＣＯＳ７细胞中表达具有生物学功能的人可溶性ＩＬ－６Ｒ（ｓＩＬ－６Ｒ），作为研究ｓＩＬ－６Ｒ结构与功能关系的基础。方法首先利用ＰＣＲ技术扩增出人可溶性ＩＬ－６Ｒ（ｈｓＩＬ－６Ｒ）编码基因片段，并重组入克隆载体ｐＡＬＴＥＲ－１。通过基因序列分析确定了目的基因的核苷酸序列，并进一步构建了由ＳＶ４０晚期启动子和ＨＣＭＶ早期启动子控制的表达质粒ｐＳＶＬ６Ｒ和ｐＣＭＶ６Ｒ。用脂质体介导的方法将表达质粒转染ＣＯＳ７细胞，并分别在ｍＲＮＡ水平（斑点杂交）和蛋白水平（ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ）检测ｓＩＬ－６Ｒ基因在ＣＯＳ７细胞中的表达。在７ＴＤ１，ＬＴ１２两种ＩＬ－６反应细胞系上检测转染细胞上清（含ｓＩＬ－６Ｒ）的生物学活性。结果在ｍＲＮＡ水平和蛋白水平分别检测到ｓＩＬ－６Ｒ基因在ＣＯＳ７细胞中的表达，表达产物分子量约为５００００。表达产物在７ＴＤ１，ＬＴ１２细胞系上检测到明显的生物学活性。结论天然ｓＩＬ－６Ｒ基因在ＣＯＳ７细胞中的成功表达为进一步制备ｓＩＬ－６Ｒ突变体及其结构与功能关系的研究奠定了基础     

重组人白细胞介素12基因在CHO—dhfr^—细胞的稳定表达

将分别含有重组人ＩＬ－１２（ｒｈＩＬ－１２）两个亚单位ｃＤＮＡ的真核细胞高效表达载体，通过Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导，共转染至ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＾－细胞中。经选择性培养基培养、细胞染色体ＤＮＡ ｄｏｔ ｂｌｏｔ实验、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ实验鉴定，筛选出能表达ｒｈＩＬ－１２的细胞株，经氨甲喋呤加压诱导，表达量约为１５０ｕ／ｍｌ，且经液氮冻存３ｍｏ以上仍有表达。本实验还研究     

CSV—IL—6的构建及其在COS7细胞中的表达

利用基因重组、PCR扩增、定点突变及转译优化等程序,构建了人白细胞介素6重组表达载体CSV-IL-6(1)和CSV-IL-6(2);并利用DEAE-Dextran法转染猴细胞系COS7获得了有生物活性IL-6的暂时性高表达。IL-6ELISA定量测定表达水平:转染后48小时收集的上清CSV-IL-6(1)2573pg/ml,72小时1476pg/ml;CSV-IL-6(2)分别为8261Pg/ml与7101pg/ml。利用IL-6依赖的杂交瘤细胞株7TD1检测转染后48小时收集的培养上清的IL-6生物活性结果为:CSV-IL-6(1)10~4U/ml、3.9×10~9U/mg;CSV-IL-6(2)6.3×10~4U/ml,7.6×10~9U/mg。     

IL—2和IL—2R在过敏性哮喘大鼠淋巴细胞中的表达

ＩＬ┐２和ＩＬ┐２Ｒ在过敏性哮喘大鼠淋巴细胞中的表达①陈巍李电东蔡年生（中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所，北京１０００５０）中国图书分类号Ｒ１３５．２Ｒ５６２．２①本课题受国家自然科学基金资助（编号３９４７０６０４）作者简介：陈巍，男...     

IL—6转基因表达诱导大肠癌细胞凋亡

通过分子克隆技术将ＩＬ－６基因导入大肠癌细胞ＨＴ－２９，建立了目的基因转导株ＨＴ－２９ＩＬ－６细胞，该转导株接种子裸鼠皮下后，与非转导株相比，长出肿瘤的时间延后，最终瘤径明显较小，而且移植瘤标本镜下可见大量的核固缩，核染色质加深，核断裂等凋亡细胞，用携带ＩＬ－６基因的重组逆转病毒液感染大肠癌细胞Ｌｏｖｏ后，仅以１．２５μｍｏｌ／Ｌ的ＶＵＭＯＮ－２６（简称ＶＭ－２６）即可诱导该转染株发生明显凋亡，而     

人可溶性IL—6R突变体H280I生物学特性的初步研究

利用定点突变技术获得的ｓＩＬ－６Ｒ突变体Ｈ２８０Ｉ基因与天然ｓＩＬ－６Ｒ（ｗｔ ｓＩＬ－６Ｒ）基因分别转染Ｃｏｓ７细胞，转染细胞上清在７ＴＤ１、Ｒ２细胞系上测定生物学活性，并同时进行ＩＬ－６Ｒ结合能力分析。结果显示，ｓＩＬ－６Ｒ ｈ２８０Ｉ可以保持同ＩＬ－６的结合能力，同时对ＩＬ－６Ｒ的信号传递过程超拮抗作用，提示Ｈ２８０的改变可能影响ＩＬ－６Ｒ胞外区ｇｐ１３０的结合。     

gp130分子在树突状细胞上表达及其意义

目的 探讨单核细胞向树突状细胞（ＤＣ）分化成熟时,ｇｐ１３０分子在细胞膜上的表达及其意义。方法：从外周血分离得到的单核细胞在含有ＤＣ分化成熟所需的各种因子的培养液中分别培养４ｄ和７ｄ,然后用流式细胞术测定ＤＣ上ｇｐ１３０分子的表达。结果：ｇｐ１３０分子在单核细胞上低表达,经培养分化成熟成为ＤＣ后,ＤＣ上的ｇｐ１３０分子表达被上调,特别是在ＴＮＦα和抗ＣＤ４０刺激型单克隆抗体存在下。结论：ｇｐ１３０     

可溶性gp130和gp130反义核酸对IL-6诱导的靶基因启动子活性的影响

ｇｐ１３０是ＩＬ－６信号转导子，ＩＬ－６介导的信号转导起始于ｇｐ１３０与ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒα形成的复合物。为了研究ｇｐ１３０胞外区的结构与功能，在肝癌细胞ＨｅｐＧ２中建立了检测ＩＬ－６诱导基因表达强弱的方法，并观察了含胞外区全长（５９７个氨基酸）及氨基端３０４个氨基酸残基的ｇｐ１３０突变体，以及ｇｐ１３０反义核酸对ＩＬ－６生物学效应的影响。证明两个突变体和反义核酸均拮抗ＩＬ－６信号，为进一步研究ＩＬ－６受体拮抗剂奠定了基础。