志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌多重PCR快速检测体系的建立

目的 建立快速检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR方法.方法 根据志贺菌ipaH基因、沙门菌ipaB基因及霍乱弧菌EPSM基因设计特异性PCR引物,加热煮沸法制备DNA模板,进行PCR扩增及琼脂糖电泳检测.结果 应用所建立的多重PCR方法能分别或同时快速、特异地检测出志贺菌606bp、沙门菌314bp和霍乱弧菌482bp的目的基因.结论 初步建立了灵敏、特异的一步法检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR体系,可用于高危腹泻致病菌的早期快速诊断.     

多重荧光定量PCR法检测食品中的沙门菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌

目的 建立一种可同时检测沙门菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌3种食源性致病菌的多重荧光定量PCR技术。方法 利用沙门菌invA毒力基因、副溶血弧菌gyrase基因和金黄色葡萄球菌Sa442基因的特异性引物、探针,建立多重荧光定量PCR反应体系,完成特异性、敏感性评价,并用该法与国标法进行40份留样食品的检测比较。结果 各对引物、探针均能扩增出目标靶序列,3种检测通道无交叉干扰,对非目标菌无扩增信号,对沙门菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的核酸检测限均达到102拷贝/μl;用多重荧光定量PCR法在40份食品样本中检出3份金黄色葡萄球菌阳性样本,其中1份国标法检测为阴性,其他样本检测结果完全一致。结论 建立了一种针对沙门菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的多重荧光定量PCR检测方法,该方法具有良好的特异性与敏感性,可为食品安全提供技术支持。     

多重PCR同时检测粪便中的志贺菌、侵袭性大肠埃希菌和O－1群霍乱弧菌的致病基因

本研究建立一种快速标本处理和多重聚合酶链反应（ＰＣＲ）诊断方法，在一次ＰＣＲ反应中同时扩增志贺菌、侵袭性大肠埃希菌的侵袭性质粒（ｉａｌ）基因和Ｏ－１群霍乱弧菌的霍乱毒素Ａ亚单位（ｃｔｘＡ）基因。扩增产物经电泳，出现与已知阳性对照细菌条带大小一致的条带即判断为该标本阳性。对一组经常规培养生化鉴定法诊断为霍乱的２６份腹泻病人粪便标本检测后，ＰＣＲ法有２４例检测到ｃｔｘＡ基因，ＰＣＲ阴性的２例为非Ｏ－１群；对另一组５６例粪标本亦进行了检测。本方法具有简便、快速、特异、经济和不须培养等特点，宜于临床应用。     

基因芯片技术直接检测常见腹泻病致病菌的应用研究

目的 探讨基因芯片技术在腹泻病粪便标本常见致病菌检测中的应用.方法 筛选7种常见腹泻病致病菌的特异基因作为检测目的 基因,分别为志贺菌ipaH基因、沙门菌hilA基因、副溶血弧菌tdh基因、空肠弯曲菌FlaA基因、肠出血性大肠埃希菌stxA2基因、肠产毒性大肠埃希菌st基因、霍乱弧菌ctxA2基因.设计相应的引物及探针,制备寡核苷酸芯片.对多重PCR扩增条件进行优化,将PCR扩增产物与带有7种特异探针的基因芯片杂交.检测标准菌株25株,模拟粪标本及临床腹泻病粪便标本64份.结果 经优化多重PCR扩增出7种腹泻病致病菌特异的致病基因片段,与基因芯片特异的探针杂交后.全部产生特异性杂交信号.标准菌株及模拟粪标本检测的阳性和阴性对照符合率均为100%.单一菌株最低检测量为10～100cfu/ml.64份腹泻病粪便标本检测出45份致病菌,其中33份志贺菌、12份副溶血弧菌,检出率为70.3%(45/64).粪培养检出 16份志贺菌,6份副溶血弧菌.检出率为34.4%(22/64),基因芯片法明显优于粪培养方法(P<0.01).结论 该基因芯片直接检测腹泻病致病菌,检出率高,达到了高效的检测目的 ,具有较好的实用性.     

PCR-SSP检测HLA-B27基因

目的 建立序列特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP)检测HLA—B27基因的方法。方法 合成HLA—B27基因和内对照人生长激素基因引物各一对，建立PCR-SSP方法。提取82例患者临床样品基因组DNA，用于PCR扩增。其中20例与微量淋巴细胞毒法(MLCT)比较。结果 PCR检测HLA-B27阳性率为68．3％。20例样本同时行PCR-SSP和MLCT法，PCR阳性14例(70％)，MLCT法阳性11例(55％)，两者一致率为85％。结论 PCR—SSP是一种敏感特异、快速简便的HLA—B27检测方法，优于MLCT法。     

基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139

目的：建立一种同时快速检测肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7和霍乱弧菌O139的基因芯片,并验证该芯片的特异性和敏感性.方法：选择EHEC O157：H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β-葡糖醛酸糖苷酶基因（uidA）;霍乱弧菌O139的肠毒素A亚单位（ctxA）、毒力协调菌毛A亚单位（tcpA）、糖基转移酶（glycosotransferase LPSgt）基因序列分别设计引物和探针,反向引物用荧光素Cy3标记,探针在3′端氨基修饰.在优化的PCR和杂交反应条件下,分别进行三重PCR扩增,产物混合后与芯片进行杂交,产生特异性荧光信号,进一步筛选探针.随后将筛选出的探针制备芯片用于检测临床样本.结果：PCR产物在相应探针处均产生特异性杂交信号,临床样本检测结果表明,此芯片比常规细菌学检测方法灵敏.结论：所研制的同时定性检测EHEC O157：H7和霍乱弧菌O139的基因芯片是特异、灵敏而且快速的,为这两种肠道致病菌感染的快速诊断提供了新的方法.     

实时荧光定量PCR法检测炭疽杆菌

为建立一种简便而特异的炭疽杆菌检测方法用作临床诊断工具，以nXO1持粒上的pag基因及pXO2质粒上的cap基因为靶合成特异引物，用DNA嵌入荧光染料SYBR Green I进行定量PCR扩增，在PCR后进行熔融曲线分析以确定得到的产物是否为目的产物，定量PCR条件优化结果为：引物浓度0．8umol/L,Mg^2 5.0mmol/L。该法检测炭疽的灵敏度达10^3拷贝，并能区分炭疽杆菌与其他蜡样杆菌，表明实时荧光定量PCR技术能够快速准确，特异地对炭疽进行定量分析。     

副溶血弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的 建立一种快速检测副溶血弧菌的实时荧光定量PCR方法.方法 根据副溶血弧菌tdh基因设计合成引物及TaqMan探针,利用阳性质粒和模拟标本建立副溶血弧菌实时荧光定量PCR检测方法.结果 以副溶血弧菌DNA为模板克隆了tdh基因,得到阳性质粒.利用阳性质粒建立了定量PCR方法,得到标准曲线y=-4.9197x+58.72,决定系数(R2)为0.9864.此方法具有很好的特异性,在对15种肠道致病菌的检测中,只有副溶血弧菌基因组DNA的扩增结果为阳性.对粪便和食物模拟标本进行检测,敏感性均为102cfu/μl.此方法重复性较好,对4种浓度(105、104、103、102cfu/μl)的菌液各进行3次检测,结果均为阳性,且Ct值的变异系数＜2%.结论 建立了一种检测副溶血弧菌的荧光定量PCR方法,该法的敏感性和特异均较好,适用于快速、准确地检测食品和粪便中的沙门菌.     

Hendra病毒的实时PCR检测方法的建立

目的：建立针对Hendra病毒的敏感、特异和快速的实时PCR法，为Hendra病的早期诊断提供依据。方法：采用常规PCR法和实时PCR法分别对构建的Hendra病毒全长G基因的重组质粒DNA进行扩增，并比较两种方法的敏感性。结果与结论：应用常规PCR方法可检测到100fg/μl的含Hendra病毒特异序列的重组质粒DNA，而实时PCR法则可检测到0．1fg/μl的DNA，后者的敏感性比常规PCR法的提高了1000倍，该方法不但操作上更加简便、快速，还可避免交叉污染，适于对Hendra病毒特异序列的检测。     

代谢综合征相关新基因MSRG实时荧光PCR检测方法的建立

目的 建立测定MSRG mRNA表达量的实时荧光定量PCR检测方法,为新基因的功能研究奠定基础.方法 根据MSRG cDNA序列设计荧光PCR适用的引物和探针,构建质粒标准品,建立标准曲线用于荧光PCR相对定量,检测荧光PCR方法的灵敏性、特异性和重复性.荧光PCR检测不同浓度葡萄糖[5 6mmol/L(G5.6)、22mmol/L(G22)、33.3mmol/L(G33.3)]刺激人肝癌细胞株HepG2细胞MSRG的表达并与半定量RT-PCR方法进行比较.结果 建立了MSRG mRNA表达的实时荧光PCR检测方法.荧光PCR检测显示G33.3、G22和G5.6组HepG2细胞MSRG表达均有显著差异,半定量RT-PCR方法检测G33.3组MSRG表达显著增加,但不能检测出G22和G5.6组间有差异.结论 本实验建立的MSRG mRNA表达实时荧光PCR检测方法灵敏性、特异性和重复性较好,为MSRG功能的研究提供了一种重要手段.     

聚合酶链反应法与荧光免疫法检测沙眼衣原体的比较研究

为了评价聚合酶链反应法（ＰＣＲ）对泌尿生殖道标本中沙眼衣原体的检测结果，每份临床标本进行了ＰＣＲ法和荧光免疫法（ＤＦＡ）平行检测比较。检测临床标本９３例，ＰＣＲ法阳性率为２５．８％，ＤＦＡ法的阳性率为１７．２％（Ｐ＞０．０５）。结果说明ＰＣＲ是一高度特异和敏感的检测方法。     

实时荧光定量PCR检测痰中结核分枝杆菌临床评价

目的评价实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测临床痰标本中结核分枝杆菌诊断肺结核的意义。方法收集我院2011年9月-2013年8月期间收治的126例确诊为肺结核的患者和80例非结核性呼吸道疾病患者的痰液标本,分别采用漂浮集菌涂片镜检、BACT／ALERT3D快速培养法和FQ-PCR法检测痰中结核杆菌,分析检出结果。结果126例确诊为肺结核患者的痰标本中对结核分枝菌杆的检验以FQ-PCR检出率最高达到53．2％,高于快速培养法的46．8％（P〈0．05）和痰漂浮集菌涂片镜检法的32．5％（P〈0．01）。FQ-PCR与痰培养法总体一致性为95．1％,K=0．88。对痰涂片阳性标本,两者敏感性差异无统计学意义（P〉0．05）;对痰涂片阴性标本,FQ-PCR敏感性明显高于快速培养法（P〈0．01）。结论FQ-PCR具有快速、敏感、特异、可定量和自动化的优点,值得应用于痰中结核杆菌的检测及肺结核的诊断。     

实时荧光定量PCR检测莫氏立克次体

目的 采用TaqMan-MGB探针建立检测莫氏立克次体的实时荧光定量PCR.方法 依据莫氏立克次体外膜蛋白B基因(ompB)设计引物和探针,以克隆的ompB作模板建立实时荧光定量PCR方法.结果 建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.995);该方法能检出＜10拷贝的莫氏立克次体DNA,敏感性为普通PCR的1 000倍.用该方法检测莫氏立克次体DNA,结果为阳性,但是检测其他相关细菌DNA的结果均为阴性.用该方法检测莫氏立克次体感染豚鼠血标本,50%样本检测为阳性,而普通PCR检测结果均为阴性.结论 该实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,适合于快速检测样本中微量莫氏立克次体DNA,可用于临床实验室快速确诊地方性斑疹伤寒.     

应用一步和套式PCR法检测SARS患者标本中的SARS病毒核酸序列

目的：建立敏感、特异和快速的针对SARS病毒的RT-PCR方法，为SARS的早期诊断及防治提供依据。方法：采用一步和套式PCR法对SARS患者不同标本中的SARS病毒RNA进行扩增及序列测定。结果与结论：应用外引物和内引物可分别扩增出约380bp和150bp的单一条带，其大小与预期的相一致。应用套式PCR可使检测敏感性从l0-6提高到lO-15。采用这种方法从SARS患者粪便、痰、鼻咽拭子和血液标本中均可扩增出与预期大小一致的条带，且测序结果显示该扩增片段为SARS病毒的特异序列，表明本研究建立的RT-PCR方法敏感、特异，可用于SARS的快速检测.．     

可视化基因芯片技术检测肠道病毒方法的建立

目的建立一种能同时检测10种肠道病毒的可视化基因芯片法。方法根据公开发表的10种常见肠道病毒的序列,设计病毒引物和探针,制备肠道病毒检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增样品中的病毒靶片段,标记产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、可视化显色后进行结果分析。在优化的RT-PCR体系、杂交反应和可视化检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏度和重复性。结果本研究共筛选出2对通用引物、3对特异性引物和1条肠道病毒属通用探针、9条特异性检测探针。该芯片具有较好的特异性和重复性,可检测出不低于102拷贝/μl的体外转录RNA。30例临床标本的芯片检测结果与荧光PCR法一致。结论本研究所建立的方法具有高通量、高特异性、高灵敏度等特点,因此在临床上具有潜在的应用前景,可以为肠道病毒诊断提供实验室依据。     

可视化基因芯片技术检测肠道病毒方法的建立

目的建立一种能同时检测10种肠道病毒的可视化基因芯片法。方法根据公开发表的10种常见肠道病毒的序列,设计病毒引物和探针,制备肠道病毒检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增样品中的病毒靶片段,标记产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、可视化显色后进行结果分析。在优化的RT-PCR体系、杂交反应和可视化检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏度和重复性。结果本研究共筛选出2对通用引物、3对特异性引物和1条肠道病毒属通用探针、9条特异性检测探针。该芯片具有较好的特异性和重复性,可检测出不低于102拷贝/μl的体外转录RNA。30例临床标本的芯片检测结果与荧光PCR法一致。结论本研究所建立的方法具有高通量、高特异性、高灵敏度等特点,因此在临床上具有潜在的应用前景,可以为肠道病毒诊断提供实验室依据。     

西部马脑炎病毒基因组序列的RT-PCR检测

目的 :建立敏感、特异的西部马脑炎 (westernequineencephalitis,WEE)病毒RT_PCR检测方法。方法 :首先采用逆转录法将病毒基因组RNA逆转录为cDNA ,然后以此cDNA为模板 ,进行PCR扩增。并对PCR扩增过程中的模板量、循环数、Mg2 浓度、退火温度和延伸时间等条件进行优化 ,以提高检测的特异性和敏感性。结果 :采用经优化的条件进行PCR扩增获得了约 35 0bp的单一DNA片段 ,其大小与预期的相一致 ,且可自 0 .1TCID50 的病毒液中检测出WEE病毒基因组序列。结论 :所建立的RT_PCR方法可自病毒感染的小鼠脑组织和传代细胞中检测WEE病毒的基因组RNA。