甲型流感病毒NS1抗原捕获ELISA的建立

目的 建立基于单克隆抗体的甲型流感病毒非结构蛋白1(NS1)抗原检测的酶联免疫吸附(ELISA)法.方法 用甲型流感病毒NS1特异性单克隆抗体,通过抗体的优化组合,建立双抗体夹心抗原捕获ELISA,检测不同来源的流感病毒及副流感病毒.结果 对多种抗体组合进行反复筛选,最终确定了特异性检测到甲型流感病毒的NS1蛋白,而与乙型流感病毒和副流感病毒不发生交叉反应的最佳抗体组合.该方法 检测重组H5N1-NS1[A/HongKong/486/97(H5N1)-NS1和A/Vietnam/1194/04(H5N1)-NS1]蛋白的灵敏度最低检测值分别为15.6 ng/ml和240 pg/ml.结论 成功建立了甲型流感病毒NS1抗原捕获ELISA,为建立甲型流感病毒感染早期诊断新方法 奠定基础.     

甲型流感病毒NS1抗原捕获ELISA的建立

目的 建立基于单克隆抗体的甲型流感病毒非结构蛋白1(NS1)抗原检测的酶联免疫吸附(ELISA)法.方法 用甲型流感病毒NS1特异性单克隆抗体,通过抗体的优化组合,建立双抗体夹心抗原捕获ELISA,检测不同来源的流感病毒及副流感病毒.结果 对多种抗体组合进行反复筛选,最终确定了特异性检测到甲型流感病毒的NS1蛋白,而与乙型流感病毒和副流感病毒不发生交叉反应的最佳抗体组合.该方法 检测重组H5N1-NS1[A/HongKong/486/97(H5N1)-NS1和A/Vietnam/1194/04(H5N1)-NS1]蛋白的灵敏度最低检测值分别为15.6 ng/ml和240 pg/ml.结论 成功建立了甲型流感病毒NS1抗原捕获ELISA,为建立甲型流感病毒感染早期诊断新方法 奠定基础.     

甲型流感病毒NS1抗原捕获ELISA的建立

目的 建立基于单克隆抗体的甲型流感病毒非结构蛋白1(NS1)抗原检测的酶联免疫吸附(ELISA)法.方法 用甲型流感病毒NS1特异性单克隆抗体,通过抗体的优化组合,建立双抗体夹心抗原捕获ELISA,检测不同来源的流感病毒及副流感病毒.结果 对多种抗体组合进行反复筛选,最终确定了特异性检测到甲型流感病毒的NS1蛋白,而与乙型流感病毒和副流感病毒不发生交叉反应的最佳抗体组合.该方法 检测重组H5N1-NS1[A/HongKong/486/97(H5N1)-NS1和A/Vietnam/1194/04(H5N1)-NS1]蛋白的灵敏度最低检测值分别为15.6 ng/ml和240 pg/ml.结论 成功建立了甲型流感病毒NS1抗原捕获ELISA,为建立甲型流感病毒感染早期诊断新方法 奠定基础.     

抗Ⅳ型登革病毒NS1单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:研制Ⅳ型登革病毒(DENV-4)非结构蛋白1(NS1)特异性的单克隆抗体(mAbs),并鉴定其特异性。方法:在表达具有良好抗原性的重组DENV4-NS1蛋白的基础上,用重组DENV4-NS1蛋白和灭活的DENV-4免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合,用间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞,并结合免疫荧光测定法(IFA)和Western blot分析对mAb的特异性进行鉴定;通过竞争抑制试验对mAb识别的抗原位点进行分析。结果:获得15株特异性针对DENV4-NS1的mAbs,与其他3型DENV的NS1不产生交叉反应。mAb的Ig亚类测定均为IgG1。竞争抑制试验显示,15株mAbs存在2个不同识别抗原位点。结论:成功地获得特异性针对DENV4-NS1蛋白的mAbs,为进一步研究DENV4-NS1蛋白的结构与功能及研制DENV-4的临床诊断试剂奠定了基础。     

H5N1流感病毒M1蛋白免疫制备的单克隆抗体的研究

目的 制备抗人流感病毒H5N1株M1蛋白的单克隆抗体,为流感的快速诊断和研究提供新的工具.方法 应用在大肠埃希菌中表达的人H5N1亚型禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)株M1蛋白,以纯化的表达产物免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与sp2/0细胞系作细胞融合后,间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞,并应用间接免疫荧光法对抗体的特异性进行鉴定.结果 获得3株能稳定分泌抗禽流感病毒M1抗原的McAb杂交瘤细胞株,交叉反应试验及间接免疫荧光检测表明,三株McAb具有型特异性.结论 用H5N1禽流感病毒M1蛋白免疫制备的单克隆抗体,具有一定的交叉反应性,可用于多种亚型甲型流感病毒的检测.     

H5N1流感疫苗株在Vero细胞中的研究[英文]

目的产生在Vero(非洲绿猴肾)细胞中能高适应生长的重配H5N1流感病毒疫苗株,并对其生物学特性进行初步测定。方法修饰A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)的NS基因为Vero细胞适应型,并合成NS基因片段,构建质粒pHW2000-NS;通过RT-PCR方法,扩增疫苗株A/Anhui/01/2005(H5N1)的HA、NA基因片段,构建质粒pHW2000-HA、pHW2000-NA;以PR8的其它5个内部基因作为骨架,按照1+2+5模式8质粒共转染Vero细胞拯救流感病毒,并对拯救病毒的生物学特性进行检测。结果由Vero拯救出具有高适应生长特性的H5N1亚型人禽流感病毒疫苗株,并检测了重配疫苗株的生物学特性。结论成功从Vero细胞拯救了具有Vero细胞高适应性生长特性的H5N1亚型人禽流感病毒疫苗株,为应用Vero细胞大规模生产流感疫苗奠定了基础。     

H1亚型流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及部分特性鉴定

目的:制备针对H1亚型流感病毒HA蛋白的单克隆抗体(mAb),并分析其反应特性。方法:分别以2009年甲型H1N1、季节性A1流感病毒裂解疫苗为免疫原,常规法免疫、融合、克隆化,获得各抗原特异性mAb。应用ELISA、HI试验和Western blot等技术研究mAb的反应性和特异性。结果:获得稳定分泌抗H1亚型流感病毒HA蛋白的杂交瘤细胞97株。其中株特异性mAb39株,29株具有HI活性;亚型特异性mAb7株,5株具有HI活性;2009年流行株与季节性A1、A3流行株共同抗原的mAb16株,9株具有HI活性;针对流感病毒共同抗原mAb35株,22株具有HI活性。结论:两种疫苗均具有较好的免疫原性和免疫保护活性,这些mAb的获得为流感病毒株特异、亚型特异性诊断试剂盒及流感病毒通用诊断试剂盒的制备提供了实验资料,为进一步研究H1N1流感病毒HA的抗原表位奠定了基础。     

抗禽流感病毒H7亚型血凝素特异性单克隆抗体的研制

目的:研制禽流感病毒H7亚型血凝素特异性单克隆抗体(mAb)。方法:以H7亚型禽流感诊断抗原为免疫原免疫6～8周雌性BALB/c小鼠,末次加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag-14进行融合。通过HA和HI试验筛选阳性克隆。应用HI试验和Western blot试验测定mAb的反应性和特异性。结果:共获得4株分泌抗AIVH7亚型HAmAbs的杂交瘤细胞株,分别命名为2E2、2A4、5F5、7G5。这些mAb的腹水HI效价在5×27～5×211之间,其中2E2属于IgM亚类,2A4属于IgG1亚类,5F5、7G5属于IgG2a亚类。Western blot分析结果显示,4株AIVH7亚型HAmAb能与AIVH7蛋白在Mr75000处反应,但不与新城疫病毒(NDV)蛋白发生反应,表明这些mAb能特异性识别AIVH7亚型HA。mAbHI反应性测定结果表明:4株mAb中,2E2、5F5、7G5只与H7亚型AIV发生特异性HI反应,而不与其他亚型AIV以及NDV、传染性支气管炎病毒(IBV)反应,显示出良好的特异性;而2A4除了与H7亚型AIV反应外,还与H15N8标准株发生低水平交叉反应。结论:这些mAb不仅为H7亚型AIV的HA结构分析提供了工具,而且为建立快速廉价的H7亚型禽流感诊断方法提供了核心试剂。     

抗禽流感病毒M2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗禽流感病毒M2蛋白的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定.方法:利用纯化的融合蛋白GST-M2免疫BALB/c小鼠,然后以GST-M2 和 GST分别作为ELISA抗原进行筛选,选择GST-M2抗原检测强阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞进行克隆,建立能稳定分泌抗AIV M2 mAb的杂交瘤细胞株.mAb的效价采用间接ELISA和琼脂扩散试验(AGP)测定,用夹心ELISA测定Ig亚类,Western blot、抗原捕获ELISA、间接免疫荧光及免疫组化染色法检测 mAb 的特性.结果:得到4株分泌抗禽流感病毒M2蛋白的mAb的杂交瘤细胞株1E1、2F8、4E3 和 5D6,小鼠腹水中抗体的ELISA效价大于210×100、AGP效价大于1:4.抗体亚类鉴定1E1和4E3为IgG2a,2178和5G6为IgG2b.抗原捕获ELISA表明,2F8 wAb能与H5、H9亚型AIV发生特异性反应,而不能与鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)反应.IFA和免疫组化试验表明,2F8 mAb能够与感染了禽流感病毒的MDCK细胞以及鸡体组织细胞发生特异性结合.结论:本研究获得4株抗禽流感病毒M2蛋白的mAb,其中2F8mAb的效价高、特异性强,可作为检测AIV方法的核心试剂.     

H5N1禽流感病毒NS1蛋白与干扰素诱导蛋白10表达的相关性研究

目的 研究高致病性禽流感(HPAI)H5N1病毒NS1蛋白对干扰素诱导蛋白10(IP-10)的影响.方法 分别将禽流感病毒A/Anhui/1/2005(H5N1)的NS1基因、插入80-84位缺失氨基酸的NS1突变基因及流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的NS1基因克隆至真核表达载体pEGFP-N1,转染人支气管上皮细胞BEAS-2B,流式细胞仪检测转染细胞内IP-10的表达情况.结果 与pEGFP-N1对照组相比,三种NS1蛋白均能下调BEAS-2B细胞IP-10的表达(P<0.01),但三者之间下调程度差异无统计学意义(P>0.01).结论 A/Anhui/1/2005(H5N1)禽流感病毒单一NS1蛋白能够抑制BEAS-2B细胞IP-10表达,但这并不能完全阐明其与病毒致病性之间的关系.     

人H5N1流感病毒M1基因的亚克隆及其在原核细胞的表达

目的 构建人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005 M1蛋白的原核表达系统,为进一步研究M1蛋白的生物学功能和制备其诊断试剂奠定基础。方法 以该病毒基因节段七cDNA为模板,PCR扩增得到M1基因片段。将该片段亚克隆至载体pQE80-L中,构建重组质粒pQE80-L/M1,转化大肠埃希菌BL21（ DE3）。IPTG诱导重组蛋白表达。金属镍离子螯合层析纯化N末端携带多聚组氨酸标签的重组M1蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体。结果 获得了重组M1蛋白,能与抗H5N1亚型流感病毒血清发生特异性结合,且其免疫后能诱导机体产生特异性抗体。结论 成功获得了人H5N1亚型禽流感病毒M1蛋白在原核细胞中高效表达。     

骨桥蛋白单克隆抗体的制备及其特异性分析

为了研制骨桥蛋白(OPN)特异性单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性。本研究在毕赤酵母中表达具有良好免疫原性的重组人OPN蛋白的基础上,用重组人骨桥蛋白(rhOPN)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选杂交瘤细胞,并结合免疫印迹对抗体的特异性进行鉴定,通过竞争抑制试验对单克隆抗体识别的抗原位点进行分析。结果共获得4株能够识别OPN不同抗原位点的mAb,亚类测定显示,3株为IgG1,1株为IgG2a。这些mAb能与重组人OPN特异性结合。本研究的四株抗体中,只有4G2B5能够检出与肿瘤转移密切相关的OPN-c的条带,预示该抗体可用于判断肿瘤预后和高转移肿瘤的临床检测。本研究成功获得了针对骨桥蛋白的特异性mAb,同时为进一步研究OPN蛋白的结构和功能提供了重要工具。     

A new panel of NS1 antibodies for easy detection and titration of influenza A virus

The non‐structural protein NS1 of the influenza A virus is a good target for the development of diagnostic assays. In this study, three NS1 monoclonal antibodies (mAbs) were generated by using recombinant NS1 protein of H5N1 virus and found to bind both the native and denatured forms of NS1. Two of the mAbs, 6A4 and 2H6, bind NS1 of three different strains of influenza A virus, namely H1N1, H3N2, and H5N1. Epitope mapping revealed that residues 42–53 of H5N1 NS1 are essential for the interaction with both mAbs. Between the three strains, there is only one amino acid difference in this domain, which is consistent with the observed cross‐reactivities. On the other hand, mAb 1G1 binds to residues 206–215 of H5N1 NS1 and does not bind NS1 of H1N1 or H3N2. Furthermore, all three mAbs detected NS1 proteins expressed in virus infected MDCK cells and indirect immunofluorescence staining with mAbs 6A4 and 2H6 provided an alternative method for viral titer determination. Quantifying the numbers of fluorescent foci units yielded viral titers for three different isolates of H5N1 virus that are highly comparable to that obtained by observing cytopathic effect induced by virus infection. Importantly, this alternative method yields results at 1 day post‐infection while the conventional method using cytopathic effect yields results at 3 days post‐infection. The results showed that this new panel of NS1 antibodies can detect NS1 protein expressed during viral infection and can be used for fast and easy titration of influenza A virus. J. Med. Virol. 82:467–475, 2010. © 2010 Wiley‐Liss, Inc.     

Monoclonal antibodies to the haemagglutinin HA1 subunit of the pandemic influenza A/H1N1 2009 virus and potential application to serodiagnosis

In order to provide specific serological reagents for pandemic influenza A/H1N1 2009 virus, monoclonal antibodies (Mabs) to recombinant haemagglutinin component HA1 (rHA1) were generated after fusing spleen cells from a mouse immunized with rHA1 protein derived from influenza strain A/California/06/09 H1N1 with a mouse myeloma cell line. Five hybridoma clones secreting Mabs specific for the rHA1 protein derived from pandemic influenza A/H1N1 2009 and not for rHA1 from seasonal H1N1 influenza strains A/Brisbane/59/07 and A/Solomon Islands/03/06 were identified by EIA. Mabs 7H4, 9A4, and 9E12 were reactive in Western blots with full length rHA and/or rHA1 subunit derived from A/California/06/09 strain. Only Mab 1F5 inhibited haemagglutination of turkey red blood cells with recombinant NIBRG‐121 virus derived from A/California/07/09, but did not react in Western blots. Immunostaining of MDCK cells infected with NIBRG‐121 was localized to the membrane/cytoplasm for four of the reactive Mabs. The differing reactivity of the Mabs in Western blots, immunostaining, EIA, and haemagglutination inhibition assay suggest that at least four of the five Mabs recognize different epitopes on HA1 of the pandemic influenza A/H1N1 2009 virus. Ferret antisera to pandemic influenza A/H1N1 2009 (A/England/195/09 and A/California/07/09 strains) and sera from human subjects vaccinated with Influenza A (H1N1) 2009 Monovalent Vaccine (CELTURA®, Novartis Vaccines, Germany), inhibit binding of 1F5‐HRP to biotinylated rHA1 derived from A/California/06/09 in a competitive EIA, suggesting that the epitope recognized by this Mab also evokes an antibody response in infected ferrets and vaccinated humans. J. Med. Virol. 83:559–567, 2011. © 2011 Wiley‐Liss, Inc.