CTGF基因沉默对肺成纤维细胞增殖及表型转化的影响

近期研究表明,结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)参与了肺成纤维细胞表型转化,与肺纤维化的形成关系密切.因此,本研究应用siRNA表达载体介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,将CTGF-siRNA表达质粒稳定转染人肺成纤维细胞MRC-5,并通过定量PCR、Western-blot、细胞生长曲线及群体倍增时间、免疫细胞化学测定等方法检测基因表达、细胞增殖及表型转化等变化.结果显示,与非特异对照Scrambled-siRNA质粒稳定转染的MRC-5细胞或未转染MRC-5细胞相比,CTGF-siRNA表达质粒稳定转染的MRC-5细胞的CTGF表达明显降低;细胞增殖能力明显降低,群体倍增时间延长,由24.63或25.05 h延长至31.14 h(P＜0.05);TGFβ1刺激24 h后,细胞内α-平滑肌肌动蛋白α-smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅰ型胶原及纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的表达均明显下降.本研究提示,通过RNA干扰使CTGF基因沉默后,在体外可明显抑制MRC-5肺成纤维细胞的增殖、表型转化及细胞外基质的合成,可为基因治疗肺纤维化提供实验依据.     

TGF-β1 shRNA真核表达质粒抑制人肺成纤维细胞TGF-β1的表达

目的:观察构建成功的三个针对人转化生长因子β1(TGF-β1)的小发夹RNA(shRNA)真核表达质粒抑制人肺成纤维细胞TGF-β1的表达.方法:将真核表达载体psiSTRIKE-RNAi1、psiSTRIKE-RNAi2、psiSTRIKE-RNAi3和对应的阴性对照载体经酶切鉴定和测序分析后,以Lipofectamine2000介导转染人肺成纤维细胞,48小时后应用实时荧光定量PCR检测人肺成纤维细胞TGF-β1 mRNA的表达并用ELISA检测细胞上清液中TGF-β1蛋白质的浓度.结果:重组质粒经酶切和DNA测序证实插入片段的碱基序列与预期设计一致.转染组细胞TGF-β1表达受到明显抑制,以psiSTRIKE-RNAi2的抑制效应最为显著(P＜0.01).结论:三个针对TGF-β1shRNA的重组质粒均能抑制TGF-β1在人肺成纤维细胞中的表达.     

RNA干扰敲低GSK-3β对瘢痕疙瘩形成影响的体外研究

目的:利用RNA干扰技术探讨糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts,KFB)的抑制效果。方法:将针对人GSK-3β基因设计合成的3对特异性小干扰RNA(siRNA)分别转染体外培养的人KFB,通过RT-PCR和Western blot筛选出干扰人KFB GSK-3β基因表达的最佳siRNA,进而转染人KFB,并用RT-PCR和Western blot检测GSK-3β及相关蛋白的m RNA和蛋白表达。结果:1434序列具有最佳的GSK-3βm RNA和蛋白抑制效率。转染GSK-3βsiRNA后,KFB的β-catenin、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、p-GSK-3β和Wnt2的蛋白水平下降,KFB活力下降,且随着培养时间的延长,细胞生长受抑制程度增大,细胞倍增时间明显延迟。结论:转染靶向GSK-3β的siRNA可有效降低该基因在KFB内的表达,从而抑制了瘢痕疙瘩生长,具有潜在的治疗前景。     

人Smad7腺病毒表达载体的构建及体外表达

用DNA直接克隆连接的方法,构建人Smad7腺病毒重组质粒,再用293细胞包装。重组腺病毒经扩增、纯化后,感染体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞,用RT-PCR方法检测细胞中人Smad7mRNA的转录。经酶切和PCR鉴定证实了人Smad7重组腺病毒质粒构建成功,RT-PCR证实瘢痕疙瘩细胞中有腺病毒载体介导的Smad7mRNA的过度表达。结果证实构建的人Smad7腺病毒表达载体可在体外细胞中表达,并可进一步应用于瘢痕疙瘩基因治疗方面的研究。     

重组结缔组织生长因子对大鼠血管外膜成纤维细胞表型转化的影响

目的:克隆和构建带大鼠结缔组织生长因子(CTGF)基因真核表达载体pcDNA3.1(+)/CTGF,并观察其对血管外膜成纤维细胞(AF)表型的影响。 方法:以AF总RNA为模板，进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，获得CTGF的cDNA，克隆入pcDNA3.1(+)载体，酶切和测序鉴定重组子。将构建好的pcDNA3.1(+)/CTGF用脂质体法转入AF细胞。Western blotting观察CTGF的表达。同时观察转染pcDNA3.1(+)/CTGF对细胞表型的影响。 结果:成功构建大鼠CTGF基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/CTGF．并证明其能在真核细胞内表达。转染pcDNA3.1(+)/CTGF可以诱导AF表型转化。 结论:重组结缔组织生长因子可诱导大鼠血管外膜成纤维细胞表型转化。     

小分子干扰RNA对新生鼠肺成纤维细胞转化生长因子β1的干预效果及意义

目的 探讨转化生长因子β1(TGF-β1)小分子干扰RNA(siRNA)体外转染新牛鼠肺成纤维细胞的干预效果,研究TGF-β1 siRNA的最佳干预剂量及维持时间. 方法 首先采用化学合成TGF-β1 siRNA对新生鼠肺成纤维细胞进行干预,通过实时定量PCR检测技术筛选出有效干扰片段;然后构建TGF-β1 siRNA腺病毒载体,体外转染新生鼠肺成纤维细胞,半定量PCR检测体外转染后TGF-β1基因的抑制效果,确定其最佳干预剂量及维持时间. 结果 (1)化学合成siRNA抑制TGF-β1基因表达的效果:siRNA剂量为20 pmol,转染后24 h检测抑制效果,第2、3、4条siRNA均有不同效果,其中第3条siRNA抑制效率>70%;(2)TGF-β1 siRNA腺病毒载体转染细胞,观察20、50μl不同剂量转染后24 h抑制情况,并与20μl阴性和空白对照比较,结果显示20、50μl均有明显抑制效果;观察转染后24、48、72 h的抑制效果,比较显示转染后24 h有明显抑制效果,72 h抑制效果最强,说明随着转染时间延长,抑制作用越明显. 结论 TGF-β1 siRNA腺病毒载体体外转染新生鼠肺成纤维细胞对TGF-β1的表达均有明显抑制效果.     

PI3K/CTGF信号通路在TGF-β1诱导A549细胞表达collagen Ⅰ过程中的作用

目的:研究磷脂酰肌醇3-激酶/结缔组织生长因子(PI3K/CTGF)信号通路在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肺腺癌A549细胞表达I型胶原蛋白(collagen I)过程中的分子机制。方法:体外培养A549细胞,予TGF-β1刺激,观察CTGF和collagen I的mRNA和蛋白表达及PI3K信号通路的活化;PI3K抑制剂LY294002预先处理A549细胞后,观察TGF-β1刺激下CTGF和collagen I mRNA和蛋白表达的变化;CTGF特异性si RNA干扰A549细胞中CTGF的表达后,观察TGF-β1刺激下collagen I mRNA和蛋白表达的变化和PI3K信号通路的活化。结果:TGF-β1可以诱导A549细胞中CTGF和collagen I的mRNA和蛋白表达以及PI3K信号通路的活化;PI3K特异性抑制剂LY294002可以部分逆转TGF-β1诱导的A549细胞中CTGF和Collagen I mRNA和蛋白表达的升高。干扰CTGF可以降低TGF-β1诱导的A549细胞collagen I mRNA和蛋白表达,而不影响PI3K信号通路的活化。结论:CTGF是TGF-β1/PI3K信号通路调控的即刻早期反应效应蛋白,参与了TGF-β1诱导的A549细胞中collagen I表达。     

抗结缔组织生长因子特异性小干扰RNA的设计、合成及筛选

目的 设计和合成针对抗肝纤维化关键基因抗结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的特异性小干扰RNA(siRNA),并筛选高效的CTGF siRNA抗肝纤维化序列.方法 参照siRNA设计原则,应用RNA在线设计软件,设计3段RNA干扰候选序列,分别转染正常干细胞株(...     

RhoA/ROCK-I信号通路与增生性瘢痕成纤维细胞结缔组织生长因子的表达

背景:前期实验表明增生性瘢痕中RhoA和ROCK-I基因表达较正常皮肤高,提示RhoA/ROCK-I信号通路可能参与了增生性瘢痕的发生,但其在病理性瘢痕中的作用尚不清楚。目的:研究RhoA/ROCK-I信号通路在增生性瘢痕成纤维细胞结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达调控中的作用。方法:分离培养人增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞,应用转化生长因子β1及Rho激酶的特异抑制剂Y-27632对细胞进行干预实验。采用实时荧光定量PCR及免疫荧光细胞化学方法检测瘢痕成纤维细胞中RhoA,ROCK-I及CTGF mRNA与蛋白的表达。结果与结论:给予转化生长因子β1后,增生性瘢痕成纤维细胞中RhoA,ROCK-I及CTGF mRNA与蛋白表达明显增多(P0.01);而Y-27632能阻碍转化生长因子β1的作用;但单独给予Y-27632并不引起瘢痕成纤维细胞中RhoA,ROCK-I及CTGF的mRNA与蛋白表达改变。说明转化生长因子β1可通过RhoA/ROCK-I信号通路调控CTGF mRNA与蛋白的表达,即RhoA/ROCK-I信号通路参与了瘢痕成纤维细胞CTGF的表达调控,阻断RhoA下游通路是增生性瘢痕治疗靶点之一。     

RNA干扰抑制肝星状细胞CTGF表达对细胞外基质分泌的影响

目的：利用pEGFP质粒载体构建介导结缔组织生长因子(CTGF)短发夹RNA表达的质粒，筛选有效的抑制序列后，研究其对HSC-T6中TGF-β₁、CTGF及细胞外基质表达的影响。方法:1.分别设计3对针对CTGF的有小发夹结构的两条DNA序列及1对非特异对照序列，构建重组体成功后转染HSC-T6，24 h后通过RT-PCR及Western blotting分析HSC-T6 CTGFmRNA及蛋白表达水平，筛选出有效抑制CTGF表达的序列。2.将已构建并筛选出有最高抑制效率的pEGFP-CTGFshRNA转染HSC-T6 ，培养24、48 h后用RT-PCR和/或Western blotting检测各组细胞中TGF-β₁、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因的表达;放免法分析细胞上清液中Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸和层黏连蛋白的含量。结果:将构建成功的3组pEGFP-CTGFshRNA转染肝星状细胞后，筛选出两组能高效抑制CTGF表达的序列; pEGFP-CTGFshRNA能明显抑制HSC-T6 CTGF、Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA及蛋白的表达，降低上清液中Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸和层黏连蛋白的含量(P<0.01或P<0.05)，而对TGF-β₁的基因表达则无影响。结论:pEGFP-CTGFshRNA能高效抑制肝星状细胞中CTGF及细胞外基质的表达;CTGFshRNA介导的RNA干扰有望对慢性肝病所致肝纤维化具有治疗潜力。