麻疹病毒检测中实时荧光定量RT-PCR的价值分析

目的评价麻疹病毒检测中实时荧光定量RT-PCR的应用价值。方法选取疾病预防控制中心在2013年4月至2014年12月期间收治的70例疑似麻疹病例,采集患者血清标本及咽拭子标本,分别采取酶联免疫吸附试验(ELISA)法、RT-PCR法检测;比较两种检测技术检测结果。结果 ELISA法检测血清标本IgM抗体阳性率10.77%,RT-PCR检测阳性率为24.62%,数据具显著性差异(χ~2=4.279,P=0.039);ELISA法于出疹1～3d内总检测阳性率为42.86%,RT-PCR法于出疹1～3d内总检测阳性率为93.75%,数据差异具显著性(P0.05)。结论对麻疹病毒采取实时荧光定量RT-PCR检测,具较高的灵敏度,操作简单,值得临床推广。     

用麻疹活疫苗制备抗麻疹病毒单克隆抗体及其应用

[目的]制备抗麻疹病毒(MV)的单克隆抗体(单抗,McAb),并用该单抗研制捕获法ELISA检测MV-IgM的诊断试剂盒。[方法]以MV减毒活疫苗免疫Balb/c小鼠,其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗MV的杂交瘤细胞株,以获得该单抗,并对用其研制的检测抗MV-IgM试剂盒进行考核。[结果]获得的杂交瘤细胞株中,B2能稳定分泌高滴度抗MV单抗。经考核,用该单抗酶结合物研制的检测抗麻疹-IgM试剂盒特异性和稳定性良好,与同类商品试剂盒比较,其检出麻疹病例血清抗MV-IgM的时间较早。[结论]应用麻疹减毒活疫苗成功地制备了小鼠杂交瘤细胞,其中B2株能稳定分泌高效的抗MV单抗,用于研制检测抗MV-IgM捕获法ELISA试剂盒,其敏感性、特异性和稳定性令人满意。     

基于麻疹病毒IgG抗体酶联免疫吸附试验的尿素变性亲和力检测方法建立

目的 建立基于麻疹病毒(Measles virus, MV)IgG抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒的尿素变性亲和力检测方法。方法 选取2018-2019年广西MV IgG阳性的麻疹病例血清标本,采用亲和力试剂盒检测MV IgG亲和力。选择低和高亲和力血清标本各6份,在ELISA酶标板中加入尿素处理后,检测IgG浓度,计算IgG浓度下降率;在亲和力试验中改变尿素条件,计算高低亲和力标本的相对亲和力指数(Relative avidity index, RAI)比值,确定本研究方法的最优实验条件。选择100份血清标本同时采用本研究建立的方法和成品试剂盒检测MV IgG亲和力,计算检测一致率。结果 6份低亲和力和6份高亲和力血清标本RAI分别为24%-39%、67%-86%;当4mol/L(pH6.4-7.4)、5mol/L(pH6.4-7.4)和6mol/L(pH6.4-7.0)的尿素处理酶标板后,MV IgG浓度下降率≤48.67%;当尿素条件为4mol/L(1-40min)、5mol/L(1-20min)、6mol/L(1-5min)时,IgG浓度下降率≤47.53%;尿素条件为...     

荧光定量RT-PCR法快速检测麻疹病毒核酸

麻疹是由麻疹病毒引起的一种以发热、呼吸道症状和出疹为特征的急性传染病。目前确诊麻疹的实验室手段主要是用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测麻疹特异性IgM抗体,但在感染初期以及免疫功能低下的患者中该抗体的滴度较低,ELISA法检测可能为阴性[1]。而近年发展起来的荧光定     

麻疹实验室诊断中ELISA法和实时荧光定量RT-PCR法的比较研究

目的比较诊断早期麻疹病毒感染的两种实验室方法,即检测患者血清中特异性IgM抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA）以及检测病毒RNA的实时荧光定量RT-PCR法。方法收集麻疹疑似病例急性期静脉血和咽拭子,采用ELISA法检测血清中麻疹特异性IgM抗体,实时荧光定量RT-PCR法检测咽拭子麻疹病毒RNA。结果142例麻疹疑似病例中,血清ELISA法检测阳性率为30.99%（44/142）,实时荧光定量RT-PCR法检测阳性率为69.72%（99/142）,实时荧光定量RT-PCR法检测阳性率明显高于ELISA法检测阳性率（P<0.001）。综合以上两种方法检测结果,实验室确诊病例总数为106例,总阳性率为74.65%（106/142）,ELISA法灵敏度为41.51%（44/106）,实时荧光定量RT-PCR法灵敏度为93.40%（99/106）。出疹后第1至第3天,ELISA法检测阳性率分别为 23.81%、29.41%、44.83%;实时荧光定量RT-PCR法检测阳性率分别为74.19%、70.77%、80.77%。结论实时荧光定量RT-PCR法灵敏度高于血清ELISA法,更适合于麻疹病毒感染早期的实验室诊断。     

建立快速检测麻疹病毒Ig抗体酶联斑点法及效果评价

「目的」探索快速检测麻疹病毒ＩｇＧ抗体酶联斑点法。「方法」采用硝酸纤维素膜作固相载体，促使抗原、抗体在膜上进行反应时处于高浓度状态，加快反应速度。「结果」检测４８例血清中麻疹病毒ＩｇＧ抗体，如果和板上ＥＬＩＳＡ法一致，特异性、灵敏性、重复性好，判断直观。「结论」适合基层推广应用。     

荧光定量PCR技术在乙型肝炎诊断与治疗上的应用价值

目的 评价荧光定量PCR(FQ-PCR)技术在乙型肝炎(乙肝)的诊断与治疗上的应用价值.方法 采用FQ-RCR和ELISA法,检测258份血清及100例乙肝免疫指标全阴性的对照血清的HBV DNA拷贝数和免疫学指标.结果 123份HBsAg、HBeAg和抗-HBc均阳性的样本中FQ-PCR检测HBV DNA阳性120份,阳性率为97．6％.在108份HBsAg、抗-HBe和抗-HBc均阳性的样本中,FQ-PCR阳性43份,阳性率为39．8％,高于普通PCR 19．8％的阳性率.在100例阴性对照血清中,FQ-PCR全部阴性.结论 FQ-PCR在乙肝诊断、治疗方案选择和疗效观察方面具有广泛的应用前景.     

建立快速检测麻疹病毒IgG抗体酶联斑点法及效果评价

[目的] 探索快速检测麻疹病毒IgG抗体酶联斑点法. [方法] 采用硝酸纤维素膜作固相载体,促使抗原、抗体在膜上进行反应时处于高浓度状态,加快反应速度. [结果] 检测48例血清中麻疹病毒IgG抗体,结果和板上ELISA法一致,特异性、灵敏性、重复性好,判断直观. [结论] 适合基层推广应用.     

实时定量RT-PCR法检测咽拭子中麻疹病毒核酸

目的应用实时定量RT-PCR方法检测咽拭子中麻疹病毒核酸。方法荧光定量real-timeRT-PCR方法检测麻疹病毒核酸;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测麻疹特异性IgM抗体。结果荧光定量RT-PCR方法在咽拭子中检测麻疹病毒核酸的结果是准确的。结论荧光定量RT-PCR方法是一种快速、简便检测麻疹病毒核酸的方法 ,适用于麻疹病毒的早期诊断。     

双重实时逆转录聚合酶链反应检测甲型和乙型流感病毒

目的:建立双重实时荧光RT-PCR方法(DqRT-PCR)以检测甲、乙型流感病毒。方法:设计甲、乙型流感病毒M基因的特异性引物及双标记探针,优化反应条件,建立双重实时荧光RT-PCR方法(DqRT-PCR)。设计甲型流感病毒HA1、HA3亚型的H1、H3、N1、N2基因的特异性引物,建立双重普通RT-PCR(DRT-PCR)方法。对HA1、HA3和B型细胞分离株进行DqRT-PCR和DRT-PCR检测。对80份发热病人咽拭子标本进行DqRT-PCR和DRT-PCR检测及细胞培养分离病毒。结果:DqRT-PCR检测甲型和乙型靶DNA片段(重组质粒)最低极限为1×103拷贝。DqRT-PCR和DRT-PCR对11株H1N1、16株H3N2和12株乙型细胞分离株检测,符合率100%。DqRT-PCR、DRT-PCR和细胞培养分离病毒对80份咽拭子标本的阳性率分别为:37.5%(30/80)、30.0%(24/80)和43.8%(35/80),检出率差异未见统计学意义(2χ=5.5,P>0.05)。与细胞培养分离病毒法比较,DqRT-PCR的阳性和阴性总符合率为73.7%(59/80),阳性预测值为62.9%(22/35),阴性预测值为88.9%(40/45);经配对2χ检验,差异无统计学意义(2χ=0.76,P>0.05)。结论:建立DqRT-PCR可应用于甲型和乙型流感的检测,以多种检测方法互补将有助于提高临床标本的病毒检出率。     

用RT-PCR方法直接检测麻疹病毒血凝糖蛋白(H)基因

目的 应用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）法直接从临床麻疹患者的咽拭子及尿液中检出570bp的特异性H基因目的条带。方法 采集临床确诊为麻疹商例的咽拭子、尿液提取RNA，用RT－PCR方法扩增麻疹病毒血凝糖蛋白的570bp核苷酸片段。结果 22例病人的20份咽拭子样品中，均检测到相应条带，20份尿液中有18份检测到相应条带；采用RT－PCR一次扩增的产物，检测灵敏度即达到0.001 TCID50。结论 麻疹病人唾液样本的RT－PCR阳性率高于尿液，该方法可用于麻疹的病原学的快速辅助诊断，特别是对出疹初期就诊的临床符合，但麻疹IgM阴性的病例可进行进一步确诊。     

普马拉病毒实时荧光定量RT-PCR方法的建立

目的建立一种适应国境口岸地区特定鼠种中普马拉病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法。方法利用Beacon Designer7.0软件设计引物和探针,以人工合成普马拉病毒S基因的片段作为模板,进行实时荧光定量RT-PCR检测,并验证该方法的灵敏度及特异性。结果模板的Ct值与模板稀释浓度的对数存在良好的线性关系,标准曲线y=-3.122x＋38.605,R2=0.995,PCR扩增效率为109.1%,其最低检出限为31.6copies/μl。结论建立的实时荧光定量RT-PCR方法特异性好、灵敏度高,适合于普马拉病毒的快速检测。     

优化的套式核酸体外扩增方法用于甲型流感病毒快速诊断的研究

目的临床上对流感的有效控制与治疗在于实验室快速与准确的诊断,这对于指导用药和避免滥用抗生素具有重要意义。RT_PCR在流感病毒检测中特异性和灵敏度较强,nestedmultiplexRT_PCR法可以在此基础上提高灵敏度。实验的目的是应用分子生物学方法对流感病毒进行快速诊断。方法我们结合流感病毒M基因、NS基因、HA基因的结构和进化特性设计多元引物达到流感病毒的型和亚型准确与快速的鉴定。结果甲型流感病毒以M基因保守区域设计引物,PCR后电泳带为413bp;甲型流感病毒以HA基因分亚型,H1N1亚型PCR后电泳带为348bp,H3N2亚型PCR后电泳带为291bp,H5N1亚型PCR后电泳带为326bp。结论应用优化的套式核酸体外扩增方法进行流感病毒的型与亚型的诊断是比较快速的,且所需要的病毒量少(0.01～0.1TCID50),灵敏度较高。     

用RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测诺沃克病毒的比较分析

目的:研究用不同方法检测诺沃克病毒核酸的阳性率关系,为进一步完善诺沃克病毒核酸的实验室检测提供依据。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及实时荧光逆转录聚合酶链反应(real-tim e RT-PCR)两种方法,对124例腹泻标本进行诺沃克病毒核酸的检测。结果:124份标本中,RT-PCR检出诺沃克病毒阳性31例,阳性率为25%;实时RT-PCR检出阳性37例,阳性率为29.84%;两种方法均阳性的28例,均阴性的84例,符合率为90%;不同性别阳性率无显著性差异;采用实时RT-PCR检测诺沃克病毒,敏感性较RT-PCR高,但两种方法的阳性率无统计学差异。对于强阳性样本(Ct值在20以内或电泳结果特异性条带很亮),两种方法检出率均为100%;对于弱阳性样本,则大部份标本实时RT-PCR检出阳性而RT-PCR未能检出,少部份标本RT-PCR检出阳性而荧光RT-PCR未能检出。结论:对于诺沃克病毒的实验室检测方法,首选实时RT-PCR;在可能的情况下,应该RT-PCR和实时RT-PCR两种方法联用进行检测,以避免发生弱阳性样本漏诊的情况。     

荧光定量RT-PCR快速检测A型流感病毒

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测A型流感病毒的方法。方法根据A型流感M2基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用十倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线并与普通RT-PCR法进行比较;特异性检验后进行临床标本的检验。结果A型流感病毒检测反应的灵敏度为2·56×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0·999,扩增效率为108·5%,5种非A型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法具有很好的稳定性、重现性和特异性。结论本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测A型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。     

蚊类携带甲病毒属病毒CODEHOP RT-PCR检测方珐的建立

目的建立蚊类感染甲病毒属病毒的CODEHOPRT—PCR检测方法。方法依据甲病毒属病毒非结构蛋白氨基酸序列,设计1对CODEHOP引物,建立甲病毒属病毒一步RT—PCR检测方法,分析该引物在对不同种甲病毒基因序列上的结合位点及所能获得的产物序列大小;通过检测甲病毒属基孔肯亚病毒JC2012株,评价该方法的特异性和灵敏度：对JC2012扩增产物进行Blast同源性比对。结果建立的CODEHOPRT-PCR方法可特异性扩增基孔肯亚病毒核酸,目的片段的大小与预期结果相符,核酸的最小检出量为56．7pg。经Blast比对,结果与Genebank公布的CHIKVJC2012序列结果一致。同时从GenBank获得的22种甲病毒均存在CODEHOP引物结合位点．扩增产物大小在510～550bp之间。结论建立的甲病毒CODEHOPRT—PCR检测方法敏感、特异,可用于蚊类甲病毒感染检测。     

汉坦病毒通用型实时荧光定量RT-PCR方法的 建立及应用

摘要:目的　建立一种适应汉坦病毒不同基因型别的通用实时荧光定量RT-PCR检测方法。方法　利用Beacon Designer7.5软件设计引物和探针,以人工合成汉坦病毒5种具有代表性基因型别的L片段作为模板,进行实时荧光定量RT-PCR方法的建立,确定所建立方法的检测限及灵敏度并对采集的112份鼠肺进行快速检测。结果　5种模板RNA的Ct值与其稀释浓度的对数存在良好的线性关系,以HTNV为例建立的标准曲线为:y＝-3.40x+46.8,R2＝0.99,其最低检出限为5.32 copies/μl,对于不同基因型别的汉坦病毒,其检测最低限:HTNV为12.40 copies/μl、SEOV为5.32 copies/μl、PUUV为15.02 copies/μl、DOBV为22.14 copies/μl及SNV为24.26 copies/μl。对112份鼠肺样本的病毒检出率为17.86%,较巢式RT-PCR的检出率（8.04%）高。结论　建立的通用型实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高,检测的广谱性好,适合啮齿类动物中携带的汉坦病毒的快速检测。     

RT-PCR快速检测腮腺炎病毒

目的：建立腮腺炎病毒的核酸快速诊断技术。方法：在腮腺炎病毒核蛋白基因（NP）的保守区域设计一对半引物，采用逆转录聚合酶链（RT-PCR）和半巢式PCR方法扩增腮腺炎病毒特异性核酸片段。结果：该方法能特异性地扩增腮腺炎病毒357bp和232bp的核酸片段，而对麻疹、风疹和流感病毒无交叉反应。检测腮腺炎病毒的灵敏度，1次PCR可检测出10CCID50，2次PCR反应可达0.1CCID50。采用该方法从流行性腮腺炎患含漱液标本中能直接检出腮腺炎病毒核酸条带。结论：该方法能特异、敏感地检测临床标本中腮腺炎病毒，是快速诊断腮腺炎病毒感染的理想方法。     

柯萨奇病毒B3的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的:建立一种检测柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3)的实时荧光定量RT-PCR方法,为临床CVB3的快速、准确检测提供一种新的方法。方法:针对CVB3基因的VP4区和管家基因β-actin的核苷酸序列分别设计了特异性的引物和TaqMan荧光探针,以重组质粒pMD18-T-CVB3为标准品,进行实时荧光定量RT-PCR检测,并构建CVB3的荧光定量RT-PCR标准曲线。结果:建立的方法在1.0×101～1.0×108copies/μl模板范围内具有良好的线性关系(r2>0.999),扩增效率高于98.0%,至少可检测10 copies/μl的阳性标准品。用CVB3感染HeLa细胞来模拟实际样品,灵敏度可达到1.0×101copies。结论:建立的荧光定量RT-PCR具有较高的敏感性、特异性和重复性,可作为CVB3的快速诊断方法,为CVB3感染的临床治疗提供快速可靠的诊断依据。