siRNA联合顺铂抑制骨肉瘤细胞增殖的研究

目的构建人Survivin基因的siRNA真核表达载体,探讨其对骨肉瘤细胞MG63凋亡及顺铂化疗的增敏作用。方法应用pSilencer 3.0-H1 neo,构建Survivin特异性的RNA干涉载体,转染MG63细胞,G418筛选稳定转染的细胞系。半定量PCR和免疫荧光染色分别检测Survivin mRNA与蛋白的水平变化。Annexin V法检测细胞凋亡。MTT法检测顺铂对细胞的杀伤作用。结果构建Survivin基因siRNA真核表达载体PsiS。获得了稳定转染的细胞系。与MG63、阴性对照细胞比较,MG63/PsiS生长曲线则十分平缓。MG63/PsiS细胞中Survivin的mRNA及蛋白表达明显减少。MG63/PsiS凋亡率增加为17.8%(P<0.01)。1 mg/L顺铂作用下,MG63/PsiS死亡率是其他各组的2.3倍(P<0.01)。结论特异性siRNA能够明显阻断Survivin基因的表达促进MG63细胞凋亡,提高细胞对顺铂的敏感性。     

Survivin基因干扰RNA对骨肉瘤MG-63细胞系增殖和凋亡的影响

[目的]观察Survivin基因siRNA表达载体对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响。[方法]体外构建Survivin shRNA表达载体pSilence2．1-neo-Survivin，转染骨肉瘤细胞系MG-63，筛选稳定表达的克隆，倒置显微镜观察各组细胞形态学变化，RT-PCR、Weston-blot方法检测转染后Survivin mRNA及蛋白的表达，噻唑蓝（MTT）法、克隆形成实验检测细胞的增殖情况，吖啶橙荧光染色法观察细胞凋亡情况。[结果]转染后MG-63细胞Survivin基因mRNA水平和蛋白表达显著下降，其抑制率分别为85．08％和81．14％；细胞增殖受到显著抑制，培养48h后与空白组比较，抑制率达63．4l％；吖啶橙染色显示转染组细胞出现明显核碎裂等凋亡改变，转染组凋亡率为24．54％。[结论]靶向Survivin基因的siRNA表达载体可以显著抑制骨肉瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。     

腺病毒介导反义c-myc增强骨肉瘤细胞对顺铂化疗敏感性的实验研究

目的构建表达反义cmyc的重组腺病毒,探讨重组腺病毒介导反义cmyc转染的人骨肉瘤MG63细胞对顺铂化疗敏感性的影响。方法应用基因重组技术,将约720bp的人cmyccDNA反向克隆到腺病毒载体,经重组、扩增、病毒包装后构建表达反义cmyc的重组腺病毒(AdAscmyc),并在体外转染骨肉瘤MG63细胞,采用瑞士染色、吖啶橙染色、蛋白免疫印迹(WesternBlot)、细胞体外增殖抑制试验(MTT)、流式细胞仪(FCM)等观察细胞形态、检测cmyc蛋白表达、瘤细胞体外增殖抑制、凋亡及细胞周期,分析AdAscmyc体外转染的骨肉瘤MG63细胞对顺铂化疗敏感性。结果成功构建AdAscmyc,滴度可达2×109pfu/ml,体外转染MG63细胞48h后,可降低cmyc蛋白表达,并与浓度为2.0、5.0μg/ml的顺铂作用2h后,可抑制MG63细胞的体外增殖,抑制率分为33.4%、54.2%,与对照腺病毒(AdLacZ)转染组相比差异有统计学意义(P<0.05),FCM检测证实AdAscmyc的转染可诱导骨肉瘤细胞凋亡,且顺铂治疗后凋亡比例增加,细胞周期分析显示AdAscmyc转染的骨肉瘤细胞出现G2/M期阻滞。结论腺病毒介导反义cmyc能诱导骨肉瘤MG63细胞凋亡并增加MG63细胞对顺铂化疗敏感性。     

长双链RNA非特异性诱导人骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

目的通过构建能产生长双链RNA的质粒载体,探讨长双链RNA非特异性诱导人骨肉瘤细胞凋亡的可行性。方法以无毒性、完全外源性基因绿色荧光蛋白EGFP基因为RNA模板,使用2个启动子同时从正反向引导DNA序列产生正义和反义链RNA,构建产生长双链RNA的质粒载体。转染人骨肉瘤细胞系MG63,48h后对细胞进行凋亡荧光染色、流式细胞仪及MTT法测定,对数据进行统计学处理。结果成功获得能产生长双链RNA的质粒载体pCI-neo-dsEGFP,MTT法测定显示随着pCI-neo-dsEGFP质粒剂量的增加(0.05μg,0.10μg,0.15μg,0.20μg,0.25μg,0.30μg),细胞的吸光度逐渐减小。转入pCI-neo-dsEGFP组的MG63细胞经凋亡荧光染色呈现大量绿色不规则荧光,出现凋亡现象,而对照组没有出现。流式细胞仪检测结果显示阴性对照组MG63细胞凋亡率为0.028±0.006;pCI-neo-dsEGFP质粒剂量1.0μg时MG63凋亡率为0.175±0.021;2.0μg时凋亡率为0.348±0.032;3.0μg时凋亡率为0.381±0.027;阳性对照组MG63细胞凋亡率为0.386±0.029。随着dsRNA剂量的增加,骨肉瘤细胞生长的抑制效应逐渐增加。当pCI-neo-dsEGFP质粒剂量为3.0μg时,对MG63细胞产生的凋亡效应与100 μl的5-FU(50μg/ml)产生的凋亡效应差异无显著性。结论长双链RNA能非特异性诱导人骨肉瘤细胞发生凋亡,     

反义c-myc寡核苷酸对骨肉瘤细胞(MG-63)凋亡的影响

[目的]研究反义c-myc寡核苷酸(c-mycASODN)对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响。[方法]设计c-mycASODN片段,将其转入人骨肉瘤MG-63细胞,通过HE染色光镜观察、透射电镜超微结构及流式细胞仪(FCM)分析,观察和分析其对瘤细胞凋亡、细胞周期及c-myc基因蛋白表达的影响。[结果]形态学观察到典型瘤细胞凋亡特征;流式细胞仪分析证实反义c-myc寡核苷酸主要阻止瘤细胞从G1期进入S期,即产生G1/S期阻滞,出现明显的凋亡峰,凋亡率达36.82%,并可抑制c-myc基因蛋白的表达。[结论]反义c-myc寡核苷酸可明显诱导人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡。     

反义转化生长因子-β1基因逆转骨肉瘤细胞恶性表型的研究

目的　观察反义转化生长因子 (TGF) β1基因对骨肉瘤细胞恶性表型的逆转作用。方法　将反义TGF β1基因转染骨肉瘤细胞MG 63后 ,以G418(4 0 0mg/L)筛选 14d ,获得转染细胞系。分别检测细胞周期、细胞凋亡和明胶酶A(MMP 2 )表达 ,并观察转染细胞软琼脂克隆形成数和裸鼠体内致瘤能力。结果　与MG 63和空载体转染细胞MG pcDNA3相比 ,反义基因转染细胞MG TGF β1(-)的G0 /G1期细胞从 5 6.2 %和 60 .1%增至 71.6% ,S期细胞从 19.1%和 17.8%降至 12 .9% ,MMP 2mRNA表达明显减少。MG TGF β1( )的软琼脂克隆形成数从 48.6± 8.1和45 .2± 4.7减至 2 8.2± 5 .6,裸鼠体内形成肿瘤的体积 (83 .4± 2 7.4)mm3 也明显小于MG 63组(191.3± 2 1.5 )mm3 和MG pcDNA3组 (2 0 4.2± 3 0 .7)mm3 。结论　反义TGF β1基因转染骨肉瘤细胞可以逆转肿瘤细胞的恶性表型 ,抑制肿瘤的侵袭和转移。     

顺铂诱导人成骨肉瘤耐药细胞系的建立及生物学特性研究

目的：建立顺铂诱导的人成骨肉瘤多药耐药细胞系MG63／R并观察其生物学特性。方法：以顺铂为诱导剂,采用大剂量冲击与逐步增加剂量相结合的方法诱导人成骨肉瘤MG63细胞,建立多药耐药系MG63／R。MTF法检测药物敏感性：光镜、透射电镜观察MG63、MG63／R细胞形态及超微结构变化;生长曲线、克隆形成试验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期、凋亡指数、P—pg、bcl-2、p53蛋白表达。结果：经顺铂186d的诱导建立了MG63／R,MG63／R对顺铂的耐药指数为83．557,对阿霉素、长春新碱、氨甲蝶呤、环磷酰氨亦产生不同程度的交叉耐药;光镜观察可见MG63／R细胞排列不规则,形态呈三角形、多角形及多核现象;透射电镜显示MG63／R细胞表面突起增加,粗面内质网丰富;细胞周期分析显示细胞增殖能力明显增加而细胞凋亡明显降低;MG63／R细胞P—pg、bcl-2阳性表达较MG63细胞明显增加,p53表达则明显降低。结论：本研究建立了稳定的人成骨肉瘤多药耐药细胞系（MG63／R）,为进一步研究顺铂的多药耐药机制和耐药治疗提供了一种新的实验模犁。     

胆囊癌细胞中转染Survivin和bcl-2反义寡核苷酸后凋亡作用的对比研究

目的:比较转染Survivin、bcl -2反义寡核苷酸(ASODN)对胆囊癌细胞系 GBC SD的凋亡促进作用。方法:设计并合成特异性靶向 Survivin及 bcl- 2 的 ASODN。胆囊癌细胞分为 5 组:空白对照组、Survivin ASODN转染组、bcl- 2 ASODN转染组、Survivin SODN转染组和bcl -2 SODN转染组,转染24h后,采用逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)检测Survivin基因、bcl- 2基因表达的变化,流式细胞仪技术检测细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测 ASODN对细胞的生长抑制率。结果:转染 Survivin及bcl 2 ASODN后,胆囊癌细胞内Survivin基因表达下调 47.8%,bcl- 2 基因表达下调 52.4%;细胞凋亡率分别为(11.4±3. 9)%、(7. 3±3. 2)%,与对照组差异有统计学意义(P< 0. 01)。而转染 SurvivinASODN组及bc1 2ASODN组相比差异也有显著性(P<0.05)。两转染组相对于空白对照组的生长抑制率分别为54.3%、41.6%。结论:Survivin和bcl 2反义寡核苷酸均可有效的抑制Survivin及bc1- 2基因的表达,从而诱导胆囊癌细胞的凋亡,两者相比,Survivin反义寡核苷酸可更为有效地诱导胆囊癌细胞的凋亡。     

骨肉瘤中Survivin与Caspase-3的表达及其相关性研究

[目的]探讨Survivin、Caspase-3在骨肉瘤中的表达及其与细胞凋亡的关系。[方法]采用免疫组化法检测骨肉瘤及正常骨组织中Survivin和Caspase-3的表达，运用TUNEL方法检测细胞的凋亡。[结果]在77％的骨肉瘤组织中Survivin阳性表达，显著高于正常组织；Caspase-3蛋白在骨肉瘤和正常组织中的阳性表达率分别为65％和89％，差异有显著性；在骨肉瘤中，Survivin和Caspase-3的表达呈负相关；Survivin呈阳性的骨肉瘤中细胞凋亡指数明显低于Survivin呈阴性组（P〈0．01）；Caspase-3呈阳性的骨肉瘤中细胞凋亡指数明显高于Caspase-3呈阴性组（P〈0．01）。[结论]Survivin、Caspase-3参与了骨肉瘤的发展，Survivin可能通过抑制Caspase-3的活性从而发挥其抑制骨肉瘤细胞凋亡作用。     

TRAIL受体在人骨肉瘤组织中的表达

目的 研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)受体在骨肉瘤细胞中的表达情况。方法 应用逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)对22例骨肉瘤组织标本、MG—63骨肉瘤细胞株、U251脑胶质瘤细胞株以及正常人外周血淋巴细胞TRAILR1—R4 mRNA表达进行检测。结果 22例骨肉瘤组织标本中15例同时表达TRAILR1、-R2和-R3，4例同时表达TRAIL-R1和-R2，只表达TRAIL-R1或-R2者3例，所有标本中均未检测到TRAIL，-R4表达；MG-63骨肉瘤细胞株、U251脑胶质瘤细胞株以及正常人外周血淋巴细胞则均检测到TRAILR1、-R2和-R3的联合表达。结论 死亡受体TRAIL-R1，R2在骨肉瘤中的普遍表达，是TRAIL诱导骨肉瘤细胞凋亡的分子基础；死亡受体和诱骗受体的差异性分布，并非TRAIL对选择性杀伤肿瘤细胞的关键性因素，可能还受其它因子调控。     

人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用

[目的]探讨人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用及其具体作用机制。[方法]MG-63细胞分为空白对照组和CK药物处理组。采用MTT法检测细胞活性及增殖能力,倒置显微镜下观察细胞凋亡形态。细胞凋亡形态检测、Hoechst细胞核染色及Annexin V/PI细胞凋亡实验检测药物CK对细胞的诱导凋亡作用;Western blotting检测凋亡相关蛋白Caspase-9、Bcl-2及BAX的表达,研究其具体凋亡机制。[结果]CK能够显著降低MG-63的体外活性及生存率(P<0.05);细胞凋亡形态检测、Hoechst细胞核染色及Annexin V/PI细胞凋亡实验证明CK可诱导MG-63凋亡(P<0.05);CK处理后MG-63细胞表达的Caspase-9及BAX表达上调,相反Bcl-2表达下调(P<0.05)。[结论]人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63具有凋亡诱导作用,而以Caspase-9为关键因素的线粒体凋亡途径在此凋亡中起着决定性作用。     

反义pEGFP-C1-Survivin对骨肉瘤细胞生物学行为的影响

目的 观察Survivin反义核酸载体对人骨肉瘤细胞株MG-63生物学行为的抑制效应,并探讨其机制.方法 MTY检测转染前后MG-63细胞增殖抑制率的变化,Boyden小室体外侵袭实验测定转染前后侵袭能力变化.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染前后Ang-2基因mRNA表达的变化.结果 噻唑蓝(MTT)检测显示转染后骨肉瘤细胞增殖明显受抑制,转染组抑制率达到23.4%,与各对照组之间差异有统计学意义(P<0.01),脂质体组、空质粒组和空白组之间差异无统计学意义(P>0.05).RT-PCR分析显示转染组MG-63中Ang-2基因mRNA的表达较转染前明显下降,与其他组之间差异有统计学意义(P<0.01),而另3组之间差异无统计学意义(P>0.05).Boyden小室体外侵袭实验测定显示转染组侵袭百分数为17.9%,与其他各组间差异有统计学意义(P<0.01).结论 Survivin反义核酸可以显著抑制人骨肉瘤细胞株MG-63的增殖、侵袭能力,部分逆转其恶性表型,这可能与其下调Ang-2的表达有关.     

腺病毒介导的血管内皮生长因子小干扰RNA对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的研究

目的 观察腺病毒介导的血管内皮生长因子(VEGF)的短发夹状小分子干扰RNA(siRNA)对骨肉瘤细胞株MG63增殖和凋亡的影响.方法 将携带VEGF短发夹状siRNA的腺病毒载体Ad-VEGF-siRNA感染MG63.噻唑蓝(MTT)比色分析细胞体外增殖力,Hoechst染色、流式细胞术观察细胞凋亡.建立30只裸鼠移植瘤模型,Ad-VEGF-siRNA组瘤内注射Ad-VEGF-siRNA病毒纯化液0.2ml,通过免疫组织化学技术,观察肿瘤组织中MG63细胞的增殖和凋亡.结果 与对照组比较,Ad-VEGF-siRNA组MG63细胞生长减慢,Hoechst染色可见到典型的凋亡细胞,24、48、72h凋亡率分别为7.27%、12.01%和20.09%.Ad-VEGF-siRNA明显抑制移植瘤生长,抑瘤率达40.7%.Tunel染色可见MG63细胞典型凋亡特征,同时肿瘤组织中PCNA、bcl-2表达明显减少(P<0.01). 结论 Ad-VEGF-siRNA可高效而特异地阻断VEGF基因表达,抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡.     

靶向Survivin的小分子干扰RNA对骨肉瘤细胞的体内外抑制作用

目的 观察靶向Survivin基因的小分子干扰RNA(siRNA)表达载体对人骨肉瘤细胞MG-63的体内外抑制作用.方法 体外构建Survivin siRNA表达载体pSilence2.1-neo-Survivin,转染骨肉瘤细胞株MG-63、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学(SP)法检测转染前后Survivin mRNA及蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞周期分布,吖啶橙荧光染色法观察细胞凋亡,建立裸鼠移植瘤模型,记录瘤体形成时间及肿瘤生长.结果 转染后MG-63细胞Survivin基因mRNA水平和蛋白表达显著下降,转染后mRAN表达抑制率为85.08%,增殖指数为空白组的28.20%;细胞周期分析显示:shRNA组G0/G1期细胞明显增多,而G2/M期、S期细胞数目减少;吖啶橙染色显示转染组细胞出现明显核碎裂等凋亡改变,转染组凋亡率为24.54%;稳定转染组细胞裸鼠体内致瘤能力降低,转染组成瘤时间为(13.2±2.0)d,空白组为(6.5±1.6)d,两者比较差异有统计学意义(P＜0.01).4周时同空白组相比转染组瘤体体积小62.89%(P＜0.01),重量轻59.07%(P＜0.01).结论 靶向Survivin基因的siRNA表达载体可以显著抑制骨肉瘤细胞MG-63增殖,促进细胞凋亡;明显抑制人骨肉瘤细胞的致瘤活性及裸鼠移植瘤的生长.     

SOX5对骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力的影响

目的 观察Y染色体上的性别决定区相关高迁移率族盒蛋白-5(sex determining region Y-box protein 5,SOX5)对骨肉瘤细胞MG63迁移和侵袭能力的影响,探讨其在骨肉瘤发病和转移中的作用.方法 本研究为前瞻性研究,通过脂质体介导的基因转染技术将SOX5的三个不同的siRNA(siSOX5-1、siSOX5-2和siSOX5-3)瞬时转染骨肉瘤细胞MG63,转染后48 h检测SOX5的mRNA和蛋白表达,从中挑选出干扰效果最明显的siRNA.进而采用博伊登室实验方法分别对干扰前后的骨肉瘤细胞MG63进行体外细胞迁移和侵袭测定,采用免疫印迹(Western blot)检测迁移和侵袭相关蛋白[基质金属蛋白酶(matrix metallproteinase,MMP)-2、MMP-9、Twist1和Snail1)]的表达水平.结果 3条针对人的siRNA(siSOX5-1、siSOX5-2、siSOX5-3)均能够降低SOX5 mRNA及蛋白水平表达,其中siSOX5-3干扰效果最明显.siSOX5-3干扰组的迁移细胞数为(52±5)较对照组的(107±9)显著减少(P<0.05),siSOX5-3干扰组的侵袭细胞数为(27±4)较对照组的(71±2)显著减少(P<0.05).Western blot结果显示siSOX5-3干扰组的侵袭相关蛋白(MMP-2、MMP-9、Twist1和Snail1)的表达均较对照组显著降低(P<0.05).结论SOX5 RNA干扰能显著降低骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力,SOX5能促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭.     

凋亡抑制蛋白Survivin在骨肉瘤中的表达及其与PTEN、cyclinD1蛋白表达的关系

[目的]探讨Survivin基因的表达在骨肉瘤发生、发展中的作用及其与PTEN、cyclinD1蛋白表达的相互关系。[方法]应用免疫组化（SP）法检测40例骨肉瘤组织、20例骨软骨瘤组织中Survivin、PTEN、cyclinD1蛋白的表达情况以及Survivin与PTEN、cyclinD1蛋白两者之间的相关性。[结果]Survivin在骨肉瘤中的阳性率为62．5％（25／40），明显高于对照组骨软骨瘤10．0％（2／20）的阳性率（P〈0．01）。PTEN蛋白在骨肉瘤中的阳性表达率为52．5％（21／40），而在骨软骨瘤中为95．0％（19／20），两者相比有显著差异（P〈0．01）。cyclinD1蛋白在骨肉瘤中的阳性率为80．0％（32／40），高于在骨软骨瘤中的45．0％（9／20），有统计学意义（P〈0．05）。Survivin和PTEN两者表达强度之间呈显著负相关（P〈0．01），而Survivin与cyclinD1表达呈正相关（P〈0．01）。[结论]Survivin在骨肉瘤组织中过表达与骨肉瘤的发生有关；PTEN在骨肉瘤组织中失表达，它可能下调Survivin表达，对骨肉瘤起抑制作用：Survivin和cyclinD1在骨肉瘤的发生发展中可能起协同作用。     

稳定表达TSLC1基因骨肉瘤MG63细胞系的建立及鉴定

目的 建立稳定表达人肺癌抑癌基因-1（TSLC1）骨肉瘤细胞系并对其进行鉴定.方法 脂质体转染的方法 将真核表达载体pCI-TSLC1稳定转染至MG63细胞系,经克隆化培养以及G418筛选,获得了1株稳定高表达TSLC1蛋白的细胞系.对其表达的蛋白性质进行了鉴定,对其分泌动态、细胞纯度、遗传稳定性、外源基因整合等生物学特性做了鉴定.结果 获得高表达TSLC1的稳定细胞系,命名为M8T.生物学性状研究结果 表明该转基因细胞系纯度好,遗传性状稳定,抽提细胞RNA进RT-PCR,扩增到与预期结果 大小一致的DNA片段,说明TSLC1基因成功整合到细胞基因组中.细胞系无细菌和霉菌污染.结论 成功建立了稳定表达TSLC1的骨肉瘤细胞系M8T.该细胞系遗传性质稳定,为进一步研究抑癌基因TSLC1在骨肉瘤中的作用奠定了基础.