猪牙源性间充质与胶原类材料复合移植的实验研究

目的：探讨经体外培养的出生后的猪牙源性间充质细胞成牙能力。方法：将体外培养第4代的猪牙胚细胞接种到胶原凝胶基质中,体外培养3d后进行裸鼠体内移植,6W后取材观察。结果：猪牙胚细胞原代培养过程中可见上皮样细胞与成纤维样细胞混杂存在,传代3次后上皮样细胞消失。细胞胶原基质复合物取材结果显示细胞聚集的区域可见牙本质-牙髓复合体样结构。结论：经体外传代培养后未经体外诱导的牙胚细胞接种到胶原凝胶基质所构建的组织工程牙齿有牙本质-牙髓复合体样结构形成,说明牙胚细胞经体外培养后其所获得的发育信息仍可保持,是研究牙齿发育构建模型及组织工程牙齿的理想的种子细胞。     

用人牙源性上皮和间充质细胞构建组织工程化牙齿样结构的实验研究

目的：以人牙源性上皮和间充质细胞作为种子细胞在裸鼠体内构建牙齿样结构。方法：将体外培养的人牙源性上皮细胞和经生长因子诱导后的牙源性间充质细胞分层接种于经塑形的陶瓷化骨或Collagraft三维支架上，将形成的细胞/支架复合物移植到免疫缺陷小鼠的皮下，建立牙源性上皮细胞复合间充质细胞的体内立体培养模型。14～18周后取材，采用HE染色、改良丽春红三色法、免疫组化和原位杂交方法检测移植物中的组织新生情况。结果：细胞在三维支架上形成了包含釉质样组织和牙本质牙髓复合体的牙齿样结构。新生的釉质样组织表达人成釉蛋白，其周围残留的牙源性上皮细胞表达人釉原蛋白mRNA。同时，人DSP蛋白在牙本质样组织中呈阳性表达。所有对照组标本中均未观察到该现象。结论：以优选出并经塑形的三维支架为载体，在裸鼠体内建立牙源性上皮细胞复合间充质细胞的立体培养模型，成功构建出组织工程化牙齿样结构。     

蕾状期成釉器重建体外模型的建立

目的:研究小鼠下颌第一磨牙胚蕾状期:①牙间充质对牙胚上皮发生的控制作用;②原发釉结节对牙胚间充质的定义作用;③牙胚上皮细胞位置信息在牙齿发育中的作用.材料与方法:使用小鼠蕾状期下颌第一磨牙蕾状期牙胚,在体外利用胰蛋白酶解离后的牙间充质与混合牙胚上皮细胞进行了重组培养至14天.结果与结论:结果显示蕾状期牙胚上皮具有高度的可塑性,在丧失了全部位置信息后牙胚上皮细胞仍能在牙胚间充质的诱导下完成成釉器的重建及一系列的组织发生.这表明胚间充质在原釉结节形成时对牙胚上皮组织学发生具有可能的控制作用,即在原釉结节形成前在牙胚间充质中可能已存在有牙齿发生所需的全部信息.而在成釉器的体外重建过程中,牙胚间充质则起到了支架的作用.     

不同时期大鼠牙齿胚基各部分组织发育能力的研究

目的：比较不同发育时期牙胚各部分异位环境下的发育能力,为牙齿再生重组实验提供参考。方法：分离获取SD大鼠帽状期和钟状末期牙胚,分离成釉上皮与牙乳头间充质,分别将完整牙胚、牙间充质、成釉上皮剪碎后异位移植至同种异体大鼠肾被膜下。4周后取材,对移植物进行组织学观察。结果：帽状期牙胚碎组织块移植物中可见部分不规则的牙齿样结构形成。钟状末期牙问充质碎组织块移植组中既有牙本质牙髓复合体样结构形成,还能观察到大量骨样基质形成。而钟状末期成釉上皮碎组织块移植物生成的组织均为骨样的结构。结论：发育早期牙胚的碎组织较发育末期的牙胚碎组织具有更强的牙齿形成能力,所形成的牙齿结构完整包括釉质、牙本质以及牙髓且顺序正确,提示这个时期牙上皮和间充质之间信号网络所提供的微环境可以更加完善和充分地指导牙齿的发育。     

出生后牙胚细胞肾被膜移植的成牙能力研究

目的：将出生后牙胚细胞接种于肾被膜下探讨其成牙能力。方法：通过酶消化法获得出生后4d SD仔鼠第一磨牙牙胚细胞，离心后与明胶海绵支架复合植入大鼠肾被膜下，2周后组织学观察移植物中的组织新生情况。结果：细胞与支架复合体形成了包含釉质样组织和牙本质牙髓复合体的牙齿样结构，形成的硬组织与正常牙齿的形态结构与排列方式相似。Masson’s三色法显示绿色矿化基质形成。结论：出生后牙胚细胞仍保留了牙齿发育的遗传信号，体内移植后牙源性上皮细胞与间充质细胞相互作用，能重新排列构建出与正常牙体组织类似的规则排列结构，在适当条件下具有形成组织工程牙齿的潜能。     

牙胚细胞条件培养液诱导大鼠胚胎面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化

目的：探讨牙胚细胞条件培养液（TGC—CM）在诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中的作用。方法：取妊娠12．5d SD大鼠胎鼠第4代下颌突外胚间充质细胞,在牙胚细胞条件培养液（TGC—CM）的诱导下,通过形态学观察、免疫组化、RT—PCR等方法,探索牙胚细胞条件培养液诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的可能。结果：面突外胚间充质细胞在诱导培养基中生长良好。培养7d,在诱导组中细胞出现核极化,有很长的突起,细胞平行排列。抗牙本质涎蛋白（DSP）呈阳性反应。RT—PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白（DSPP）和牙本质基质蛋白-1（DMP-1）。结论：面突外胚间充质细胞在含有多种细胞因子的TGC—CM的作用下能分化为成牙本质样细胞,能为研究牙齿的分化和发育提供良好的模型和实验依据。     

Pax9——牙齿发育中的关键调控基因

在牙齿发育过程中,Pax9基因局限且持续表达于间充质中,是间充质而非上皮组织的重要调控基因,可作为牙源性间充质的标志物,其表达受限则可导致牙胚的凋亡;它还是使牙胚蕾状期间充质细胞获得牙齿形成诱导能力的基因及缺牙区和切、磨牙区之间最早的差异性表达物。     

Wnt信号通路与牙胚发育

牙齿的发生、分化是牙源性上皮与外胚间充质相互诱导、相互作用的结果。牙胚发育过程中复杂的信号调控体系是近年来口腔科学研究领域的难点和热点。现已初步证实Wnt信号通路是参与牙胚发育过程重要的分子信号调控因子。在牙胚发育过程中,随着Wnt信号通路调控机制的阐明,必将为牙再生的研究提供理论基础。该文就近几年对Wnt信号通路与牙胚发育关系的研究作一综述。     

牙胚发育研究中的辩证思维

牙胚发育是一个连续的复杂过程。在发育过程中 ,上皮组织与外胚间充质组织相互作用 ,上皮层细胞增厚、折叠 ,间充质细胞聚集、增生、分化。随后牙胚发育出现特征性改变。在此过程中 ,主要由于信号分子在上皮 -外胚间充质之间进行信息传递 ,促使细胞向不同方向移行、分化 ,从而形成牙胚。脊椎动物体内多种器官都是上皮 -外胚间充质相互作用的结果形成的。牙胚的形成被认为是研究上皮 -外胚间充质相互作用的最理想模型[1] 。胚胎细胞如何移行至特定的位置 ,形成特定的形状 ,调控它们的基因 ,如何告诉它们每个瞬间所处的位置 ,都是受机体内环境…     

外胚间充质在牙胚形成中的作用及信号调控

颅神经嵴来源的外胚间充质经过定向分化，可形成牙、上下颌骨等组织结构。在牙胚形成过程中，一系列信号分子在上下颌突上皮--外胚间充质之间进行信息传递，相互协同，相互制约。其中骨形成蛋白（Bmps）及成纤维细胞生长因子（Fgfs）在牙齿发育中起重要作用。     

大鼠牙髓干细胞与牙乳头间充质细胞成牙能力的比较研究

目的:探讨采用牙髓干细胞替代牙乳头间充质细胞进行牙齿再生研究的可行性。方法:分别分离培养6周龄SD大鼠切牙牙髓干细胞(DPSCs)和出生1d的SD仔鼠切牙牙乳头间充质细胞(DPMCs),对上述2种细胞的表面标记、增殖能力、体外矿化能力以及向成牙本质细胞分化能力进行比较。结果:DPSCs与DPMCs均具有较强的增殖能力和矿化能力,体外诱导均有成牙本质细胞特异性标记物DSPP基因表达,体内移植后均能够形成牙本质样结构。结论:DPSCs是一种较为理想的牙胚间充质细胞的替代细胞,在适宜的诱导环境中能够替代DPMCs进行牙齿的再生研究。     

甲状旁腺激素对人牙乳头间充质细胞骨形成蛋白3表达的影响

目的 :观察甲状旁腺激素 (parathyroidhormone ,PTH)对人牙乳头间充质细胞骨形成蛋白 3 (bonemorphogeneticprotein ,BMP)表达的影响 ,探讨PTH对人牙乳头间充质细胞的影响及途径。方法 :细胞培养及原位杂交。结果 :体外培养的人牙乳头间充质细胞BMP3mRNA阳性杂交信号较弱 ;细胞经PTH作用 5d后 ,在细胞质内 ,出现BMP3mRNA阳性杂交信号 ,提示PTH可提高细胞合成BMP3的能力。结论 :在PTH的作用下 ,BMP3基因被激活、表达 ,可能起到类似于牙胚发育早期成釉细胞的作用 ,通过自分泌和旁分泌作用参与牙乳头间充质细胞的诱导和分化 ,促进牙本质和牙本质样基质的形成     

人牙源性上皮细胞的体外培养研究

目的：建立人牙源性上皮细胞的体外培养方法，为牙齿组织工程研究提供可靠的种子细胞来源。方法：采用组织块法原代培养人牙源性上皮细胞，用更换培养液类型、多次差别消化法和反复贴壁法进行纯化，在倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况，用免疫荧光法检测细胞表达角蛋白和成釉蛋白的情况。结果：原代培养的人牙源性上皮细胞生长良好，但有少量成纤维细胞混杂，经纯化后明显好转，上皮细胞呈片状生长，表达角蛋白及成釉蛋白。传至第5代后，细胞逐渐变为长梭形，失去上皮细胞形态。结论：体外培养的人牙源性上皮细胞在较长时间内可保持其特性，有望作为牙齿组织工程研究的种子细胞。     

人牙乳头细胞体外矿化特征及其分化表型的表达

目的：观察人牙乳头细胞体外矿化特征。方法：组织块法培养人牙乳头细胞,取第三代细于矿化液中长期培养,检测不同培养时间细胞碱性磷酸酶（alkaline phospha tase,ALP)活性,骨钙素（osteocalcin,OC)活性,且倒置显微镜观察细胞生长。结果：体外培养的牙乳头细胞呈现以下表现特征：复层增长,胞外基质分泌与矿化结节形成。在β-GP和L－抗坏血酸存在条件下培养第14天细胞内ALP活性开始升高而OC在21d才开始升高,有细胞外基质分泌,但未见矿化。35d产生特异性牙本质矿化结节。42天以后,OC、ALP活性降低。结论：培养的人牙乳头细胞具有成牙本质细胞某些表型,可在体外形成牙本质或牙本质样矿化物质,可作为研究牙本质形成机制的实验模型。     

小鼠诱导性多能干细胞向牙源性上皮细胞分化的实验研究

目的：探讨小鼠诱导性多能干细胞（iPS, induced pluripotent stem cell）向牙源性上皮细胞分化的可能性和诱导条件，为牙齿再生提供细胞来源。方法：以成釉细胞无血清条件培养液（ASF—CM）为诱导微环境，定向诱导小鼠iPS细胞向牙源性上皮细胞转化，观察培养后形态改变，细胞免疫荧光及RT—PCR检测成釉蛋白（AMBN，ameloblastin）、釉原蛋白（AMGN，amelogenin）、细胞角蛋白14（CKl4，cytokeratin 14）的表达。结果：小鼠iPS细胞在ASF—CM诱导微环境下，成功分化为牙源性上皮样细胞，呈典型的上皮样细胞形态，免疫荧光及RT-PCR结果显示：AMBN、AMGN、CK14表达阳性，对照组表达阴性。结论：ASF-CM提供了适宜的成牙微环境，能够促进小鼠jPS细胞向牙源性上皮细胞分化。     

大鼠牙乳头细胞复合微孔滤膜形成牙本质样结构的实验研究

目的 观察SD大鼠牙乳头细胞在复合有转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的微孔滤膜上形成牙本质样结构的能力,为组织工程化具有一定规则形状的牙本质提供实验依据.方法 取传代培养的第二代SD大鼠牙乳头细胞消化、离心,所得细胞团与复合有TGF-β1的微孔滤膜相结合,体外培养6 d或体内移植2周,观察附合物上细胞生长和硬组织形成情况.结果 体外培养观察到靠近微孔滤膜的牙乳头细胞发生极化,呈高柱状沿滤膜排列,并有细胞突起伸人材料的多孔结构中,牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)与牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein-1,DMP-1)表达阳性;体内移植2周移植物可见管状基质沿滤膜表面沉积,扫描电镜可见厚度基本一致的管状牙本质样结构,DSP、DMP-1在高柱状细胞、管状基质和邻近的牙乳头细胞中均有表达.结论 复合有TGF-β1的微孔滤膜能够有效趋化和诱导成牙本质细胞前体细胞在其表面分化,并均匀分泌基质,矿化形成结构规则的牙本质样结构.     

aFGF和TGFβ1联合诱导猪牙乳头细胞向成牙本质样细胞分化

目的建立猪牙乳头细胞向成牙本质样细胞分化的体外诱导方案。方法联合应用aFGF和TGFβ1对体外培养的猪牙乳头细胞进行平面诱导,观察诱导后细胞的形态学变化,通过Von Kossa染色检测诱导后细胞的矿化能力,并采用免疫荧光染色和RT-PCR检测成牙本质细胞特异性标志物——DSP蛋白和DSPP mRNA在诱导后细胞中的表达。结果诱导后部分细胞出现细长的单侧细胞突起,在矿化液培养2周后形成典型的矿化结节,并且表达DSP蛋白和DSPP mRNA。结论联合应用aFGF和TGFβ1可以诱导体外培养的猪牙乳头细胞向成牙本质样细胞分化。     

差速传代纯化大鼠牙囊细胞

目的:建立一种简捷的分离培养和纯化大鼠牙囊细胞的方法。方法:分离出生后6dSD大鼠上下颌第一和第二磨牙完整牙胚,剥离牙囊和成釉器,剪碎后酶消化并混合培养,再利用多次差速传代纯化牙囊细胞。结果:原代细胞为牙囊细胞和成釉器细胞混合生长,差速传代培养到第4代可获得纯化的牙囊细胞。倒置显微镜下观察牙囊细胞呈长梭形或三角形,免疫组化染色抗波形丝蛋白阳性,抗角蛋白阴性。结论:利用多次差速传代可从混合培养的原代细胞中获得纯化的牙囊细胞。