αA晶状体蛋白重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的构建携带鼠αA晶状体蛋白的腺病毒表达载体,为进一步研究αA晶状体蛋白高表达对损伤条件下神经细胞的保护作用提供实验基础。方法采用RT-PCR扩增的方法获取鼠源性的αA晶状体蛋白基因,并克隆入穿梭质粒pAdTrack-CMV,构建携带外源性αA晶状体蛋白编码基因的重组腺病毒载体pAd-CRYAA。脂质体法转染人胚肾293细胞,包装产生重组腺病毒Ad-CRYAA。应用PCR鉴定重组腺病毒,空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒。以腺病毒感染滴度快速测定试剂盒测定病毒滴度。结果 PCR、序列测定以及限制性酶切证实αA晶状体蛋白基因正确插入腺病毒表达载体,并在人胚肾293细胞中包装出重组腺病毒。收获病毒的滴度为1.143×1012ifu·L-1。结论成功构建Ad-CRYAA重组腺病毒表达载体,可作为后续研究中可靠的基因转染工具。     

培养牛角膜上皮细胞水通道蛋白功能的表达

目的 研究培养牛角膜上皮细胞水渗透力（ｗａｔｅｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ,Ｐｆ）及水通道蛋白（ａｐｕａｐｏｒｉｎｓ,ＡＱＰｓ）的存在。方法 应用激光散射法（ｌａｓｅｒ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）,测定培养牛角膜上皮细胞自参状态快速转为低渗时体积的改变,并 计算Ｐｆ值：自该细胞提取ｍＲＮＡ注入爪蟾卵。测定卵细胞Ｐｆ值改变。结果 激光散射法测定培养牛角膜上皮细胞Ｐｆ值为７２ｕｍ     

重组腺病毒Ad-EGFP转染大鼠角膜的实验研究

目的评价携带报告基因的重组腺病毒Ad-EGFP经不同转染途径原位转染大鼠角膜的可行性和安全性,探索重组腺病毒载体原位转染大鼠角膜的最佳途径。方法取SD大鼠80只,随机分为A、B、C、D4组,A组、B组:分别于球结膜下注射Ad-EGFP15μL及9g·L-1NaCl注射液15μL;C组、D组:分别前房注射Ad-EGFP15μL及9g·L-1NaCl注射液15μL。各组大鼠分别于注射后1d、5d、7d及14d摘除角膜,行HE染色观察角膜组织有无超微结构改变,共聚焦显微镜观察荧光表达,透射电镜观察有无病毒颗粒存在。结果 4组大鼠于注射当时及整个观察期内角膜组织各层均未见明显超微结构改变,眼前段组织未见明显的组织病理性改变;术后B、D组角膜始终未见绿色荧光的阳性表达,电镜下亦未见病毒颗粒;A、C组注射后1d角膜即可见绿色荧光;5d荧光表达最强,7d时较5d时减弱,14d时更弱。且注射1d后电镜下可见腺病毒颗粒;A组绿色荧光表达位于角膜上皮层及角膜基质层;C组绿色荧光表达仅位于角膜内皮层,角膜上皮层及基质层未见阳性表达。结论携带报告基因的重组腺病毒Ad-EGFP可通过球结膜下注射、前房注射等途径原位转染至大鼠角膜组织,且安全性好;球结膜下注射可使腺病毒携带的报告基因在角膜上皮层及角膜基质层表达;前房注射途径可使腺病毒携带的报告基因在角膜内皮层表达。     

水通道蛋白1与房水的产生及排出的关系

目的研究水通道蛋白(AQP1)在房水的产生、排出及调节机制中的作用.方法运用免疫组织化学法测定人眼房水的产生及排出通路相关组织中AQP1的表达.结果在睫状体非色素上皮、小梁网内皮细胞、Schlemm's管内皮细胞及虹膜基质中有AQP1的表达.结论证实了AQP1在房水的产生及排出通路组织细胞中的表达,为房水的正常代谢及青光眼发病机制的研究提供了分子生物学基础.     

水通道蛋白l与房水的产生及排出的关系

目的 研究水通道蛋白(AQPI)在房水的产生、排出及调节机制中的作用。方法 运用免疫组织化学法测定人眼房水的产生及排出通路相关组织中AQPl的表达。结果 在睫状体非色素上皮、小梁网内皮细胞、Schlemm‘‘‘‘s管内皮细胞及虹膜基质中有AQPl的表达。结论 证实了AQPI在房水的产生及排出通路组织细胞中的表达，为房水的正常代谢及青光眼发病机制的研究提供了分子生物学基础。     

水通道蛋白与年龄相关性白内障关系的研究进展

水通道蛋白(AQPs)结构的研究进一步加深了人们对于这种小分子膜蛋白对水和溶质转运的认识。迄今,在晶状体中有两种AQPs表达被报道,即AQP0和AQP1。我们主要就AQPs在晶状体的分布、功能及与白内障形成的可能关系进行讨论。     

水通道蛋白-0与白内障关系的研究进展

水通道蛋白-O(aquaporin O,AQPO)是存在于晶状体纤维中的主要内在蛋白,经证明有弱的水通道活性,为选择性水通道,参与晶状体的水代谢,有助于维持晶状体的透明性和内环境稳定。术文综述了近年来对 AQPO的研究并重点讨论AQPO和白内障发生机制的关系。     

氯通道蛋白-3和水通道蛋白-1在大鼠半乳糖性白内障晶状体中表达水平的变化

目的研究大鼠半乳糖性白内障晶状体中氯离子通道蛋白-3（CLC-3）和水通道蛋白-1（AQP-1）表达水平的变化,探讨CLC-3和AQP-1与白内障发病的关系。方法健康清洁级Wistar大鼠88只随机分为空白对照组（8只）、生理盐水组（40只）和半乳糖性白内障模型组（Gal组）（40只）。生理盐水组和Gal组根据处理时间不同各亚分为5个亚组,每个亚组8只大鼠。Gal组单侧眼球后注射D-半乳糖生理盐水注射液,生理盐水组同期单侧眼球后注射等体积无菌生理盐水,每日裂隙灯下观察大鼠晶状体混浊的动态变化,并参照Kador等的分级标准分期记录。分别于第1次给药后第3、7、14、21、30天在全身麻醉下处死各组实验大鼠,摘出晶状体,应用实时荧光定量PCR法检测各组晶状体中CLC-3mRNA和AQP-1mRNA含量的变化。结果透明晶状体和半乳糖性白内障晶状体中均有CLC-3mRNA和AQP-1mRNA的表达;生理盐水组各时间点CLC-3mRNA和AQP-1mRNA的表达差异无统计学意义（P〉0.05）;Gal组于3、7、14d时CLC-3mRNA表达逐渐增高,均高于同期生理盐水组,到14d时约达正常水平的7倍,21d、30d时又有所下降,均低于同期生理盐水组（P〈0.01）;各时间点晶状体CLC-3mRNA含量两两比较,差异均有统计学意义（P〈0.01）;模型组于3d时AQP-1mRNA表达已下降,与同期生理盐水组比较差异有统计学意义（P〈0.05）,且随着白内障的进一步发展,AQP-1mRNA含量逐渐降低,均低于同期生理盐水组（P〈0.01）;各时间点晶状体AQP-1mRNA含量两两比较,差异均有统计学意义（P〈0.01）。结论晶状体中CLC-3和AQP-1表达的变化可能与白内障的发生发展有着密切的联系。     

水通道蛋白1在培养人眼小梁细胞中的表达及意义

目的探讨培养人眼小梁细胞水通道蛋白1(AQPl)的存在、定位及意义。方法应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测培养人眼小梁细胞AQP1mRNA的表达。Westernblot用兔抗人AQP1多克隆抗体检测AQP1蛋白表达。免疫荧光测定AQP1在培养人眼小梁细胞的所在部位。结果RT-PCR扩增出一条347bp标志AQP1mRNA的表达产物。Westernblot可见约28000相应位置的发光条带。免疫荧光定位AQP1在培养的人眼小梁细胞胞膜。结论AQP1在培养人眼小梁细胞的细胞膜表达,可能在调节房水通过小梁网流出系统中起到重要作用。     

Package and identification of replication deficient recombinant adenovirus expression vector of Channelrhodopsin-2北大核心CSCD

Background: Channelrhodopsin-2 (ChR2) is a cation channel isolated from the eyespot of Chlamydomonas algae and has been used to control neuron activity. The light stimulation is a more precise fashion whether space or time than that of electrical, magnetic and ultrasound stimulation. Objective: This study was to construct a replication deficient recombinant adenovirus expression vector of ChR2 and to determine its function. Methods: Human embryo kidney 293 (HEK293) cell line was cultured and passaged in DF12 medium containing 10% fetal bovine serum(FBS). The ChR2 gene was cloned at the downstream of cytomegalovirus (CMV) promoter of the adenoviral shuttle plasmid pSB291 in sense direction, and the resultant recombinant plasmid pSB291-hChR2-GFP was transfected into HEK293 cell together with plasmid pBHG lox (deltaE1,3) containing adenoviral genome, then small amounts replication deficient recombinant adenovirus expression vector of ChR2 (Ad-ChR2) was obtained. Through amplification gradient centrifugation and dialysis, pure Ad-ChR2 was obtained. Visual cortex cells derived from 4 1-day-old clean Long Evans rats were primary cultured with serum-free culture media and infected by Ad-ChR2. When expressing green fluorescence, those cells received the stimulated of blue light with 460 nm. Patch clamp technique was applied to record an action potential. Results: After purification and concentration, the titer of Ad-hCHR2 reach ed 7.9×1010 PFU/ml. Twenty-four hours after transfect of Ad-ChR2, HEK293 cell membrane showed the green fluorescence for the recombinant plasmid with green fluorescence protein under the inversed fluorescence microscope. The HEK293 cells change their shape from flat to round 13 days after transfected. The primary cultured visual cortex cells exhibited the green fluorescence 3-5 days after infected by Ad-ChR2. The action potentials evoked by blue light stimulation were recorded with patch clamp on those cells expressing green fluorescence. Conclusions: Ad-ChR2 expressing vector is constructed successfully in this study. It is verified that Ad-ChR2 expressing vector can infect visual cortex cells with visual function. This result is very important for visual plasticity study.     

含抗凋亡基因bcl-2重组逆转录病毒重组体的构建及鉴定

目的:构建并鉴定含鼠bcl-2基因重组逆转录病毒。方法:将抗凋亡基因bcl-2片段从载体pcDNA3.1中切下,定向插入逆转录病毒载体PLNCX2中,酶切鉴定;脂质体法将重组逆转录病毒转入包装细胞系PT67,G418筛选建立稳定表达bcl-2的细胞株。结果:双酶切鉴定,成功构建重组逆转录病毒载体;重组逆转录病毒转入包装细胞PT67,经G418筛选,形成了抗性克隆,并测得病毒滴度为3×1011cfu/L,提示构建的含鼠bcl-2基因重组逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系成功。结论:含抗凋亡基因bcl-2重组逆转录病毒载体构建成功。     

人内皮抑素重组腺病毒的构建及其在人视网膜色素上皮细胞的表达

目的 观察构建的含人内皮抑素(human endostatn,hES)基因腺病毒载体对人视网膜色素上皮(human retinal pigment epitheliaum,hRPE)细胞的感染及其基因表达情况,为眼内新生血管性疾病治疗提供一定的实验依据.方法 原代培养hRPE细胞,行角蛋白免疫组织化学进行鉴定.从真核表达载体pEGFP-N1-ASP-hES将ASP-hES扩增,亚克隆至pAdTrack CMV穿梭质粒中,与pAdEasy 1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组为腺病毒载体,线性化后转染293细胞进行包装扩增.用该腺病毒感染hRPE细胞,应用荧光显微镜和Western blot检测病毒感染及外源基因的表达情况.结果 角蛋白免疫组织化学显示所培养的细胞为hRPE细胞,感染24 h后荧光显微镜下可见RPE细胞中有大量的绿色荧光蛋白表达,Western blot结果显示hES蛋白高表达.结论 构建的hES腺病毒对hRPE具有极高的感染效率,可作为一种良好的基因导入载体,为ES基因治疗眼内新生血管性疾病的进一步研究奠定了基础.     

真核基因重组Sox2及其在小鼠角膜基质细胞中的表达

目的 基因重组构建具有穿膜活性的核转录因子Sox2真核表达系统,将其转染至小鼠角膜基质细胞,检测其在小鼠角膜基质细胞中的表达.方法 利用重叠延伸PCR法重组目的基因Sox2-PTD构建质粒,测序检测重组DNA序列是否克隆正确.确定正确序列后将其转染至小鼠角膜基质细胞.倒置显微镜下观察细胞生长情况,转染后约10 d免疫荧光化学鉴定其表达.结果 成功构建质粒PCDNA3.1-Sox2-PTD;4个转录因子测序结果显示:Sox2基因测序结果与基因模板序列100％一致;成功转染至小鼠角膜基质细胞中;荧光显微镜下观察可见,Sox2-PTD在细胞浆和细胞核内均有表达,主要分布在细胞核内.结论 成功构建核转录因子的真核表达系统,可转染至小鼠角膜基质细胞并引起细胞形态和表型的变化,为真核重组外源蛋白诱导角膜基质细胞转化为多能干细胞奠定基础.     

大鼠PEDF基因的克隆及腺病毒表达载体的构建

目的构建PEDF基因腺病毒表达载体，为基因治疗年龄相关性黄斑变性（AMD）奠定基础。方法从大鼠视网膜组织中提取总RNA，RT—PCR扩增PEDF基因cDNA，并将回收的PEDF基因克隆人质粒pGEM—Teasy载体中，亚克隆人腺病毒表达载体质粒pDC316中，DNA序列分析加以证实。利用腺病毒Admax系统，通过含有目的基因片段PEDF的穿梭载体pDC316／PEDF和病毒骨架质粒共转染293细胞的方法包装出重组腺病毒AdPEDF。Western Blot对重组腺病毒进行鉴定。结果基因测序表明PEDF基因包含了大鼠PEDF基因阅读框内的全部序列，与NCBI Sequence Viewer中公布的大鼠PEDF mRNA序列（NM-177927）完全一致。获得了表达PEDF蛋白的重组腺病毒。结论成功构建了PEDF基因腺病毒表达载体，为进一步研究基因治疗脉络膜新生血管奠定了基础。     

重组腺病毒载体介导色素上皮衍生因子基因抑制视网膜新生血管形成

目的 观察重组腺病毒载体介导色素上皮衍生因子（PEDF）基因对视网膜新生血管（RNV）发生的影响。方法 将20只鼠龄7 d 的Spraque-Dawley大鼠建立模型后随机分为2组，分别于出生后14 d 行玻璃体内注射空白腺病毒载体（AV-Blank组）及编码PEDF基因的重组腺病毒载体（AV-PEDF组），采用RNV内皮细胞计数、运用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫组织化学法检测玻璃体、视网膜中PEDF基因及其蛋白表达的变化。结果 注射药物后AV-PEDF组视网膜的新生血管数较AV-Blank组明显减少（t＝42.009，P＜0.001）；视网膜PEDF蛋白的表达较AV-Blank组明显增加（t=36.638，P＜0.001）；玻璃体组织中的PEDF mRNA表达量也较AV-Blank组明显增加（t=9.128，P＜0.001）。结论 重组腺病毒载体介导的PEDF基因可上调大鼠RNV眼玻璃体及视网膜组织中PEDF的表达；推测PEDF的表达可能与RNV的抑制与消退相关。     

异源双链泳动分析法对流行性角膜结膜炎致病腺病毒分型的研究

背景 目前对流行性角膜结膜炎致病腺病毒的分型多采用直接DNA测序法,而异源双链泳动分析（HMA）法可对腺病毒进行基因分型,且更符合成本-效益原则,HMA法对流行性角膜结膜炎致病腺病毒分型的应用尚少有研究.目的 将流行性角膜结膜炎致病腺病毒六邻体蛋白编码区内保守区的测序结果与HMA的结果进行对照,评价HMA法在流行性角膜结膜炎病原体检查中的有效性和可行性.方法 在知情同意的情况下收集2010年1月至2012年12月在上海市眼病防治中心和上海市急性出血性结膜炎防控办公室下属红眼病监测站点就诊的可疑流行性角膜结膜炎患者214例,取患者结膜囊的结膜拭子标本214份.使用QIA-amp minikit提取结膜拭子标本中的病毒DNA,然后通过PCR法扩增病毒DNA六邻体蛋白编码区内366 bp的保守序列,并对该片段进行基因测序,确定是否为腺病毒及其分型.采用HMA法同时对PCR扩增产物进行分析,将HMA结果与基因测序法进行比较.结果 使用QIA-amp minikit提取的病毒基因组DNA经质量分数1％琼脂糖凝胶电泳可见边界清楚的长约35 kb的金黄色荧光条带,无拖尾现象,DNA吸光度比值（A260/A280）约为1.7.214例患者中,经PCR检测确定为腺病毒感染者109例,经基因测序确定为腺病毒l型（AdVl）者4例,AdV2者33例,AdV3者15例,AdV4者12例,AdV8者19例,AdV19者15例,AdV37者8例.HMA法可以鉴别AdV1、AdV2、AdV3、AdV8、AdV19和AdV37,其结果与基因测序结果一致.AdV4的DNA突变点为59.6％,超过10％,不适合HMA法.结论 针对六邻体蛋白编码区内保守区域的基因测序是腺病毒分型的重要方法之一,可以快速确定流行性角膜结膜炎是否系腺病毒感染引起,并可以确定腺病毒分型.HMA的结果与基因测序相一致,可作为大规模分子流行病学调查的检测工具.     

siRNA-LEDGFp52真核表达载体的构建和鉴定

目的构建晶状体来源的上皮生长因子p52（lens epithelium deftved growth factor p52，LEDGFp52）基因RNA干扰（RNA interference，RNAi）的真核细胞表达载体。方法以LEDGVpS2为靶基因，以pCensil-1质粒为载体，设计构建重组体，根据GenBank数据库提供的LEDGFp52基因核苷酸序列，按照Tuschl设计原则，选择设计2条带发夹结构的核苷酸序列，克隆到空载体pGensil-1中，转化DH50t菌株，提取质粒，进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。结果经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致，重组载体构建成功，重组质粒转染HeLa细胞48h，Western blotting检测到LEDGFp52蛋白表达的改变。结论利用RNAi技术可成功构建抑制LEDGFp52表达的小干扰RNA重组体。[眼科新进展2,007；27（3）：184．187]     

大鼠β-防御素2真核表达载体构建及转染大鼠角膜上皮细胞的研究

目的：应用基因工程技术构建含大鼠β-防御素2(rat beta defensin 2,rBD-2)目的基因的真核重组质粒,通过脂质体法转染大鼠角膜上皮细胞,检测目的基因在转染细胞中的表达,探讨应用该载体获得重组rBD-2在眼表细胞中表达的可行性,并为进一步研究rBD-2的体内外抗微生物活性提供实验基础,以期为感染性角膜病防治提供新方法。

方法：将采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成rBD-2 DNA片段连接到真核表达载体pIRES2-ZsGreen1的XhoⅠ与BamHⅠ酶切位点之间,构建pIRES2-ZsGreen1-rBD-2真核重组表达载体,重组质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,卡那霉素筛选出阳性克隆子,经酶切、测序鉴定重组载体构建成功后,采用脂质体法转染大鼠角膜上皮细胞,此处实验分为三组即重组载体pIRES2-ZsGreen1-rBD-2转染的大鼠角膜上皮细胞组、未转染的空细胞组以及空载体pIRES2-ZsGreen1所转染的大鼠角膜上皮细胞组,在倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况,最后经实时荧光定量RT-PCR相对定量法检测各组转染细胞中rBD-2基因mRNA的表达差异。

结果：成功构建pIRES2-ZsGreen1-rBD-2真核重组质粒,应用实时荧光定量RT-PCR相对定量法检测到重组质粒pIRES2-ZsGreen1-rBD-2转染组的大鼠角膜上皮细胞中rBD-2基因的mRNA表达水平明显多于另两组。

结论：应用基因工程技术构建的rBD-2真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-rBD-2,通过脂质体法转染大鼠角膜上皮细胞,能够使外源rBD-2基因在大鼠角膜上皮细胞中被转录成mRNA。