VEGF_(121)反义核酸抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的增殖及血管生成

目的:探讨VEGF121反义核酸对裸鼠胰腺癌移植瘤的增殖及血管生成的影响,探索通过VEGF反义核酸抑制肿瘤生长.方法:将稳定转染有VEGF反义核酸pcDNA3-ASVEGF121的胰腺癌细胞系Bx-PC-3接种于裸鼠背部皮下.将实验鼠分为实验组、对照组和空白组.定期测定裸鼠移植瘤体积,免疫组织化学法检测裸鼠移植瘤VEGF、Flk-1表达水平.测定裸鼠移植瘤微血管密度.结果:VEGF反义核酸转染BxPC-3细胞后,裸鼠胰腺癌移植瘤生长明显减缓.移植瘤VEGF表达明显受到抑制,Flk-1表达水平上调.裸鼠胰腺癌移植瘤微血管密度明显降低.结论:人反义核酸VEGF121能显著抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的增殖,并能抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的血管生成.     

反义缺氧诱导因子-1α对胰腺癌细胞BxPC-3化疗敏感性的影响

目的： 观察反义缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对胰腺癌细胞BxPC-3化疗敏感性的影响。方法：实验分组：（1）缺氧条件下(0.5% O2)体外培养4h，未转染反义HIF-1α质粒的BxPC-3细胞设为缺氧对照组；（2）常氧条件下体外培养，未转染反义HIF-1α质粒的BxPC-3 细胞设为常氧对照组；（3）缺氧条件下(0.5% O2)体外培养4h，稳定转染反义HIF-1α质粒的BxPC-3细胞设为实验组。采用逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)和免疫印迹(Western Blot)检测各组的HIF-1α和survivin表达情况。 流式细胞术和MTT比色法检测不同剂量的化疗药物(5-氟尿嘧啶、阿霉素、吉西他宾)对各组的凋亡率和生长抑制率的影响。 结果：实验组HIF-1α和survivin的表达明显降低 (P<0.05)，与对照组相比，实验组的凋亡率、抑制率与剂量成正比，高剂量引起高抑制(P<0.05)。 结论：反义HIF-1α可能通过阻断survivin的表达而增强胰腺癌对化疗的敏感性。据此可望通过阻断HIF-1α的表达为胰腺癌基因治疗提供一种新途径。     

VEGF-ASODN转染对胃癌细胞VEGF和survivin表达的影响

目的:观察血管内皮细胞生长因子反义寡核苷酸（VEGF-ASODN）转染胃癌细胞SGC-7901对血管内皮生长因子（VEGF）和生存素（survivin）表达的影响。方法:人工合成硫代磷酸化VEGF-ASODN。实验分为5组：对照组，错义组，实验1组(转染浓度为100 ng∕mL),实验2组（转染浓度为400 ng∕mL）及实验3组（转染浓度为700 ng∕mL）。转染后实时荧光定量RT-PCR检测细胞RNA起始拷贝数; ELESA法检测细胞及培养上清液VEGF 蛋白含量; Western-blot法检测细胞生存素蛋白表达量; 流式细胞仪检测细胞凋亡; 细胞生长曲线检测转染对细胞生长的影响。结果:3个实验组VEGF mRNA水平和VEGF蛋白表达量及培养上清液VEGF 蛋白含量均明显降低，survivin蛋白的表达水平随转染浓度的升高而降低，转染VEGF-ASODN能使胃癌细胞凋亡增加、细胞生长减缓。结论:VEGF-ASODN转染胃癌细胞SGC-7901能显著抑制细胞VEGF的表达，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖。     

VEGF-ASODN转染对胃癌细胞VEGF表达及生长的抑制作用

目的研究血管内皮细胞生长因子（VEGF）-反义寡核苷酸（ASODN）转染胃癌细胞SGC-7901对其VEGF表达和生长的抑制作用。方法人工合成硫代磷酸化VEGF-ASODN,转染胃癌细胞SGC-7901,24h后实时荧光定量RT-PCR检测细胞VEGF mRNA起始拷贝数,ELISA法检测细胞及培养液上清中VEGF蛋白含量,Western blot法检测细胞生存素（survivin）蛋白含量,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,用MTT实验检测转染对细胞活性的影响,用细胞生长曲线表示转染对细胞生长的影响。结果VEGF-ASODN能显著降低VEGF mRNA水平、降低胃癌细胞及其培养液中VEGF蛋白含量、降低survivin蛋白含量、增加细胞凋亡、抑制细胞活性及生长（P〈0.05）。结论VEGF-ASODN转染胃癌细胞SGC-7901能显著抑制VEGF和survivin蛋白表达、增加细胞凋亡、抑制细胞生长。     

反义TGF-β1抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的研究

目的应用反义技术抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)体外增殖,为应用基因治疗手段改善创伤愈合提供实验依据.方法应用脂质体将反义TGF-β1转染至KF,通过细胞计数绘制细胞生长动力学曲线,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况.结果①转染反义TGF-β1的KF体外增殖明显降低.②与未转染反义TGF-β1的KF相比,转染反义TGF-β1的KF凋亡发生率明显增高(差异有显著性意义,P＜0.05).结论反义TGF-β1可抑制体外培养的KF增殖,并促进KF的凋亡.     

反义K-ras基因对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨反义K-ras癌基因对胰腺癌细胞增殖和凋亡及Fas/FasL、Bcl-2、Bax表达的影响.方法 将重组逆转录病毒载体pLXSN转染包装细胞PT-67,获得重组逆转录病毒.在细胞和动物水平将该重组逆转录病毒分别感染PC-3和BxPC-3胰腺癌细胞,经G418筛选获得稳定细胞系,应用MTT、流式细胞仪和免疫组化法分别研究其增殖、凋亡及其相关基因表达情况.结果 成功制备含反义K-ras基因的重组逆转录病毒.感染含反义K-ras基因重组病毒后,胰腺癌PC-3细胞和移植瘤(有K-ras基因第12密码子点突变GGT→GTT)增殖受到抑制,G<,0/1>期细胞增加而S期细胞明显减少,细胞凋亡增加.免疫组化显示含反义K-ras癌基因逆转录病毒感染后PC-3细胞Bax/Bcl-2比值升高,Fas表达上调.结论 反义K-ras基因可使胰腺癌细胞及移植瘤增殖受到抑制,并可通过上调Bax/Bcl一2比值和(或)促进Fas表达诱导细胞凋亡.     

转染人高迁移率族蛋白1反义基因对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的　探讨反义高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因对人胰腺癌细胞的抑制作用。方法　应用分子克隆技术构建反义HMGB1基因真核表达载体pcDNA3 1/anti HMGB1,用脂质体法将其导入人胰腺癌细胞PANC 1中,经G4 18筛选获得可稳定表达反义HMGB1的人胰腺癌细胞克隆,通过逆转录聚合酶链反应、免疫印迹法和噻唑蓝比色法检测转染4 8h后胰腺癌细胞HMGB1基因表达和体外增殖活性的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期情况。结果　获得了pcDNA3 1/anti HMGB1真核表达质粒,pcDNA3 1/anti HMGB1转染可使PANC 1细胞HMGB1mRNA和蛋白表达水平显著降低(P <0 .0 1)、肿瘤细胞增殖能力明显受到抑制(P <0. 0 1) ,并出现细胞周期G1期阻滞、凋亡细胞百分数增加。结论　反义HMGB1基因的表达能有效抑制胰腺癌细胞的体外增殖并促进细胞凋亡。     

反义TGF-β1抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的研究

目的 应用反义技术抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞（KF）体外增殖,为应用基因治疗手段改善创伤愈合提供实验依据。方法 应用脂质体将反义TGF－β1转染至KF,通过细胞计数绘制细胞生长动力学曲线,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。结果 ①转染反义TGF－β1的KF体外增殖明显降低。②与未转染反义TGF－β1的KF相比,转染反义TGF－β1的KF凋 亡发生率明显增高（差异有显著性意义,P＜0．05）。结论 反义TGF－β1可抑制体外培养的KF增殖,并促进KF的凋亡。     

人反义VEGF121真核表达质粒的构建及其对胰腺癌细胞VEGF表达的影响

血管内皮生长因子(VEGF)能特异性地刺激血管内皮细胞增殖，在肿瘤的血管生成中发挥着关键作用。胰腺癌作为实体瘤其发生、发展与肿瘤血管生成有着密切的联系。本研究采用分子生物学方法构建人反义VEGF121真核表达质粒，并转染人胰腺癌细胞系BxPC-3，为通过抑制VEGF引起的血管生成来抑制胰腺癌的增殖提供了实验基础。     

二氢青蒿素对胰腺癌生长的抑制作用

目的 探讨二氢青蒿素在体外、体内对胰腺癌的生长抑制作用.方法 通过MTT法检测二氢青蒿素对胰腺癌细胞株生长的抑制作用,Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测BxPC-3细胞中增殖、凋亡相关蛋白的表达.监测给药后胰腺癌裸鼠移植瘤体积的变化,并通过对肿瘤组织标本Ki-67染色和TUNEL染色检测肿瘤细胞增殖和凋亡情况.结果 MTT结果显示,二氢青蒿素可抑制体外培养的胰腺癌细胞BxPC-3和AsPC-1的增殖,诱导细胞凋亡,且呈剂量依赖性.二氢青蒿素亦可通过抑制增殖和诱导凋亡而抑制胰腺癌的体内生长.Western blot检测BxPC-3细胞中蛋白的表达水平,结果显示二氢青蒿素上调增殖相关蛋白p21WAF1、下调PCNA的表达;上调凋亡相关蛋白Bax、下调Bcl-2的表达,且可增加caspase-9的活化水平.结论 二氢青蒿素在体内外对胰腺癌均有抗肿瘤作用,是胰腺癌治疗的潜在药物.     

人反义血管内皮生长因子基因表达对肾癌细胞的影响

目的　探讨人反义血管内皮生长因子 (VEGF)基因对肾癌细胞VEGF表达及生长的影响。　方法　采用RT PCR方法将VEGF基因克隆于 pcDNA3.1反义真核表达载体 ,构建VEGF的pcDNA3.1反义真核表达载体 ,酶切鉴定。转染人肾癌 780 0细胞 ,G4 18筛选阳性克隆。免疫组化法检测VEGF表达 ,MTT法测生长曲线。　结果　pcDNA3.1 (antisense)VEGF组VEGF蛋白表达阳性细胞率 (10 .3% )明显低于 780 0 PC组 (92 .8% )和 780 0组 (96 .6 % ) ,P <0 .0 1;VEGF反义真核表达载体抑制肾癌 780 0细胞生长 ,在培养的第 4、5、6天 ,抑制率分别为 2 6 .38%、4 1.78%和 37.6 4 %。　结论　VEGF的 pcDNA3.1反义真核表达载体可明显降低肾癌细胞VEGF的表达 ,明显减慢肾癌细胞生长。     

TIMP-1 antisense gene transfection attenuates the invasive potential of pancreatic cancer cells in vitro and inhibits tumor growth in vivo

BACKGROUND: TIMP-1 overexpression decreases the invasive potential of pancreatic cancer cells. By tissue inhibitors of metalloproteinase (TIMP)-1 antisense gene transfection, we expected to produce aggressive pancreatic cancer cells with increased in vitro and in vivo invasive potential. METHODS: PANC-1 cells were transfected with either TIMP-1 gene (CD-1), antisense TIMP-1 gene (AS-3), or empty vector (MB-3). The in vitro cell growth kinetics and invasive potential of each cell line were compared. Total and active matrix metalloproteinase (MMP)-2 levels were determined. Each cell line was then implanted in athymic mice and the resultant tumors were compared for size, weight, MMP activity, and TIMP-1 expression. RESULTS: TIMP-1 modulation did not affect cell proliferation in vitro, but its underexpression and, to a lesser extent, overexpression resulted in attenuated tumor growth in vivo. AS-3 cells showed marked decreases in cell invasion and MMP-2 activity in vitro and in vivo. CONCLUSION: TIMP-1 manipulation, particularly underexpression, greatly reduces the invasive potential of pancreatic cancer by limiting MMP-2 activity without affecting in vitro cell growth. TIMP-1 is a reasonable molecular target in pancreatic cancer therapy.     

RhoC基因高表达对胃癌细胞血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子表达的影响

目的 探讨RhoC基因对胃癌细胞血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响及其意义。方法 常规脂质体转染法将RhoC基因重组质粒转染人胃癌细胞系SGC7901；应用免疫细胞化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶(SP)法检测胃癌细胞转染RhoC基因重组质粒前后VEGF、bFGF蛋白表达的变化。结果 转染RhoC基因重组质粒在SGC7901细胞中有稳定表达。转染RhoC基因重组质粒SGC7901表达VEGF、bFGF明显强于对照组。结论 体外条件下RhoC基因可促进胃癌细胞VEGF、bFGF的表达。这可能是RhoC基因促进胃癌细胞侵袭、转移的分子基础。RhoC基因的表达可望作为估计胃癌转移的参考指标。     

COX-2反义RNA抑制肝癌细胞增殖的实验研究

目的 研究COX-2反义RNA对肝癌细胞增殖抑制的作用及其机制,探讨肝癌治疗的新途径.方法 人工合成的COX-2反义RNA片段及无关对照空质粒经脂质体包裹后作用CBRH7919细胞.通过MTT法、细胞周期分析、RT-PCR及裸鼠体内接种等方法测定细胞体内外增殖的变化.结果 经COX-2反义RNA处理的CBRH7919细胞与对照组CBRH7919细胞相比,体外增殖速度减慢(细胞增殖抑制率达78%)、DNA合成受抑(S期细胞数为34.8%vs59.9%),细胞周期G_0/G.比例明显提高,裸鼠体内成瘤率下降(25%vs100%).而凋亡相关基因表达并无明显差异(P>0.05).结论 COX-2反义RNA可有效抑制肝癌细胞的体内外生长增殖,可用于实验性肿瘤基因治疗研究.     

RNA干扰人膜联蛋白A3对胆囊癌细胞增殖的影响

目的 构建人膜联蛋白A3(annexinA3)基因RNA干扰(miRNA)表达载体,体外研究其对人胆囊癌细胞SGC-996的增殖及凋亡作用.方法 构建4组针对annexinA3的pcDNATM 6.2-GW/EmGFPmiR/miRNA表达载体和1组阴性对照序列.脂质体介导瞬时转染人胆囊癌细胞株SGC-996.用RT-PCR和Western印迹检测转染前后annexinA3基因的表达.挑选干扰效率最强的一组表达载体,以MTT法和流式细胞仪检测经miRNA干扰annexinA3对人胆囊癌细胞SGC-996的体外作用.结果 经测序鉴定,annexinA3-miRNA载体构建成功,转染人胆囊癌细胞SGC-996后荧光定量PCR和westem印迹检测显示:annexinA3基因表达及蛋白表达明显降低(P＜0.05);干扰后细胞体外增殖缓慢,增殖明显受抑(P＜0.05).annexinA3基因干扰对细胞周期无明显影响,但能明显增加胆囊癌细胞的凋亡(P＜0.05).结论 AnnexinA3-miRNA表达载体能有效抑制胆囊癌SGC-996细胞annexinA3的表达,抑制肿瘤细胞生长,引起胆囊癌细胞凋亡.AnnexinA3可能是胆囊癌治疗的一个分子靶点.     

HCCR-2反义核酸对肝癌HepG2细胞的作用

目的 研究反义HCCR-2真核表达载体对肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响.方法 构建反义HCCR-2真核表达载体(反义载体组),转染肝癌HepG2细胞,G418筛选阳性克隆,同样方法获得空载体pIRES2-EGFP稳定表达的细胞株(空载体组),取肝癌HepG2细胞为对照(肝癌HepG2组),用MTT法、流式细胞仪、透射电镜观察反义HCCR-2转染前后肝癌HepG2细胞生长曲线、细胞周期、细胞凋亡及细胞形态的变化.采用单因素方差分析和χ2检验比较各组差异.结果 反义载体组、空载体组、肝癌HepG2组HCCR-2 mRNA表达水平分别为0.39±0.04、0.62±0.06、0.72±0.03,3组比较差异有统计学意义(F=43.701,P<0.05);细胞凋亡率分别为13.30%、2.51%、2.07%,反义载体组与空载体组、肝癌HepG2组比较,差异有统计学意义(χ2=6.793,8.721,P<0.05);反义载体组细胞生长减慢,阻滞于G0/G1期.结论 HCCR-2反义核酸真核表达载体能抑制HCCR-2 mRNA的表达,促进细胞凋亡,HCCR-2蛋白可能参与肝癌细胞的周期调控,并与细胞的生长增殖有关.