异种EGFR口服DNA疫苗抑制小鼠Lewis肺癌的生长

目的：观察表达异种鸡EGFR(chicren EGFR, cEGFR)与 IgGγFc融合基因的口服减毒鼠伤寒沙门菌疫苗对高表达EGFR 的肺癌Lewis细胞小鼠移植瘤生长的抑制作用。方法：将pVAX1-cEGFR-γFc质粒转化减毒沙门菌SL7207,重组菌SL7207/pVAX1-cEGFR-γFc体外感染小鼠腹腔巨噬细胞,免疫荧光法检测cEGFR-γFc融合蛋白的表达。SL7207/pVAX1-cEGFR-γFc重组菌口服免疫小鼠3次后接种Lewis细胞,Western blotting检测小鼠体内融合蛋白的表达,ELISA法检测免疫小鼠血清抗EGFR抗体的水平。接种Lewis细胞14 d后处死小鼠,瘤体称质量,检测SL7207/pVAX1-cEGFR-γFc疫苗对Lewis肺癌生长的抑制作用,测定荷瘤小鼠的生存时间。结果：成功构建减毒沙门菌疫苗SL7207/pVAX1-cEGFR-γFc,SL7207/pVAX1-cEGFR-γFc感染后,在小鼠后体内外都能检测到cEGFR-γFc融合蛋白的表达;SL7207/pVAX1-cEGFR-γFc疫苗口服免疫后小鼠能够产生高水平的抗EGFR抗体,口服SL7207/pVAX1-cEGFR-γFc疫苗能够有效抑制小鼠Lewis移植瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存时间。结论：异种EGFR口服DNA疫苗能够有效地抑制高表达EGFR肺癌的生长,是EGFR分子靶向治疗的一条新途径。     

吉非替尼联合靶向EGFR DNA疫苗对小鼠Lewis肺癌细胞体内外的抑制作用

目的：探讨吉非替尼（gefitinib）联合靶向EGFR DNA疫苗对小鼠Lewis肺癌体内外的抑制作用。方法：用鸡EGFR与兔IgG Fc段异种融合DNA疫苗pVAX1/cEGFRrFc免疫小鼠制备抗血清,ELISA方法测定抗血清的效价。MTT法检测Lewis细胞的生长情况。建立Lewis肺癌鼠移植瘤模型,随机分为疫苗组、吉非替尼组、吉非替尼+疫苗组和对照组,观察各组小鼠肿瘤体积、重量及生存情况。结果：pVAX1/cEGFRrFc DNA疫苗免疫小鼠后抗EGFR血清效价为1∶1 000。与抗血清组或吉非替尼组相比,抗血清+吉非替尼组可显著抑制Lewis细胞的生长（P<0.05)。体内实验显示,吉非替尼+疫苗组小鼠移植瘤生长缓慢, 荷留小鼠生存率显著提高（P<0.01） 。结论：以EGFR为靶点的DNA疫苗和靶向药物吉非替尼之间具有协同性抗肿瘤作用,DNA疫苗主动免疫可以提高吉非替尼的疗效。     

表皮生长因子受体单克隆抗体抗肺癌作用的研究

目的 实验观察表皮生长因子受体单克隆抗体（ＥＧＦＲ ＭcＡb）egf／r３对肺癌的治疗 作用。方法 体外细胞增殖抑制实验采用ＭＴＴ法,裸鼠体内移植瘤采用同时治疗（Ｔ１组）与一治疗（Ｔ２组）两种方案。结果 egf／r３ＭcＡb对高表达ＥＧＦＲ的ＳＰＣ－Ａ１和Ａ５４９肺癌细胞体外均具有增殖抑制作用,并呈剂量依赖性;以ＳＰＣ－Ａ１进行裸鼠皮下移植体内实验,至治疗结束,Ｔ１组与５０％成瘤（３/６）,对照组１００％成瘤（     

KDR基因重组的T7噬菌体疫苗构建及其对小鼠Lewis肺癌抑制作用的研究

目的：构建KDR基因重组的T7噬菌体疫苗以及探讨其对小鼠Lewis肺癌的抗肿瘤作用。方法：克隆KDR的膜外Ⅱ区基因,构建KDR基因重组T7噬菌体疫苗,免疫小鼠,免疫四次后接种Lewis肺癌,观察肿瘤的生长情况,14 d后脱颈椎杀死小鼠,眼球取血、取出瘤体称重,计算抑瘤率,观察抗肿瘤效果。ELISA检测小鼠血清抗KDR抗体滴度。结果：实验组抑制程度明显,肿瘤生长速度最慢,肿瘤重量与生理盐水组和空白噬菌体组相比有统计学差异(P＜0．05),抑瘤率可达57．0%,远大于空白噬菌体组(16．0%)。小鼠血清稀释至1∶500,小鼠特异性抗人源KDR抗体仍呈阳性。结论：KDR基因重组的T7噬菌体疫苗对小鼠Lewis肺癌具有明显的抗肿瘤作用,用人源KDR作为免疫原免疫小鼠通过免疫交叉反应可以打破对自身抗原的免疫耐受,产生特异性的免疫反应。     

口服VEGFR2 DNA疫苗抗小鼠Lewis肺癌血管生成的实验研究

背景与目的血管内皮生长因子(VEGF)及其主要受体血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)在肿瘤新生血管和肿瘤基质形成过程中起着重要作用。本研究的目的是观察口服VEGFR2 DNA疫苗抗C57BL/6小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤生长的作用,并探讨其可能的作用机制。方法将重组DNA疫苗对小鼠进行免疫,通过观察小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤大小,记录各组小鼠离体肿瘤湿重,检测移植瘤微血管密度(MVD)及血液CD3 、CD8 T细胞水平,评价重组疫苗的抑瘤作用。结果疫苗组、空质粒组、生理盐水组的MVD分别为1.75±1.07、6.89±2.52、7.57±3.75,肿瘤湿重分别为(2.05±1.32)、(4.83±1.47)、(5.12±1.02)g,疫苗组与其它两组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。接种肿瘤后,疫苗组CD3 T细胞仍维持较高水平,其它两组明显下降(P<0.05);疫苗组CD8 T细胞水平较其它两组明显升高(P<0.05)。结论口服VEGFR2DNA疫苗对小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤的生长具有较强的抑制作用。该疫苗可能是通过杀伤肿瘤内皮细胞、抑制血管生成而起到抗肿瘤生长的作用。     

小鼠sFlt重组腺病毒抑制小鼠Lewis肺癌的生长

背景与目的实体肿瘤组织的生长具有血管依赖性，肿瘤新生血管生成已证实为肿瘤生长的控制点之一。本研究拟探讨编码小鼠可溶性血管内皮生长因子受体1（sFlt1）的复制缺陷型腺病毒对肿瘤新生血管和肿瘤生长的影响。方法应用小鼠Lewis肺癌细胞（LLC）株建立肺癌模型进行抗肿瘤的研究，以编码sFlt1的复制缺陷型重组腺病毒（sFlt1-Adv）作为治疗组，编码绿色荧光蛋白的复制缺陷型重组腺病毒（GFP—Adv）和生理盐水作为对照组，皮下接种小鼠LLC一周后，经尾静脉给药2次（间隔2周），第二次给药后2周，处死全部实验鼠，剥离肿瘤组织并称重，用3％多聚甲醛固定，用抗CD31作免疫组织化学染色。结果sFlt1—Adv治疗组肿瘤明显小于GFP—Adv对照组和生理盐水组（P％0．01），其抑瘤率达到71．8％；治疗组的肿瘤微血管密度低于GFP-Adv对照组和生理盐水组（P％0．01）。结论复制缺陷型重组腺病毒能抑制肿瘤组织的新生血管形成，从而抑制肿瘤的牛长，有较好的应用价值。     

小鼠Lewis肺癌模型制备方法的比较研究

目的 探讨不同方法制备小鼠Lewis肺癌模型的可行性及相关技术的改良.方法 采用体外培养细胞法、胰酶消化法、胶原酶法和匀浆法制备的不同浓度的细胞悬液皮下注射C57BL/6小鼠,观察不同方法获得的细胞数、成瘤率、成瘤时间、肿瘤体积、离体肿瘤重量、荷瘤鼠的生活习性等,判定改良技术的可行性.结果 体外培养细胞法可以获得所需细胞,成瘤率100%.而胰酶消化法、匀浆法获得的细胞较少,而且成瘤率较低,约80%～90%和60%～75%.胶原酶法则是几种方法中获得细胞数最多的,成瘤率100%.结论 改良后的胶原酶法制备小鼠Lewis肺癌模型具有方法简便、成瘤率高、经济实惠的特点,为肿瘤的实验研究奠定了基础.     

血清循环DNA的EGFR基因突变与肺癌选择性靶向治疗研究

目的:通过血清循环DNA的基因突变检测,筛选EGFR突变型肺癌患者并评估靶向性药物吉非替尼对其的临床疗效。方法:从肺癌患者血清中提取DNA,采用PCR扩增和基因测序检测EGFR突变。结果:116例肺癌血样中检出EGFR突变46例,突变率为39.7%,其中外显子19和21突变分别占65.2%(30/46例)和34.8%(16/46例),EGFR基因突变多见于女性患者和肺腺癌(包括腺鳞癌)患者。对20例肺癌的进一步分析证明,血清EGFR基因突变类型与患者自身肿瘤的突变类型相同。另外通过血清循环DNA基因检测法筛选了19例化疗失败的突变型晚期肺癌进行吉非替尼靶向治疗,客观有效率为52.6%,病情控制率为89.5%,中位无进展生存时间为8个月,中位生存时间为12个月,2年生存率达到33.3%。结论:证实血清循环DNA与肿瘤组织DNA的EGFR基因突变一致;以血清循环EGFR突变检测结果为依据选择分子靶向性药物吉非替尼治疗,对晚期肺癌患者疗效明显。     

EGFR-TKI一线治疗不同EGFR突变状态晚期非小细胞肺癌疗效分析

目的：分析表皮生长因子受体酪氨酸酶抑制剂（EGFR-TKI）一线治疗不同EGFR突变状态（外显子19缺失、21突变）晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的疗效。方法收集徐州市肿瘤医院经组织病理学证实的EGFR突变阳性晚期NSCLC患者72例,分析两种不同EGFR突变状态与一线EGFR-TKI治疗的客观缓解率（ORR）、疾病控制率（DCR）、无进展生存期（PFS）以及总生存期（OS）之间的关系。结果72例患者均进行EGFR基因检测,其中37例为EGFR19外显子缺失,35例为EGFR21外显子突变。72例患者均可评价疗效,其中EGFR19外显子缺失的患者ORR 75．7％,DCR 89．2％;EGFR21外显子突变的患者ORR 51．4％,DCR 68．6％,差异均有统计学意义（χ2＝4．583,P＝0．032;χ2＝4．636,P＝0．031）。EGFR19外显子缺失和21外显子突变的患者校正后的中位PFS分别为13．2个月、10．8个月,差异有统计学意义（χ2＝4．700,P＝0．030）;中位OS分别为30．2个月、25．6个月,差异有统计学意义（χ2＝4．686,P＝0．030）。两组间不良反应无明显差别,皮疹最为常见,两组差异无统计学意义（48．7％∶48．6％,χ2＝0．000,P＝0．995）。结论 EGFR突变状态是晚期NSCLC患者一线EGFR-TKI治疗疗效和OS的预测因素,EGFR19外显子缺失患者的疗效优于EGFR21外显子突变患者。     

重组EGFR噬菌体疫苗抗肿瘤效果的研究

目的构建重组EGFR噬菌体疫苗并且观察其抗肿瘤效果。方法将鸡源EGFR膜外部分的5个基因片段插入到T7噬菌体展示系统中,EGFR蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的外壳蛋白10B上,从而构建成噬菌体疫苗。Western blot方法检测噬菌体壳蛋白上是否有EGFR表达。利用ELISA方法检测免疫小鼠血清中抗EGFR抗体。分离免疫小鼠脾细胞,检测淋巴细胞对靶细胞A431的细胞毒作用。C57小鼠经过4次免疫,接种Lewis肺癌,记录肿瘤的生长情况,评价疫苗的抗肿瘤效果。结果本实验成功构建5种鸡源EGFR噬菌体疫苗。Western blot。显示噬菌体壳蛋白上有EGFR表达。免疫后的小鼠血清中检测到抗EGFR抗体。体外分离脾细胞证明免疫后的小鼠脾细胞对EGFR受体高表达的A431细胞具有杀伤作用。靶细胞和效应细胞的比例在1:10时,最大杀伤率可达(45．74±7．21)％(P<0．001)。肿瘤生长曲线显示免疫后的C57小鼠Lewis肺癌生长受到明显的抑制。结论利用噬菌体展示技术构建的噬菌体疫苗是一种有效的抗肿瘤方法。     

cEGFR-rFc融合DNA疫苗抗小鼠黑素移植瘤的效果

目的:构建cEGFR-rFc融合DNA疫苗, 观察其对小鼠黑素移植瘤的抑制作用.方法:以异种同源鸡EGFR(chicken EGFR,cEGFR)膜外部分与兔疫球蛋白IgG的Fc段(rabbit IgG Fc,rFc)为基础构建真核表达载体pVAX1/cEGFR-rFc,脂质体法转染黑素瘤B16 细胞,免疫荧光法检测融合蛋白在B16细胞中的表达;以融合DNA疫苗免疫C57BL/6J小鼠,Western blotting法检测融合蛋白在小鼠体内的稳定表达.疫苗免疫小鼠接种B16黑素瘤细胞,14 d后处死部分小鼠,取出瘤体称重,计算抑瘤率;同时观察小鼠荷瘤后的生存率;ELASIA法检测DNA疫苗免疫小鼠血清抗EGFR抗体滴度,流式细胞仪测定小鼠脾细胞淋巴细胞亚群.结果:成功构建融合DNA疫苗pVAX1/ cEGFR-rFc,重组载体转染B16细胞后能检测到融合蛋白显著表达,疫苗免疫小鼠后能检测融合蛋白体内稳定表达.融合DNA疫苗能够延缓小鼠黑素移植瘤的生长,抑瘤率为54%(P<0.01);能延长荷瘤小鼠的生存期(疫苗组小鼠接种瘤细胞后30 d的生存率为40%);融合DNA疫苗诱发小鼠产生高滴度抗EGFR抗体(效价1∶1 000)和T细胞免疫(疫苗组小鼠脾脏CD8 T淋巴细胞数目显著增加, P<0.01).结论:cEGFR-rFc融合DNA疫苗能产生有效对抗黑素瘤B16细胞的免疫效应.     

Active antimetastatic immunotherapy in Lewis lung carcinoma with self EGFR extracellular domain protein in VSSP adjuvant

The epidermal growth factor receptor (EGFR) plays a central role in regulating neoplastic processes. The EGFR overexpression in many human epithelial tumors has been correlated with disease progression and bad prognosis. Passive EGFR-directed immunotherapy, but not active specific approaches, has already been introduced in medical oncology practice. Then we wonder if mice immunization with the extracellular domain of murine EGFR (mEGFR-ECD) in adjuvants can circumvent tolerance to self EGFR, by inducing an immune response with consequent antitumor effect. The present study demonstrated that despite mEGFR expression in thymus, strong DTH response was induced by inoculation of mice with the mEGFR-ECD. This self-immunization, using both CFA and very small sized proteoliposomes from Neisseria meningitidis (VSSP), promoted highly specific IgG titers, predominantly IgG2a and IgG2b. Sera from mice immunized with mEGFR-ECD/VSSP not only recognized EGFR+ tumor cell lines by FACS, but also inhibited their in vitro growth, even in the absence of complement. Noteworthy, vaccination of mice with mEGFR-ECD/VSSP stimulated a potent antimetastatic effect in the EGFR+ Lewis lung carcinoma model, while reproduction-associated side effects were absent. Curiously, mice immunized with the human EGFR-ECD (Her1-ECD) in VSSP though induced highly specific IgG antibodies with strong in vitro cytotoxic effect over EGFR+ human cell lines, showed low cross-reactivity with the mEGFR-ECD. These results further encouraged the development of the Her1-ECD/VSSP vaccine project for patients with EGFR+ tumors.     

异种血管内皮生长因子基因重组T7噬菌体疫苗对小鼠Lewis肺癌的抑制作用

背景与目的:肿瘤的生长、转移和新生血管生成有密切关系,血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是已知作用最强、最专一的促血管生成因子。本实验采用噬菌体展示技术,构建人血管内皮生长因子重组T7噬菌体疫苗,并检验疫苗对小鼠Lewis肺癌的抑制作用。方法:用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人肺癌组织克隆出人VEGF165基因,将人VEGF165基因与T7Select10-3b噬菌体基因重组,构建T7Select10-3b_VEGF噬菌体疫苗,制备噬菌体效价达到1×1013pfu/ml。将C57BL/6J小鼠随机分为3组,T7-VEGF疫苗组10只、空白噬菌体组(T7)10只、生理盐水组(NS)10只。将各组样品与等体积弗氏佐剂混合,各组小鼠每只每周分别免疫1×1012pfu/200!l重组噬菌体疫苗、空白噬菌体、生理盐水,共免疫4周。接种Lewis肺癌细胞,观察肿瘤的生长情况和小鼠状态.接种肿瘤14天后,处死小鼠,剥离肿瘤称重,检测小鼠血清中特异性抗VEGF抗体滴度、肿瘤微血管密度(microvesseldensity,MVD)。结果:T7-VEGF疫苗组,T7组、生理盐水组肿瘤均重分别为:(0.543±0.259)g、(0.982±0.359)g、(1.169±0.460)g。疫苗组肿瘤重量明显小于生理盐水组(P<0.01)。疫苗组血清产生抗VEGF抗体滴度为1∶1000。疫苗组、空白噬菌体组、生理盐水组MVD分别为:8.5±0.8,16.4±1.3,18.5±1.6。疫苗组MVD明显小于生理盐水组。结论:异种血管内皮生长因子基因重组T7噬菌体疫苗可干扰机体对自身VEGF的免疫耐受,可产生较高水平的特异性抗VEGF抗体,并具有抑制小鼠Lewis肿瘤生长的效应。     

树突状细胞瘤苗对自体肺癌细胞的杀伤作用

目的: 利用非小细胞肺癌(nonsmallcell lung cancer; NSCLC)患者的树突状细胞(dendritic cell,DC)负载自体肿瘤抗原制备DCCIK(cytokine induced killer cell)瘤苗,观察其在体外对患者自身肿瘤细胞的杀伤作用。方法:提取NSCLC患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuc     

三氧化二砷对小鼠皮下移植性肺癌抑制及其机制的探讨

目的:探讨三氧化二砷(AS2O3)对小鼠肺癌移植瘤的抑制作用,进一步分析其抗血管生成的可能机制.方法:建立Lewis肺癌小鼠移植瘤模型,60只小鼠随机分成阴性对照组、阳性对照组和AS2O3治疗组3组(每组20只),应用AS2O3治疗后,观察肿瘤生长情况计算抑瘤率,免疫组化法检测肿瘤组织内血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)的表达.结果:AS2O3组、阳性对照组、阴性对照组的瘤质量分别为(1 420±60)、(1 500±80)和(2 420±190) mg;AS2O3组和阳性对照组的瘤质量较阴性对照组明显减轻,P＜0.05;AS2O3组的抑瘤率(52％)较阳性对照组(54％)差异无统计学意义,P＞0.05.AS2O3治疗后VEGF、EGFR阳性细胞比例分别为(63.10±5.32)％、(68.33±5.99)％,较阴性对照组[(76.33±10.3)％、(80.50±10.21)％]降低,且差异有统计学意义,P＜0.05.结论:AS2O3对小鼠肺癌移植瘤有显著的抑制作用;下调VEGF和EGFR的表达是AS2O3抗肿瘤血管生成的可能机制.     

角果木ｄｏｌａｂｒａｎｅ型二萜对Ｌｅｗｉｓ荷瘤小鼠的抗肿瘤作用

目的　研究角果木ｄｏｌａｂｒａｎｅ型二萜对Ｌｅｗｉｓ荷瘤小鼠皮下移植瘤的抑制作用,并初步探讨其作用机制。方法　建立Ｌｅｗｉｓ荷瘤小鼠皮下移植瘤模型,随机分为角果木ｄｏｌａｂｒａｎｅ型二萜低、中、高剂量组（５、１０、２０ｍｇ／ｋｇ）、生理盐水组及环磷酰胺组（ＣＴＸ１０ｍｇ／ｋｇ）,各组连续给药１０天,停药后２４小时处死小鼠,称取各组瘤重,计算抑瘤率,观察抑瘤作用。应用流式细胞技术测定肿瘤细胞凋亡率,免疫组化方法检测肿瘤相关转录因子ＮＦ-κＢｐ６５的表达水平。结果　角果木ｄｏｌａｂｒａｎｅ型二萜对肿瘤生长有明显的抑制作用,高、中、低剂量组抑瘤率分别为４４.１２％、２５.７４％和２２.５９％,与生理盐水空白对照组比较差异有统计学意义（Ｐ＜０.０５）,而与ＣＴＸ阳性对照组比较差异无统计学意义（Ｐ＞０.０５）。角果木ｄｏｌａｂｒａｎｅ型二萜各剂量组均未出现明显的脏器毒性。肿瘤细胞的凋亡率随着角果木ｄｏｌａｂｒａｎｅ型二萜剂量的增加而增高,而ＮＦ-κＢｐ６５的表达水平则随其剂量的增加而降低,差异具有统计学意义（Ｐ＜０.０５）。结论　角果木ｄｏｌａｂｒａｎｅ型二萜对Ｌｅｗｉｓ荷瘤小鼠皮下移植瘤的生长具有较明显的抑制作用,且其作用机制可能与肿瘤凋亡和相关转录因子ＮＦ-κＢｐ６５的表达水平降低有关。     

重组耻垢分枝杆菌对小鼠膀胱癌的抑癌效应

背景与目的:BCG膀胱灌注是治疗膀胱肿瘤防止其复发最有效的方法之一,但部分患者疗效差、且有一定副作用。研究新的分枝杆菌菌株将可能进一步降低BCG副作用,提高疗效。本研究探讨重组耻垢分枝杆菌对小鼠膀胱癌的抑癌效应。方法:采用T739可移植性膀胱癌模型,于移植瘤处局部注射重组耻垢分枝杆菌,并用耻垢分枝杆菌、卡介苗(BCG)和磷酸盐缓冲液(PBS)作对照,观察治疗后各组小鼠的肿瘤重量及其存活期。结果:重组耻垢分枝杆菌治疗组小鼠肿瘤瘤重(3.0±1.6)g,显著低于PBS组(6.8±1.3)g(P<0.01),而与BCG组(3.2±1.2)g相比,差异无显著性(P>0.05),抑瘤率为55.95%;重组耻垢分枝杆菌治疗组小鼠存活天数为(30.4±2.5)d,显著长于PBS组(23.2±2.2)d(P<0.05),与BCG组的(29.7±3.2)d相比,差异无显著性(P>0.05),存活延长率为31.23%。同时免疫组化分析表明重组耻垢分枝杆菌能增加肿瘤组织内CD3、CD4、CD8、CD56的表达。结论:重组耻垢分枝杆菌对小鼠膀胱癌具有抑制作用,并能延长膀胱癌荷瘤鼠的生存期。